Մոլեկուլային կենսաֆիզիկայի լաբորատոր աշխատանքների ուսումնամեթոդական ձեռնարկ

Պ.Հ.

Վարդնանյան, Ա.Պ. Անտոնյան, Մ. Ա. Փարսադանյան

ՄՈԼԵԿՈՒԼԱՅԻՆ

ՁԵՌՆԱՐԿ

ԱՇԽԱԾԱՆՔՆԵՐԻ

ԿԵՆՍԱՖԻՋԻԿԱՅԻ

ԼԱԲՈՐԱՏՈՐ

ՈՒՍՈՒՄՆԱՄԵԹՈԴԱԿԱՆԿԱՆ

ԵՐԵՎԱՆԻ ՊԵՏԱԿԱՆ ՀԱՄԱԼՍԱՐԱՆ

Պ.Հ.ՎԱՐԴԵՎԱՆՅԱՆ, Ա.Պ.ԱՆՏՈՆՅԱՆ,

Մ.Ա. ՓԱՐՍԱԴԱՆՅԱՆ

ՄՈԼԵԿՈՒԼԱՅԻՆ ԿԵՆՍԱՖԻԶԻԿԱՅԻ

ԼԱԲՈՐԱՏՈՐ ԱՇԽԱՏԱՆՔՆԵՐԻ

ՈՒՍՈՒՄՆԱՄԵԹՈԴԱԿԱՆ ՁԵՌՆԱՐԿ

ՄԱՍ 2

ՄԱԿՐՈՄՈԼԵԿՈՒԼՆԵՐԻ ՀԵՏ ԼԻԳԱՆԴՆԵՐԻ

ԿՈՄՊԼԵՔՍՆԵՐԻ pK-ի ՈՐՈՇՈՒՄԸ: ԹԹՎԱՀԻՄՆԱՅԻՆ

ՀԱՎԱՍԱՐԱԿՇՌՈՒԹՅԱՆ ՎԵՐԼՈՒԾՈՒԹՅՈՒՆԸ

ՍՊԵԿՏՐԱՖՈՏՈՄԵՏՐԻԱՅԻ ՄԵԹՈԴՈՎ

ԵՐԵՎԱՆ

ԵՊՀ ՀՐԱՏԱՐԱԿՉՈՒԹՅՈՒՆ

ՀՏԴ 577.32(072) ԳՄԴ 28.071 Վ

Տպագրության է երաշխավորել ԵՊՀ կենսաֆիզիկայի ամբիոնը Գրախոսներ՝ Է. Ս. ԳԵՎՈՐԳՅԱՆ – ՀՀ ԳԱԱ թղթակից անդամ, կենսաբանական գիտությունների դոկտոր, պրոֆեսոր Ե. Բ. ԴԱԼՅԱՆ – ֆիզիկամաթեմատիկական գիտությունների դոկտոր, պրոֆեսոր Հեղինակներ` Պ.Հ.ՎԱՐԴԵՎԱՆՅԱՆ - կենսաբանական գիտությունների դոկտոր, պրոֆեսոր Ա.Պ.ԱՆՏՈՆՅԱՆ - կենսաբանական գիտությունների թեկնածու, դոցենտ Մ.Ա.ՓԱՐՍԱԴԱՆՅԱՆ - կենսաբանական գիտությունների թեկնածու, դոցենտ

ՎԱՐԴԵՎԱՆՅԱՆ Պ.Հ.

Վ 304 Մոլեկուլային կենսաֆիզիկայի լաբորատոր աշխատանքների ուսումնամեթոդական ձեռնարկ/ Պ.Հ.Վարդևանյան, Ա.Պ. Անտոնյան, Մ.Ա. Փարսադանյան: Մաս 2 (Մակրոմոլեկուլների հետ լիգանդների կոմպլեքսների pk-ի որոշումը: Թթվահիմնային հավասարակշռության վերլուծությունը սպեկտրաֆոտոմետրիայի մեթոդով):- Եր., ԵՊՀ հրատ., 2014, - 64 էջ: Ձեռնարկը նվիրված է կենսաբանական հետազոտություններում, մասնավորապես, կենսաբանական ակտիվությամբ օժտված մոլեկուլների և մակրոմոլեկուլների թթվա-հիմնային հավասարակշռության, pK-ի որոշման մեջ սեպեկտրաֆոտոմետրիայի մեթոդի կիրառությանը: Այդ մեթոդը հնարավորություն է ընձեռում ուսումնասիրելու կենսաբանական համակարգերի կառուցվածքը տարբեր մակարդակներում, ինչպես նաև դրանցում տեղի ունեցող տարաբնույթ գործընթացները: Ձեռնարկը պարունակում է «Մոլեկուլային կենսաֆիզիկա» ծրագրով նախատեսված դասընթացի մեջ ներառված մակրոմոլեկուլների կառուցվածքի և գործառության հետազոտմանը վերաբերող մի շարք հարցեր: ՀՏԴ 577.32(072) ԳՄԴ 28.071 ISBN 978-5-8084-1852-3

© ԵՊՀ հրատարակչություն, 2014 © Հեղ. խումբ, 2014

ԲՈՎԱՆԴԱԿՈՒԹՅՈՒՆ

1. ՍՊԵԿՏՐԱՍԿՈՊԻԱՅԻ ՀԻՄՆԱԿԱՆ ՀԱՍԿԱՑՈՒԹՅՈՒՆՆԵՐԸ....... 5

2. ՍՊԵԿՏՐԱՍԿՈՊԻԱՅԻ ԳԼԽԱՎՈՐ ՕՐԵՆՔԸ .................................... 11

3. ՍՊԵԿՏՐԱՖՈՏՈՄԵՏՐԵՐԻ ԱՇԽԱՏԱՆՔԻ ՍԿԶԲՈՒՆՔԸ ................ 14

4. ՍՊԵԿՏՐԱՍԿՈՊԻԿ ՓՈՐՁԵՐԻ

ԱՌԱՆՁՆԱՀԱՏԿՈՒԹՅՈՒՆՆԵՐԸ ......................................................... 19

5. ԲԱԶՄԱԲԱՂԱԴՐԻՉ ՀԱՄԱԿԱՐԳԵՐԻ ՍՊԵԿՏՐՆԵՐԻ

ՎԵՐԼՈՒԾՈՒԹՅՈՒՆԸ ............................................................................. 23

6. ԴԻՖԵՐԵՆՑԻԱԼ ՄԵԹՈԴԸ ԿԼԱՆՄԱՆ

ՍՊԵԿՏՐԱՍԿՈՊԻԱՅՈՒՄ ...................................................................... 25

6.1. ԴԻՖԵՐԵՆՑԻԱԼ ԿԼԱՆՄԱՆ ՍՊԵԿՏՐԱՍԿՈՊԻԱՅԻ ՄԵԹՈԴԻ

ՀԻՄՈՒՆՔՆԵՐԸ......................................................................................... 25

6.2. ԴԻՖԵՐԵՆՑԻԱԼ ՍՊԵԿՏՐԱՖՈՏՈՄԵՏՐԵՐԸ և ԴՐԱՆՑ

ԿԻՐԱՌՈՒԹՅՈՒՆԸ ԿԵՆՍԱԲԱՆԱԿԱՆ ՀԵՏԱԶՈՏՈՒԹՅՈՒՆՆԵՐՈՒՄ

..................................................................................................................... 32

7. ԹՈՒՅԼ ԹԹՈՒՆԵՐԻ ԴԻՍՈՑՄԱՆ ԱՍՏԻՃԱՆԻ

ՈՐՈՇՈՒՄԸ ԹԹՎԱՀԻՄՆԱՅԻՆ ՀԱՎԱՍԱՐԱԿՇՌՈՒԹՅԱՆ

ՎԵՐԼՈՒԾՈՒԹՅՈՒՆԸ ............................................................................ 39

7.1. ԴԻՆԻՏՐՈՖԵՆՈԼԻ ԴԻՍՈՑՄԱՆ ՀԱՍՏԱՏՈՒՆԻ ՈՐՈՇՈՒՄԸ

ՍՊԵԿՏՐԱՖՈՏՈՄԵՏՐԻԿ ՄԵԹՈԴՈՎ .................................................. 43

7.2. ՄԵԹԻԼԵՆ ՆԱՐՆՋԱԳՈՒՅՆԻ ԴԻՍՈՑՄԱՆ ՀԱՍՏԱՏՈՒՆԻ

ՈՐՈՇՈՒՄԸ .............................................................................................. 47

7.3. ԴՆԹ-ԼԻԳԱՆԴ ԿՈՄՊԼԵՔՍՆԵՐԻ pH ՏԻՏՐՈՒՄԸ:

pKa-Ի ՈՐՈՇՈՒՄԸ ..................................................................................... 52

7.4. ՍՊԻՏԱԿՈՒՑՆԵՐԻ pH-ՏԻՏՐՄԱՆ

ՈՒՍՈՒՄՆԱՍԻՐՈՒԹՅՈՒՆԸ ................................................................ 58 ԳՐԱԿԱՆՈՒԹՅԱՆ ՑԱՆԿ ........................................................................ 62

1. ՍՊԵԿՏՐԱՍԿՈՊԻԱՅԻ ՀԻՄՆԱԿԱՆ ՀԱՍԿԱՑՈՒԹՅՈՒՆՆԵՐԸ

Սպեկտրասկոպիան (spectrum – լատիներեն՝ պատկերացում, կերպար, skopeo – հունարեն՝ դիտում) ունի լայն կիրառություն: Վերլուծական նպատակներով այն կիրառվում է քիմիական միացությունների նույնականացման, ինչպես նաև լուծույթներում և խառնուրդներում նյութերի կոնցենտրացիաները որոշելու համար: Օպտիկական սպեկտըրասկոպիայի կիրառությունը թույլ է տալիս ուսումնասիրելու մոլեկուլների կառուցվածքը և էներգետիկ հատկությունները, տարբեր, այդ թվում, թթվահիմնային պրոցեսների հավասարակշռությունը, քիմիական ռեակցիաների կինետիկան և այլն: Սպեկտրասկոպիկ հետազոտությունների օբյեկտ կարող են հանդիսանալ կամայական ագրեգատային վիճակներում գտնվող միացությունները: Սպեկտրասկոպիայի հիմնադիրներից է Իսահակ Նյուտոնը: Ուսումնասիրելով լույսի ճառագայթի անցումը թափանցիկ պրիզմայի միջով՝ նա հայտնաբերեց, որ սպիտակ թվացող լույսը կարելի է տրոհել կարմիր, նարնջագույն, դեղին, կանաչ, երկնագույն, կապույտ, մանուշակագույն բաղադրիչների և, ըստ էության, նա բացահայտեց լույսի դիսպերսիան (1672թ.): Հետագայում հաստատվեց նաև այն, որ տեսանելի լույսի տիրույթից դուրս գոյություն ունի ճառագայթում, որն անտեսանելի է մարդու աչքի համար: 1800թ. Ուիլյամ Հերշելը, սովորական ջերմաչափերի միջոցով ուսումնասիրելով տեսանելի լույսի սպեկտըրը, բացահայտեց, որ տեսանելի տիրույթի կարմիր ճառագայթման սահմանից այն կողմ ջերմաչափերը տաքանում են այնպիսի ճառագայթման շնորհիվ, որը նա անվանեց “calorific rays”: Ներկայումս ճառագայթման այդ տիրույթն անվանում են ինֆրակարմիր: 1802թ. Իոհան Ռիտտերը կրկնեց Հերշելի փորձերը՝ կիրառելով ոչ թե ջերմաչափ, այլ արծաթի քլորիդ, որը լույսի ներգործությամբ տրոհվում է: Պարզվեց, որ AgCl-ի տրոհման արագությունն աճում է սպեկտրի կարմիր եզրից դեպի մանուշակագույնը և առավելագույնն է դառնում տեսանելի լույսի սպեկտրի տիրույթից դուրս: Այսպես բացահայտվել են ուլտրամանու-

շակագույն ճառագայթները: Այս փորձերը սկիզբ դրեցին լայնածավալ սպեկտրասկոպիկ հետազոտությունների: Ժամանակակից սպեկտրասկոպիան հիմնված է քվանտային տեսության պատկերացումների վրա, համաձայն որոնց ցանկացած ատոմային կամ մոլեկուլային համակարգ կայուն է միայն որոշակի ստացիոնար վիճակներում: Համակարգի էներգիայի ցանկացած փոփոխություններ պայմանավորված են մի վիճակից մյուսը թռիչքաձև անցմամբ: Նման անցումները կարող են լինել ինչպես ճառագայթմամբ, այնպես էլ առանց ճառագայթման: Ըստ էության այն անցումները, որոնց դեպքում նյութը կլանում կամ արձակում է էլեկտրամագնիսական ճառագայթներ, հանդիսանում են սպեկտրասկոպիայի հետազոտության օբյեկտ: Էլեկտրամագնիսական էներգիայի քվանտի կլանումը հանգեցնում է նրան, որ համակարգը (ատոմ, մոլեկուլ, իոն, ռադիկալ և այլն) հիմնական վիճակից անցնում է գրգռված վիճակի․

A  h  A* Կլանված էներգիայի քվանտի մեծությունը որոշվում է որպես համակարգի վերջնական և սկզբնական վիճակների էներգիաների տարբերություն` ըստ Պլանկի բանաձևի․

h 

hc  E k  Ei   E 

(1)

ուստի ճառագայթումը կարելի է բնութագրել ինչպես էներգիայով (կՋ/մոլ) և ինտենսիվությամբ (Վտ/մ2), այնպես էլ ալիքային պարամետրերով՝ ալիքի երկարությամբ  (նմ), հաճախությամբ  (Հց), ալիքային թվով υ (սմ-1): Սպեկտրալ հատկություններից կախված էլեկտրամագնիսական ալիքների տիրույթների դասակարգումը բերված է աղյուսակ 1ում: Կլանման սպեկտրասկոպիան ուսումնասիրում է քիմիական միացությունների կլանման ունակությունը: Կլանման սպեկտրները ստացվում են հետազոտվող նյութի որոշակի հաստությամբ շերտի միջով էլեկտրամագնիսական ճառագայթման բաց թողման դեպքում:

Յուրաքանչյուր նյութ բնութագրվում է խիստ անհատական կլանման սպեկտրով: Աղյուսակ 1 Էլեկտրամագնիսական ալիքների սպեկտրալ տիրույթների դասակարգումը Սպեկտրալ բնութագրիչները Սպեկտրների տիրույթը , (նմ)

, (սմ-1)

10-200

5104-106

Ուլտրամանուշակագույն

200-400

2,5104-5104

Տեսանելի

400-750

1,3104-2,5104

Մոտակա ինֆրակարմիր

750-2,5104

400-1,3104

Հեռու ինֆրակարմիր

2,5104-106

10-400

Վակուումային Ուլտրամանուշակագույն

Կլանումը սպեկտրի տեսանելի և ուլտրամանուշակագույն տիրույթներում պայմանավորված է մոլեկուլների անցմամբ էլեկտրոնային-գրգռված վիճակի, որն ուղեկցվում է նաև տատանողական և պտտական ենթավիճակների փոփոխություններով, ուստի հասարակ մոլեկուլների էլեկտրոնային սպեկտրները գազային փուլում մեծ քանակությամբ պարունակում են տատանողական-պտտական կառուցվածքի նեղ շերտեր: Գազի ճնշման մեծացման կամ խտացված վիճակի անցման դեպքում դրանց քանակն ավելանում է, իսկ գծերը վերադըրվում են և առաջանում են լայն շերտեր, որոնցից յուրաքանչյուրը բնութագրվում է առավելագույն կլանմանը համապատասխանող ալիքի երկարության՝ λmax-ի որոշակի արժեքով: Ավանդաբար օրգանական մոլեկուլների էլեկտրոնային կառուցվածքի ուսումնասիրության ժամանակ տարբերակվում են մոլեկուլային ուղեծրերի հետևյալ տիպերը՝ σ և σ*, π և π*, ինչպես նաև ո (չկապող): Առաջինները գոյություն ունեն ցանկացած օրգանական մոլեկուլում, երկրորդները՝ հիմնականում բազմակի կապերով համակարգերում,

իսկ երրորդները՝ էլեկտրոնների չընդհանրացված զույգեր պարունակող հետերոատոմներ ունեցող մոլեկուլներում (O, N, S, Cl, Br և այլն): Օպտիկական գրգռման դեպքում հնարավոր են հետևյալ տիպի անցումներ՝ σσ*, ππ*, nσ*, nπ*: σσ* և nσ* անցումները հիմնականում ընկած են վակումային ուլտրամանուշակագույն տիրույթում և բնորոշ են սահմանային ածխաջրերին և դրանց հալոգենային ածանցյալներին, ինչպես նաև կարբոնիլային միացություններին: Օրինակ, էթանի դեպքում λmax=135նմ, ացետոնի դեպքում՝ λmax=190նմ: σσ* անցումների դեպում կլանման սպեկտրները հիմնականում ունեն բարձր ինտենսիվություն, մինչդեռ nσ* անցումների դեպքում ինտենսիվությունը համեմատաբար փոքր է: Չհագեցած միացությունների մոլեկուլներում տեղի են ունենում ππ*, nπ* անցումներ, որոնք ընկած են մոտակա ուլտրամանուշակագույն և տեսանելի տիրույթներում: Ավելի երկարալիք տիրույթի կլանման սպեկտրներ ունեն այն մոլեկուլները, որոնցում առկա են զուգորդված կապերի երկարաձգված համակարգեր կամ արոմատիկ օղակներ: Մոլեկուլում միմյանց հետ փոխազդող բազմաթիվ π-էլեկտրոնների առկայությունը մեծացնում է մոլեկուլի էլեկտրոնային ամպի հնարավոր կոնֆիգուրացիաների թիվը, ինչն իր հերթին նվազեցնում է նրա հիմնական վիճակի էներգիան և գրգռված վիճակի անցման համար անհրաժեշտ քվանտի էներգիայի մեծությունը: Օրինակ, արոմատիկ մոլեկուլների շարքում՝ բենզոլ, նավթալին, անտրացեն, կլանման շերտի մաքսիմումը շեղվում է դեպի երկարալիք տիրույթ (λmax=268, 311, 476նմ համապատասխանաբար): Հիմնականում ππ* թույլատրված անցումների համար պատասխանատու շերտերն ունեն կլանման մեծ ինտենսիվություն, մինչդեռ nσ* անցումների ինտենսիվությունը մեծ չէ: Լիցքի տեղափոխման հետ կապված անցումները դասվում են առանձին խմբի: Եթե օպտիկական գրգռումն ուղեկցվում է էլեկտրոնային խտության վերաբաշխումով երկու քիչ թե շատ տարանջատված էլեկտրոնային համակարգերի միջև տվյալ մոլեկուլում, ապա այսպիսի անցումը կոչվում է լիցքի ներմոլեկուլային տեղափոխություն: Լիցքի

ներմոլեկուլային տեղափոխությամբ պայմանավորված կլանման երկարալիք շերտ ունեցող մոլեկուլի տիպիկ օրինակ է նիտրոբենզոլը (որտեղ էլեկտրոնների դոնոր է ֆենիլային օղակը, իսկ ակցեպտոր է նիտրո խումբը): Եթե լիցքի տեղափոխությունն իրականանում է երկու տարբեր մոլեկուլների միջև, ապա այս դեպքում տեղի ունի լիցքի միջմոլեկուլային տեղափոխություն: Այս դեպքում ի հայտ է գալիս կլանման շերտ, որը բացակայում է այդ միացությունների սեփական կլանման սպեկտրներում: Շատ դեպքերում այդ պրոցեսին կարող է մասնակցել նաև լուծիչի մոլեկուլը: Տիպիկ օրինակ է I- մասնիկը, որի ջրային լուծույթում դիտվող կլանման շերտը υ=44200սմ-1 դեպքում պայմանավորված է էլեկտրոնի տեղափոխությամբ ջրի մոլեկուլի վրա: Ատոմների խմբերը, որոնք ցուցաբերում են կլանում, կոչվում են քրոմոֆոր (գույնի կրիչներ): Սովորաբար դրանք բևեռային կամ չհագեցած կապերով խմբեր են: Օրինակ՝ -CC–; C=O; -C6H5; -N=N-; NO2, որոնց համապատասխանող max-ներն են՝ 180; 280; 270; 370; 270 նմ: Եթե երկու քրոմոֆորներ իրարից բաժանված են բավականին երկար ածխաջրածնային շղթայով, ապա դրանց կլանումը գործնականում կլինի գումարվելի (ադիտիվ), մինչդեռ մոտ տեղաբաշխման դեպքում դրանք կարող են զուգորդման միջոցով ազդել մեկը մյուսի վրա` էականորեն փոխելով մոլեկուլի սպեկտրը: Որոշ տեղակալիչներ, չլինելով քրոմոֆորներ, կարող են մեծացնել միացության կլանումը: Այսպիսի խմբերը կոչվում են աուքսոքրոմային (գունաուժեղացուցիչներ): Դրանց թվին են պատկանում, օրինակ, ամինո-, հիդրօքսի- և մեթօքսի- խմբերը: Արտաքին աղբյուրից ընկնող լույսի կլանման ունակությունը միացության կողմից բնութագրվում է օպտիկական խտությամբ: Սովորաբար օպտիկական խտությունը նշանակվում է A-ով (ռուսալեզու գրականության մեջ` D-ով): Ըստ սահմանման, օպտիկական խտությունը միացության անթափանցելիության չափն է, որը հավասար է միացության շերտի վրա ընկնող լույսի ինտենսիվության I0-ի և միացության միջով անցնող և կլանման ու ցրման արդյունքում դուրս եկող լույսի ինտեսիվության՝ I-ի հարաբերության տասնորդական լոգարիթմին:

 I0    I 

A  lg 

(2)

A-ի կախվածությունը -ից կամ υ-ից կոչվում է տվյալ միացության կլանման սպեկտր: Միացության միջով անցնելու արդյունքում լույսի սպեկտրային կազմը փոխվում է, ինչը սովորաբար ընկալում է որպես նմուշի գույն (աղ. 2): Աղյուսակ 2 Կլանվող լույսի և միացության գույնի համապատասխանությունը Կլանվող լույսի

Կլանվող լույսը

Անցնող լույսի գույնը

400-440

Մանուշակագույն

Դեղնա-կանաչ

440-480

Կապույտ

Դեղին

480-490

Կանաչա-երկնագույն

Նարնջագույն

490-500

Երկնագույնա-կանաչ

Կարմիր

500-560

Կանաչ

Ծիրանագույն

560-580

Դեղին-կանաչ

Մանուշակագույն

580-595

Դեղին

Կապույտ

595-610

Նարնջագույն

Կանաչ-երկնագույն

610-680

Կարմիր

Երկնագույն-կանաչ

680-750

Ծիրանագույն

Կանաչ

միջակայքը, նմ

2. ՍՊԵԿՏՐԱՍԿՈՊԻԱՅԻ ԳԼԽԱՎՈՐ ՕՐԵՆՔԸ

Սպեկտրասկոպիայում բոլոր քանակական չափումների հիմքում ընկած է Բուգեր-Լամբերտ-Բերի օրենքը (հապավումը` ԲԼԲ օրենք), որը կապ է հաստատում միացության կողմից լույս կլանելու ունակության և տվյալ միացության կոնցենտրացիայի միջև: Բուգեր-Լամբերտ-Բերի օրենքը կարելի է դուրս բերել՝ ելնելով հետևյալ պատկերացումներից. Դիտարկենք  ալիքի երկարությամբ մոնոքրոմատիկ լույսի անցումը հետազոտվող միացությամբ կյուվետի միջով: Եթե այն կլանում է տվյալ ալիքի երկարությամբ լույսը, ապա կյուվետից դուրս եկող լուսային հոսքի ինտենսիվությունը՝ Iλ, ավելի փոքր կլինի կյուվետի վրա ընկնող լույսի I0 ինտենսիվությունից: Լույսի կլանումը dIλ տվյալ միացության dx հաստությամբ անվերջ բարակ շերտում համեմատական է այդ շերտի վրա ընկնող լուսային հոսքին` Iλ-ին և լույսը կլանող մասնիկների C մոլային կոնցենտրացիային: Իրոք, լույսի յուրաքանչյուր քվանտ, անցնելով լուծույթի dx շերտի միջով, իր ճանապարհին հանդիպում է կլանող մասնիկների որոշակի քանակության, որը կարելի է հաշվարկել որպես (NA·σ·C·dx), որտեղ NA-ն Ավոգադրոյի թիվն է, σ-ն` այն շերտի արդյունավետ կտրվածքն է, որում քվանտը բախվում է միացության մասնիկի հետ: Այդ շերտում քվանտների հոսքի լրիվ թուլացումը (-dIλ) կորոշվի հոսքի Iλ ելքային ինտենսիվությամբ` բազմապատկած մեկ քվանտի կլանման հավանականության (NA·σ·C·dx) հետ: ε՛-ով նշանակելով NA·σ համեմատականության գործակիցը՝ կստանանք dx շերտի կողմից լույսի կլանումը որոշող արտահայտությունը.

dI    'I   C  dx ։

(3)

Երբ դիտարկվող շերտի հաստությունը փոխվում է 0-ից մինչև l, որտեղ l-ը միացության հաստությունն է կյուվետում, լույսի ինտենսիվությունը կնվազի I0-ից մինչև I: Այդ սահմաններում ինտեգրումը՝

I

 I0

l dI    'C  dx I

(4)

կբերի միացության կողմից լույսի թուլացումը նկարագրող կախվածությանը.

I  I 0  e   'C l ։

(5)

Միացության կողմից լույսի թուլացումը նկարագրող կախվածությունը կարելի է ներկայացնել լոգարիթմական տեսքով.

 I0       C  l  A , I 

lg

(6)

որտեղ I0-ն և I-ն նմուշի վրա ընկնող և նմուշով անցնող լույսի ինտենսիվություններն են, C-ն` մոլային կոնցենտրացիան, l-ը` օպտիկական ճանապարհի երկարությունը, ε-ն` համեմատականության գործակիցը, որը կոչվում է կլանման մոլային գործակից կամ միացության էքստինկցիայի գործակից: Այսպիսով, օպտիկական խտությունը գծայնորեն կապված է կոնցենտրացիայի հետ հետևյալ առնչությամբ.

A     C  l

(7)

Սպեկտրասկոպիայում ընդունված է կյուվետի l երկարությունը չափել սմ-երով, միացության կոնցենտրացիան` մոլ/լ-երով, իսկ օպտիկական խտությունը անչափելի մեծություն է, ուստի էքստինկցիայի գործակցի չափման միավորը կլինի լ·մոլ-1·սմ-1: Էքստինկցիայի գործակցի հակադարձ մեծությունը հավասար է 1.0մոլ/լ կոնցենտրացիայով լուծույթի շերտի հաստությանը, որում լույսի ինտենսիվությունը նվազում է 10 անգամ: (3) և (5) բանաձևերը իրենցից ներկայացնում են ԲԼԲ օրենքի դիֆերենցիալ և ինտեգրալ ձևակերպումները: Միացության կողմից լույսի կլանման պրոցեսի համար բնութագըրական է գումարելիությունը. եթե նմուշում առկա են մի քանի կլանող ձևեր, ապա տվյալ ալիքի երկարության դեպքում օպտիկական խտությունը կորոշվի դրանցից յուրաքանչյուրի կլանումների գումարով.

A  l    i    Ci

(8)

i

ուստի լուծույթների ուսումնասիրության ժամանակ անհրաժեշտ է հաշվի առնել, որ լուսային հոսքը կարող է կլանվել նաև լուծիչի մոլեկուլների կողմից, որոնց կոնցենտրացիան սովորաբար մի քանի կարգով գերազանցում է լուծված միացության կոնցենտրացիան: Այսպիսով, լուծույթում որևէ միացության կլանման սպեկտրը ստանալու համար անհրաժեշտ պայման է տվյալ սպեկտրալ հատվածում կիրառվող S i լուծիչի առավելագույն թափանցելիությունը՝      : Ինչպես երևում է աղյուսակ 3-ից, ավելի հաճախ կիրառվող լուծիչները սպեկտրի տեսանելի և մոտակա ուլտրամանուշակագույն տիրույթներում չունեն կլանում: Աղյուսակ 3 Լուծիչների կողմից ՈւՄ ճառագայթման բաց թողման սահմանը Լուծիչ

սկզբ., նմ

Լուծիչ

սկզբ., նմ

Ացետոն

Տոլուոլ

Ացետոնիտրիլ

Քացախաթթու

Բենզոլ

4-քլորային ածխածին

Ջուր

Ցիկլոհեքսան

ն-Հեքսան

Քլորոֆորմ

Մեթանոլ

Էթանոլ

Ծծմբական թթու

3. ՍՊԵԿՏՐԱՖՈՏՈՄԵՏՐԵՐԻ ԱՇԽԱՏԱՆՔԻ ՍԿԶԲՈՒՆՔԸ

Դիտարկենք միաճառագայթ սպեկտրաֆոտոմետրի կառուցվածքը (նկ. 1):

Նկ. 1. Միաճառագայթ սպեկտրաֆոտոմետրի կառուցվածքային գծապատկերը:

Լույսի աղբյուրը (1) տեղադրված է էլիպտիկ հայելու (2) կիզակետում: Որպես կանոն, տեսանելի լույսի աղբյուր է վոլֆրամային, հալոգենային լամպը, որը լույսի հաստատուն հոսք է տալիս 360-950նմ միջակայքում: Որպես ՈւՄ ճառագայթման աղբյուր ծառայում է ջրածնական կամ դեյտերիումային լամպը՝ անընդհատ սպեկտրով 200-360նմ տիրույթում: Լույսի փունջը հարթ ապակու (3) միջոցով շրջվում է և ոսպնյակի (4) միջոցով ընկնում է մոնոքրոմատորի (6) ելքային ճեղքի (5) վրա, որը գտնվում է ոսպնյակի կիզակետում։ Մոնոքրոմատորներում որպես նրբացրող տարր օգտագործվում է պրիզմա կամ դիֆրակցիոն ցանց։ Ալիքի անհրաժեշտ երկարություն կարելի է ստանալ փոփոխելով ընկնող բազմաալիք լույսի էներգիայի հոսքի անկյունը նըրբացրող տարրի հարթության նկատմամբ կամ պտտելով մոնոքրոմատորի պրիզման։ Ելքային ճեղքից (7) դուրս է գալիս որոշակի ալիքի երկա- 14 -

րությամբ լուսային էներգիայի մոնոքրոմատիկ հոսք։ Օպտիկական համակարգը (8) այնպես է ձևափոխում լուսային հոսքը, որ հետազոտվող լուծույթի նվազագույն թույլատրելի ծավալի և կյուվետային բաժնում (9) կյուվետի բազմակի անգամ տեղադրման դեպքում հոսքի երկրաչափությունը չի փոխվում։ Նմուշի միջով լույսը անցնելով՝ այնուհետև ընկնում է ֆոտոէլեմենտի (10) վրա։ Նկար 2-ում բերված է երկճառագայթ սպեկտրաֆոտոմետրի գծապատկերը, որտեղ հետազոտվող և ստուգիչ նմուշների վերլուծությունները կատարվում են միաժամանակ։

Նկ․2․Երկճառագայթ սպեկտրաֆոտոմետրի կառուցվածքային գծապատկերը։

Լույսն աղբյուրից (1) ընկնում է մոնոքրոմատորի (2) վրա և բաժանվում է երկու փնջերի, որոնք պտտվում են սեկտորաձև հայելու (3) միջոցով։ Ստացված լուսային փնջերը շրջվում են անշարժ հայելիների միջոցով (4), անցնում են ստուգիչ (5) և հետազոտվող (6) նմուշների միջով, այնուհետև մեկ այլ պտտվող հայելի միավորում է դրանք մեկ փնջի մեջ և լույսն ընկնում է ֆոտոընդունիչի (7) վրա։ Եթե տվյալ ալիքի երկարության տակ ստուգիչի և հետազոտվող նմուշների կլանումները նույնն են, ապա ֆոտոէլեմենտի վրա ընկնում է հաստատուն լուսային հոսք, իսկ եթե տարբեր են՝ փոփոխական։ Ֆոտոէլեմենտի հոսանքը ուժեղանում է էլեկտրոնային սխեմայով և առաջացող էլեկտրական ազդակը հասնում է ինքնագրին (8), որը գրանցում է բացթողնման կամ օպտիկական խտության կախվածությունը ալիքային թվից։

Նրբացրող տարրեր։ Սպեկտրային պրիզմաներ։ Պրիզմաների միջոցով ճառագայթների բաժանումը մոնոքրոմատիկ բաղադրիչների n բեկման ցուցիչից պրիզմայի միջով անցած ճառագայթի δ անկյան շեղման կախվածության արդյունք է, որը տարբեր  ալիքի երկարություն ունեցող ճառագայթների համար ունի տարբեր արժեքներ (նկ. 3)։

Նկ․3․Պրիզմայով անցնող լույսի բեկումը։

Պրիզմայի որակը բնութագրվում է Δδ∕Δ անկյունային նրբացրումով, ինչը կախված է պրիզմայի նյութից, այսինքն n և Δn∕Δ մեծություններից, α բեկման անկյունից և iI անկման անկյունից (և, հետևաբար, պրիզմայի առաջին և երկրորդ կողմերի վրա բեկման i1՛ և i2՛ անկյուններից)․

 sin  n    sin i  cos 

,

(9)

Կախված պահանջվող սպեկտրի տիրույթից՝ օգտագործում են տարբեր նյութերից պատրաստված պրիզմաներ․ տեսանելի տիրույթի համար՝ ապակուց, ՈւՄ տիրույթի համար՝ բյուրեղային կվարցից և ֆլյուորիտից։ Առավել շատ օգտագործում են հետևյալ պրիզմաները․ 1) պարզ եռակողմ պրիզմա 60° բեկման անկյամբ, 2) Աբբեի պրիզմա, որում լույսի փունջը շեղվում է 90° անկյամբ, 3) Ամիչիի պրիզմա՝ բաղ- 16 -

կացած երեք կամ ավելի միմյանց սոսնձված ուղղանկյուն պրիզմաներից և այլն։ Դիֆրակցիոն ցանցն իրենից ներկայացնում է հարթ կամ գոգավոր օպտիկական հարթության վրա նստեցված, բազմաթիվ իրար զուգահեռ և իրարից հավասարաչափ հեռացած նրբագծերից կազմված պարբերական կառուցվածք։ Քննարկենք, թե ինչպես է լույսն անդրադառնում այդ օպտիկական համակարգից (նկ. 4)։

Նկ․4․ Ցանցի վրա լույսի դիֆրակցիայի սխեման։

Եթե մոնոքրոմատիկ լույսի զուգահեռ փունջը ընկնում է մեծ հարթ հայելու վրա α անկյան տակ, ապա անդրադարձած լույսը նույնպես զուգահեռ փունջ է։ Այլ է պատկերը, երբ կիրառվում է բավականին նեղ շերտիկի տեսքով հայելի, որի լայնությունը ալիքի երկարության կարգի է, այսինքն մոտ 1000 նմ։ Լույսի զուգահեռ փունջն այդ շերտիկից անդրադարձումից հետո կորցնում է իր զուգահեռությունը։ Դիֆրակ- 17 -

ցիայի այս երևույթը դիտվում է նաև, երբ լույսն անցնում է նեղ ճեղքով։ Եթե մակերևույթի վրա կան բազմաթիվ պարբերական հայելային նըրբագծեր (կամ ճեղքեր), ապա տեղի է ունենում տատանումների ինտերֆերենցիոն գումարում, որոնք դուրս են գալիս β դիտարկվող ուղղությամբ b լայնության ունեցող յուրաքանչյուր ճեղքից (նկ. 4)։ Արդյունքում էկրանի վրա առաջանում են լուսավորվածության մաքսիմումներ, որոնք նկարագրվում են դիֆրակցիոն ցանցի հավասարմամբ․

d (sin   sin  )  m ,

(10)

որտեղ α-ն լույսի փնջի անկման անկյունն է, β-ն ցանցի նկատմամբ տարված նորմալի և դիֆրակցիոն փնջի տարածման ուղղության միջև անկյունն է, d-ն ցանցի պարբերականությունն է, m-ը ամբողջ թիվ է և կարող է ընդունել 0, ±1, ±2, ±3,․արժեքներ և հավասար է այն ալիքների երկարությունների թվին, որոնց չափով ցանցի տվյալ ճեղքի որոշակի տարրից դուրս եկող ալիքը հետ է ընկնում հարևան ճեղքի նույնատիպ տարրից դուրս եկող ալիքներից։ Նկարից երևում է, որ անկման հաստատուն α անկյան դեպքում գլխավոր մաքսիմումների դիրքը կախված է ալիքի երկարությունից։ Այդ պատճառով ցանցով բազմաալիք փնջի անցումից հետո յուրաքանչյուր մաքսիմումում դիտվում է լույսի սպեկտրալ բաժանում (նկ.․4)։ Մաքսիմումները համարակալում են m թվին համապատասխան, իսկ m-ը անվանում են սպեկտրի կարգ։ α=β դեպքում կդիտվի զրոյական դիֆրակցիոն մաքսիմում, որը չի պարունակում լույսի սպեկտրալ բաժանում։ Նրա երկու կողմից տարածվում են առաջին m=±1, երկրորդ m=±2 և ավելի բարձր կարգի սպեկտրներ։ Սպեկտրի տեսանելի և ՈւՄ տիրույթների համար հատուկ են այնպիսի դիֆրակցիոն ցանցեր, որոնք 1մմ վրա պարունակում են 300-ից 1200 նրբաշերտեր։

4. ՍՊԵԿՏՐԱՍԿՈՊԻԿ ՉԱՓՈՒՄՆԵՐԻ

ԱՌԱՆՁՆԱՀԱՏԿՈՒԹՅՈՒՆՆԵՐԸ

ԲԼԲ օրենքը կանխատեսում է նյութի օպտիկական խտության գծային կախվածությունը նրա մոլային կոնցենտրացիայից. ε-ը ուղիղ համեմատական է նյութի կոնցենտրացիային, որը հաստատուն է և կախված չէ փորձի իրականացման պայմաններից։ Սակայն գործնականում հանդիպում են գծային կախվածությունից շեղման դեպքեր։ Դիտարկենք, թե որ գործոնները կարող են ազդել ε-ի մեծության վրա։ Այն կարող է կախված լինել ընկնող լույսի Ι0 ինտենսիվությունից։ Ι0-ի բարձր արժեքների դեպքում էլեկտրոններով հիմնական վիճակի հագեցվածությունը կարող է կտրուկ նվազել, ինչը բերում է ε-ի նվազմանը ընդհուպ մինչև 0-ական արժեքը։ Նման երևույթները հետազոտվում են ոչ գծային սպեկտրասկոպիայում։ Սակայն հիմնականում օպտիկական սպեկտրասկոպիայում նման հզոր ճառագայթման աղբյուրներ չեն օգտագործվում և ընդունվում է, որ ε-ը կախված չէ ընկնող լույսի ինտենսիվությունից։ -ի թվային արժեքի վրա կարող են ազդել արտաքին պայմանները՝ ջերմաստիճանը, ճնշումը (գազերի համար), լուծիչը։ Այսպես, ջերմաստիճանի բարձրացմանը զուգընթաց կարող է դիտվել կլանման շերտի լայնացում, որը պայմանավորված է հիմնական վիճակում էլեկտրոններով տատանողական մակարդակների հագեցվածության փոփոխությամբ։ Լուծիչի բևեռայնության փոփոխությունը (մասնավորապես, բևեռային լուծիչի փոխարինումը ոչ բևեռային լուծիչով) կարող է ազդել հետազոտվող կլանման շերտի λմաքս-ի դիրքի վրա։ Օրինակ, մասնիկի կլանման շերտը ջրից ացետոն տեղափոխելիս շեղվում է 4800 սմ-1-ով։ Նման տեղաշարժերը բացատրվում են ներմոլեկուլային փոխազդեցությունների առաջացմամբ, որոնք բերում են արտաքին սոլվատային թաղանթի կառուցվածքի փոփոխության։ ԲԼԲ օրենքից շեղումը կարող է նաև պայմանավորված լինել քիմիական պատճառներով, որը լուծիչում տարբեր կլանող մասնիկների միջև բարդ փոխազդեցությունների արդյունք է։ Այդ դեպքում նյութերի

կոնցենտրացիայի փոփոխությունը կարող է հանգեցնել հավասարակշռության դիրքի տեղաշարժմանը, ինչն իր ազդեցությունն է ունենում կլանման սպեկտրի վրա։ Այս դեպքում նույնիսկ նոսր լուծույթներում չի պահպանվում ε-ի հաստատունությունը։ Մյուս գործոնը այն է, որ լույսի փոխազդեցությունը նյութի հետ չի սահմանափակվում միայն կլանմամբ։ Դիտարկենք, փորձում լույսի ինտենսիվության ողջ հաշվեկշիռը։ Ենթանդրենք Ι0 ինտենսիվությամբ լույսի փունջն ընկնում է հետազոտվող նմուշով կյուվետի վրա։ Լույսի մի մասն անդրադառնում է օդ-միջավայր բաժանման մակերևույթի վրա և կյուվետի պատերից՝ Ιանդր։ Մի մասը ցրվում է միջավայրի մասնիկների վրա բոլոր ուղղություններով, որի դեպքում փոխվում է լույսի սպեկտրալ կազմը՝ Ιցրում, մի մասն անցնում է և ընկնում ընդունիչի վրա՝ Ιx, ինչպես նաև տեղի է ունենում որոշ մասի կլանում՝ Ιկլ․, որի մի մասը կարող է հետագայում լուսարձակվել բոլոր ուղղություններով՝ Ιլյում, իսկ մի մասն էլ վերածվել ջերմության՝ տաքացնելով լուծույթը։ Այսպիսով, ինտենսիվության գումարային տեսքը հետևյալն է.․ Ι0=Ιx+Ιկլ․+Ιանդր․+Ιցրում։ ԲԼԲ օրենքը, բնականաբար, վերաբերում է միայն Ιկլ․ և Ιx-ին։ Հետևաբար, մյուս գումարելիները պետք է լինեն կամ անհամեմատ փոքր, կամ ինչ որ կերպ հաշվի առնվեն։ Ιցրում և Ιանդր․հետ կապված անճշտությունների մեծ մասը կարելի է վերացնել՝ կիրառելով կլանման տարբերակման մեթոդը։ Այս դեպքում չափում են ոչ թե նյութով կյուվետի վրա ընկնող լույսի ինտենսիվությունը՝ Ι0-ն, այլ լույսի փնջի այն ինտենսիվությունը, որն անցնում է մաքուր լուծիչ պարունակող համեմատական կյուվետի միջով՝ Ιհամ։ Ιցրում․ազդեցությունը փոքրացնելու համար խորհուրդ չի տրվում օգտագործել 1սմ-ից մեծ օպտիկական ուղի ունեցող կյուվետներ։ Հնարավոր է նաև Ιլյում․պայմանավորված չափումների որոշակի սխալներ, սակայն մեծ մասամբ այդ ճառագայթումը ցրվում է բոլոր ուղղություններով, և նրա միայն աննշան մասը կարող է ընկնել ընդունիչի վրա։ Երկրորդ, նման շեղումները կարող են պայմանավորված լինել օգտագործվող սարքի ոչ լիարժեք կառուցվածքով։ Դրանց թվին են

պատկանում գրանցող սարքի վրա ընկնող լույսի ինտենսիվության և գրանցված էլեկտրական ազդակի միջև ուղիղ համեմատականության բացակայությունը, լույսի փնջի ոչ լրիվ զուգահեռությունը և ոչ լրիվ մոնոքրոմատիկությունը, սպեկտրի գրանցման բարձր արագությունների դեպքում ինքնագրի որոշակի իներցիայի առկայությունը և այլն։ Հաշվի առնելով վերը նշվածը, սպեկտրասկոպիայում ընդունված է յուրաքանչյուր հետազոտվող նմուշի համար փորձնականորեն ստուգել Բուգեր-Լամբերտ-Բերի օրենքը։ Այդ նպատակով ֆիքսված ալիքի երկարության տակ իրականացնում են տարբեր կոնցենտրացիաներով մի շարք լուծույթների օպտիկական խտության չափումներ։ Ստացված տվյալներով կառուցվում է C-ից Aλ–ի կախվածության տրամաչափական կորը (օպտիկական շերտի հաստատուն հաստության դեպքում), որից դատում են ուղիղ համեմատականության առկայության մասին։ Իդեալական դեպքում կորի կետերը պետք է լինեն կոորդինատների սկզբնակետով անցնող ուղղի վրա։ Այդ ուղղի թեքության անկյան տանգենսն իրենից ներկայացնում է հետազոտվող նմուշի մարման մոլային գործակիցը։ Փորձի ճշտության համար մեծ նշանակություն ունի օպտիկական խտությունների օգտագործվող միջակայքը։ Ժամանակակից սպեկտրաֆոտոմետրերը չափումներն իրականացնում են օպտիկական խտության 0<А<4 սահմաններում, սակայն ստացվող արժեքների ճշտությունը, այս միջակայքի տարբեր կետերում, միմյանցից խիստ տարբերվում են։ Օպտիկական խտության որոշման հարաբերական սխալը նկարագրվում է հետևյալ արտահայտությամբ



A DA  I I 0   log e A  10 4



(11)

Հարաբերական սխալի՝ ΔА/А-ի կախվածությունը А-ից հաշվարկված է այն պայմանի համար, որ օպտիկական խտության հետազոտության ողջ միջակայքում ΔΙ և Ι0-ն հաստատուն մեծություններ են (նկ. 5)։ Ինչպես երևում է կորից, օպտիկական խտության հաշվարկման

ժամանակ նվազագույն սխալ դիտվում է А=lge=0.4343 դեպքում, իսկ այդ արժեքից շեղման դեպքում այն խիստ մեծանում է, ուստի ընտըրվում են այնպիսի պայմաններ, որ լուծույթի օպտիկական խտության արժեքը լինի 0.1<А<1.4 սահմաններում։

Նկ․ 5․Օպտիկական խտության որոշման հարաբերական սխալը։

Այնուամենայնիվ, եթե օպտիկական խտության փորձնականորեն չափված արժեքները դուրս են գտնվում այդ միջակայքից, ապա կարելի է կամ լրացուցիչ նոսրացնել լուծույթը, կամ օգտագործել օպտիկական ուղու այլ երկարություն ունեցող կյուվետներ։

5. Բազմաբաղադրիչ համակարգերի սպեկտրների վերլուծությունը Բազմաբաղադրիչ խառնուրդների կլանման սպեկտրների վերլուծությունը բավականին դժվար է։ Որպես պարզագույն դեպք դիտարկենք իրավիճակ, երբ լուծույթում կան երկու տիպի մասնիկներ՝ A և B։ Այդ դեպքում վրադրվում է ևս մի պայման, որ այդ մասնիկները լույսը կլանում են սպեկտրի հետազոտվող միջակայքում և կարող են փոխակերպվել մեկը մյուսին դարձելի կամ անդարձելի քիմիական ռեակցիաների արդյունքում (օրինակ՝ իզոմերիզացիա, կոմպլեքսագոյացում)։ Բացի այդ, դրանց կոնցենտրացիաները կապված են իրար հետ հետևյալ առնչությամբ.

C A  CB  C0  const Հետևաբար, կլանման սպեկտրից կարելի է որոշել CA և CB արժեքները։ Վերլուծության իրականացման համար անհրաժեշտ է, որ ալիքի երկարության որոշակի միջակայքում այդ մասնիկների սպեկտրները էականորեն տարբերվեն միմյանցից։ Ենթադրենք, որ ընտրված միջակայքում այդ մասնիկների սպեկտրները չեն վերածածկում միմյանց։ Այդ դեպքում հետազոտվող ալիքի երկարությունը պետք է այնպես ընտրել, որ նյութերից մեկը դրա տակ կլանում չունենա, իսկ մյուսն ունենա առավելագույն կլանում: C0-ի և ընտրված ալիքի երկարության տակ օպտիկական խտության՝ Aλ-ի հայտնի արժեքների պայմաններում հեշտությամբ որոշվում է յուրաքանչյուր մասնիկի կոնցենտրացիան։ Դիտարկենք ավելի բարդ դեպք, երբ երկու մասնիկների սպեկտրներն ամբողջությամբ վերածածկում են իրար։ Այս դեպքում, որպես հետազոտվող ալիքի երկարություն, պետք է ընտրել այնպիսի տիրույթ, որտեղ εA-ն և εB-ն տարբերվեն իրարից առավելագույն չափով։ Տվյալ ալիքի երկարության տակ երկբաղադրիչ համակարգի օպտիկական խտության արտահայտությունը հետևյալն է․

A  l  ( AC A   BC B )

(12)

Քանի որ մասնիկների գումարային կոնցենտրացիան հաստատուն է, ապա այդ արտահայտությունը կարելի է ներկայացնել հետևյալ տեսքով․

A  l  ( BC0  ( A   B )  C A )

(13)

Ինչպես ակնհայտ է (13)-ից, եթե որոշակի λ* ալիքի երկարության տակ երկու մասնիկների մարման մոլային գործակիցների արժեքները հավասար են իրար (εAεB), ապա այդ ալիքի երկարության տակ Aλ* օպտիկական խտությունը որոշվում է միայն մասնիկների C0 սկզբնական կոնցենտրացիայով և կախված չէ հավասարակշռական ձևերի հարաբերությունից։ Հետևաբար, ցանկացած բաղադրությամբ լուծույթների սպեկտրալ կորերը կհատվեն մեկ կետում (նկ. 6), որը կոչվում է իզոբեստիկ կետ։ Կլանման սպեկտրների վրա մեկ կամ մի քանի իզոբեստիկ կետերի առկայությունը վկայում է լուծույթում հավասարակշռության մասին։ Խառնուրդի վերլուծության ճշտությունը կախված է նաև հետազոտվող ալիքի երկարության ճիշտ ընտրությունից և մեծ է այնքանով, որքանով մեծ է ածանցյալի արժեքը․

dA  l  ( A   B ) dC A

(14)

Կյուվետի տրված l երկարության դեպքում զգայունությունը մեծանում է (εA-εB) տարբերության մեծացմանը զուգահեռ՝ հասնելով առավելագույն արժեքի այն կետերում, որտեղ այդ տարբերությունն ընդունում է ամենամեծ արժեքը։ Այդպիսի կետերը անվանում են բնութագրական։

6. ԴԻՖԵՐԵՆՑԻԱԼ ՄԵԹՈԴԸ ԿԼԱՆՄԱՆ

ՍՊԵԿՏՐԱՍԿՈՊԻԱՅՈՒՄ

Դիֆերենցիալ մեթոդներում չափում են ոչ թե նմուշի բացարձակ կլանումը, այլ հետազոտվող և ստուգիչ նմուշների կլանումների տարբերությունը, ընդ որում, որպես կանոն, հետազոտվող նմուշի կլանումը պետք է մոտ լինի ստուգիչի կլանմանը։ Հիմնականում կենսաբանական հետազոտություններում գրանցում են երկու նմանատիպ նմուշների կլանումների տարբերությունը, որն առաջանում է արտաքին գործոնների ազդեցությամբ (լույս, քիմիական ռեագենտ, ջերմաստիճան և այլն)։ Դիֆերենցիալ մեթոդների գործնական օգտագործումը սպեկտրաֆոտոմետրերում բարձրացնում է վերլուծության զգայունությունն ու հստակությունը առնվազն 5-6 անգամ։ Այժմ գրականության մեջ նկարագրվում են ավելի քան երկու տասնյակ դիֆերենցիալ սպեկտրաֆոտոմետրեր, որոնք ունեն օպտիկական խտության մոտավորապես 104 միավոր զգայունություն, և նրանց միջոցով լուծվում են կենսաբանական օբյեկտների հետազոտության մի շարք խնդիրներ։

6.1. Դիֆերենցիալ կլանման սպեկտրասկոպիայի մեթոդի հիմունքները Առաջին անգամ այն մեթոդը, որի միջոցով որոշվում է հետազոտվող նյութի կլանման տարբերությունը ստուգիչի համեմատ նկարագրել են Կորտյումը և Միլիկենը 1937թ-ին։ Կորտյումը այդ մեթոդով որոշել է լուծույթի կոնցենտրացիան՝ համեմատելով այն հայտնի կոն-ցենտրացիայով լուծույթի հետ, իսկ Միլիկենը հետազոտել է կենսաբանական նմուշի աէրոբ և անաէրոբ վիճակների տարբերությունը։ Մե-թոդի տեսական բացատրությունը, որը ստացել է «դիֆերենցիալ» ան-վանումը, տվել են Հիսկին և Բաստիանը։ Դիֆերենցիալ մեթոդով հետազոտվող նմուշի կլանումը կամ բացթողումը գրանցում են A0≠0 օպտիկական խտությամբ համեմատականության լուծույթի նկատմամբ։ Այս մեթոդը A0=0 դեպքում վերածվում է սովորական կլանման սպեկտրասկոպիայի։ Բացարձակ ճշգըրտության

հաստատուն արժեքի դեպքում սովորական սարքերի միջոցով չափումների ճշտության բարձրացումը հնարավոր է ավելի մեծ կոնցենտրացիաներով լուծույթների գրանցման շնորհիվ։ Հատուկ (դիֆերենցիալ) սպեկտրաֆոտոմետրերի հայտնագործումը, որոնք թույլ են տալիս մեծ ճշգրտությամբ չափել օպտիկական խտության ոչ մեծ բացարձակ մեծությունները ընդհանուր մեծ կլանման ֆոնի վրա պայմանավորել են կլանման վերլուծության ճշտության հետագա բարձրացումը։ Դիտարկելով մեթոդի տեսական հիմքը՝ Հիսկին օգտվել է կալորիմետրիայի հիմնական օրենքից։ Եթե լուծույթով կյուվետի վրա ընկնում է I0 ինտենսիվությամբ լույս, իսկ դուրս է գալիս I ինտենսիվությամբ լույս, ապա համաձայն Բուգեր-Լամբերտ-Բերի օրենքի` լուծույթի օպտիկական խտությունը․

A  lg

I0   lg T    lc I

(15)

որտեղ T-ն նմուշի բացթողումն է,   -ն կլանման ցուցանիշ է, որը բնութագրում է տվյալ նյութի մոլեկուլի ունակությունը կլանելու λ ալիքի երկարության լույս, l-ը օպտիկական ուղու երկարությունն է, C-ն լուծույթի կոնցենտրացիան։ Դիֆերենցելով (15) արտահայտությունը՝ ստանում ենք անհայտ լուծույթի ΔA/A օպտիկական խտության կամ Δc/c կոնցենտրացիայի որոշման հարաբերական սխալի բանաձևը․

A c 0.434I I 0  0.434  T    A c I I 0  lgI I 0  A 10 A

(16)

Այս բանաձևից երևում է, որ հարաբերական սխալի մեծությունը էականորեն կախված է հետազոտվող նմուշի խտությունից։ (I/I0) մեծությունը հաստատուն է տվյալ սարքի համար։ Նկ․5-ում բերված է ΔA/A սխալի կախվածության կորը որպես ֆունկցիա A-ից՝ 1% ճշտությամբ սպեկտրաֆոտոմետրի (I/I0) բացթողման

դեպքում։ Կորից

երևում է, որ բացարձակ մեթոդով չափման համար օպտիմալ մարզ է համարվում 20-65% բացթողման միջակայքը (օպտիկական խտությունը 0,2-0,7)։ (16) արտահայտության դիֆերենցումը և ստացված հավասարման հավասարեցումը զրոյի տալիս է բացթողման արժեքը՝ 36,8% (օպտիկական խտությունը 0.434), որը համապատասխանում է նվազագույն հարաբերական սխալին։ Դիտարկենք նույն ինտենսիվությամբ լույսի անցումը երեք կյուվետներով, որոնք պարունակում են համապատասխանաբար c0 կոնցենտրացիայով մաքուր լուծիչ և c0=±Δc կոնցենտրացիաներով լուծույթներ։ Եթե գործում է Բուգեր-Լամբերտ-Բերի օրենքը, ապա c0 և լուծիչի նկատմամբ չափված c0=±Δc կոնցենտրացիաների համար ստանում ենք երկու հավասարում։ Քննարկենք c = c0 +Δc դեպքը․

I1  I 0 10

I 2  I 0 10

lec0  el ( c0  c )

(17) :

Այս երկու լուծույթներով անցած լույսի ինտենսիվությունների հարաբերությունը հավասար է․

I ѳñ 

I 2 I 0  10 el ( c0  c )   10 elc : I1 I 0 10  elc0

(18)

Երկրորդ լուծույթի օպտիկական խտությունը, որը չափվում է առաջինի նկատմամբ, հավասար է այդ լուծույթների բացարձակ մեծությունների տարբերությանը, այսինքն․

Aѳñ  A2  A1  elc :

(19)

Նշանակելով հետազոտվող լուծույթում վերլուծվող նյութի կոնցենտրացիան cx, իսկ նույն լուծույթի հայտնի կոնցենտրացիան համե-

մատականության լուծույթում՝ c0, (19) հավասարումը կարելի է գրել հետևյալ տեսքով․

Aѳñ  Ax  A0  el c x  c 0  ,

(20)

որտեղ Ax-ը cx կոնցենտրացիայով հետազոտվող լուծույթի օպտիկական խտությունն է, իսկ A0-ն՝ c0 կոնցենտրացիայով համեմատականության լուծույթի օպտիկական խտությունը։ Aհար մեծության նշանը կարող է լինել դրական կամ բացասական։ Վերջին դեպքում դա նշանակում է, որ հետազոտվող լուծույթի օպտիկական խտությունը փոքր է համեմատականության լուծույթի օպտիկական խտությունից։ Դիֆերենցիալ սպեկտրաֆոտոմետրերի դեպքում, որոնք ունեն օպտիկական խտությունների բացասական մարզ, այս երկու դեպքերը չեն տարբերվում միմյանցից։ Սակայն կլանող սարքերի նկատմամբ դիֆերենցիալ մեթոդների կիրառման դեպքում, որոնք չունեն օպտիկական խտությունների բացասական մարզ, չափումների կարգը «հակառակն» է դառնում, այսինքն հետազոտվող լուծույթը դառնում է համեմատականության լուծույթ, իսկ համեմատականության լուծույթը՝ հետազոտվող։ Եթե լուծենք (20) հավասարումը cx-ի նկատմամբ և նշանակենք

 k, El ապա կստանանք դիֆերենցիալ մեթոդով վերլուծության հաշվարկային բանաձևը․

cx  c0  kAѳñ :

(21)

Այս բանաձևում Aհար-ը կարող է լինել ինչպես դրական, այնպես էլ բացասական։

Չափումների ճշտությունը որոշելու համար պետք է գտնել cx/cx արտահայտությունը, որը լույսի կլանման օրենքի պահպանման դեպքում հավասար է Ax/Ax-ին։ (20) հավասարումը գրենք հետևյալ տեսքով.

lg Tѳñ.   Aѳñ.  l cx  c0  :

(22)

Դիֆերենցելով՝ կստանանք

dcx  

1 0.434  dTѳñ. : l Tѳñ.

(23)

Այս հավասարման երկու կողմերը բաժանելով cx-ի վրա և դիֆերենցիալ ձևից անցնելով վերջնական տեսքի, հաշվի առնելով նաև Ax=lc, իսկ Tհար.=10-Aհար. ստանում ենք․

cx A  0.434  Tѳñ.   : cx Ax Ax 10 Aѳñ.

(24)

A=0 և Aհետ․=Aհար․=A դեպքում (24) բանաձևը վերածվում է անմիջական սպեկտրասկոպիայի մեթոդով սխալների չափման բանաձևի, ինչը վկայում է այն մասին, որ այդ մեթոդը դիֆերենցիալ սպեկտրասկոպիայի մեթոդի մասնավոր դեպքն է։ (24) բանաձևի առաջին մասի ածանցյալը հավասարեցնելով զրոյի կգտնենք Aհար․ օպտիկական խտության օպտիմալ մեծությունը, որը համապատասխանում է չափումների նվազագույն սխալին․

Aѳñ.  0.434  A0 :

(25)

Մի քանի A0-ի համար չափումների սխալի Aհար. կախվածության կորերի շարքը, որոնք հաշվարկվել են (24) բանաձևով, բերված է նկ․6ում։

Նկար 6. Aհար-ի սխալի կախվածությունը A0-ի տարբեր արժեքներից՝ դիֆերենցիալ չափումների դեպքում:

Կորերից երևում է, որ հավասար պայմանների դեպքում Aհար. չափման սխալը նվազում է համեմատականության լուծույթի A0-ի մեծացմանը զուգընթաց։ A0-ի մեծացման դեպքում Aհար. օպտիմալ մեծությունը նվազում է 0.434-ից (A=0 դեպքում) մինչև 0 (A0=0.434 դեպքում) և A0-ի հետագա մեծացման դեպքում մնում է հավասար 0-ի։ Այստեղից հետևում է, որ չափումների ճշտության բարձրացման համար հետազոտվող լուծույթի և համեմատականության լուծույթի կոնցենտրացիաները պետք է լինեն առավելագույնս մեծ և հնարավորին չափով իրար

մոտ։ Սակայն (24) արտահայտությամբ հնարավոր չէ գտնել ΔΤ որոշման սխալի կախվածությունը Τ բացթողման մեծությունից։ Այդ պատճառով, տվյալ բանաձևով օպտիկական խտության օպտիմալ միջակայքի ընտրությունը հարմար, սակայն կոպիտ մոտավորություն է։ Գ.Ս. Տերեշինը ցույց է տվել, որ Të³ÑÙ. 

Të³ñù. սահմանային TÏÛ.

ցուցանիշը հաշվի առնելով (որտեղ Tսարք. սարքի սխալն է, իսկ Tկյ.-ը՝ կյուվետի)՝

T  Të³ñù.

 T   ։ 1   T  ë³ÑÙ. 

(26)

Այս դեպքում (24) բանաձևն ընդունում է հետևյալ տեսքը․

c x A   cx Ax

0.434Të³ñù.

 T   1   T  ë³ÑÙ. 

A  10  Aѳñ.

,

(27)

իսկ A-ի օպտիմալ մեծությունը, որը համապատասխանում է չափման նվազագույն սխալին, որոշվում է հետևյալ հավասարմամբ․

  T 2     A0 : Aѳñ.  0.434 1     Të³ÑÙ.  

(28)

(27) բանաձևից հետևում է, որ չափումների ճշտությունը բարձրացնելու համար անհրաժեշտ է, որ սարքի զգայունությունը լինի բարձր (Tսարք. նվազեցնելու համար), իսկ կյուվետների կլանման մեծությունը հաստատուն՝ Tկլ. նվազեցնելու և Tսահմ. մեծացնելու համար։

6.2. Դիֆերենցիալ սպեկտրաֆոտոմետրերը և դրանց կիրառությունը կենսաբանական հետազոտություններում Միաճառագայթ սարքերով դիֆերենցիալ չափման մեթոդի էությունը հետևյալն է. թույլ մոնոքրոմատիկ «չափվող» լույսն անցնում է նմուշով կյուվետի միջով և ընկնում ճառագայթման ընդունիչի վրա։ Վերջինից էլեկտրական ազդակը, որն ուղիղ համեմատական է նմուշով անցած լույսի ինտենսիվությանը, փոխհատուցվում է օժանդակ աղբյուրից դուրս եկող I0-ին հավասար և հակառակ ուղղված էլեկտրական ազդակով։ Ազդակների տարբերությունը՝ ΔI=I-I0, որն առաջանում է որոշակի գործոնների, օրինակ՝ լրացուցիչ լուսավորվածության, նմուշի բացթողման փոփոխությունների պատճառով, ուժեղանում և գրանցվում է։ Կախված գրանցման համակարգերի իներտությունից՝ միաճառագայթ սարքերը կարող են օգտագործվել ինչպես շատ արագ՝ վայրկյանի մասերի ընթացքում, այնպես էլ րոպեների ընթացքում իրականացվող ռեակցիաների հետազոտության համար։ Ուժեղ կլանող կամ ցրող օբյեկտների հետազոտության համար դիֆերենցիալ սպեկտրոֆոտոմետրերի զգայունությունը մեծ մասամբ կախված է լույսի ինտենսիվությունից, որն ընկնում է ճառագայթման ընդունիչի վրա։ Այս տեսակետից միաճառագայթ սարքերը, որոնք առավելագույնս օգտագործում են լույսի աղբյուրի ինտենսիվությունը, մաքսիմալ զգայուն են, ինչը համապատասխանում է 10-5 միավոր օպտիկական խտությանը և սահմանափակվում է միայն ֆոտոհոսանքի աղմուկով։ Սակայն միաճառագայթ սարքերի առանձին հանգույցների կայունության նկատմամբ բարձր պահանջները հնարավոր են միայն շատ արագ պրոցեսների գրանցման դեպքում (≤1 վրկ.)։ Դանդաղ պրոցեսների ժամանակ միաճառագայթ սարքերի զգայունությունը, զրոյական արժեքի տատանումների և արտաքին ազդակների հետևանքով, զգալի նվազում է։

Նկար․7․ Դիֆերենցիալ սպեկտաֆոտոմետրերի հիմնական տեսակների բլոկ-սխեման․ ա) միաճառագայթ, բ) երկալիք, գ) երկճառագայթ։

Միաճառագայթ սարքերը հարմար է օգտագործել լուծույթում ֆերմենտային ռեակցիաների հետազոտության ժամանակ։ Նման ռեակցիաների ընթացքում տեղի է ունենում օպտիկական խտության փոփոխություն, որի գրանցումը թույլ է տալիս ուսումնասիրել ռեակցիայի արագությունը, միջանկյալ կոմպլեքսների առաջացումը և նրանց քայքայումը։ Ռեագենտների խառնումը և նրանց հոսքը դեպի չափող կյուվետ տեղի է ունենում հատուկ հարմարանքների միջոցով, որոնց մեջ խառնվելուց հետո լուծույթը հավասարաչափ հոսում է կյուվետի միջով (հավասարաչափ հոսքի մեթոդ)։ Հարտրիջի և Ռուֆտոնի հայտնաբերած այս տարբերակը Չանսը լրացրել է հարմարանքներով, որոնք

աշխատում են արագացված հոսքի մեթոդով և թույլ են տալիս գրանցել ռեակցիայի ընթացքը խառնումից 0․3μվրկ հետո, ինչպես նաև հարմարանքներով, որոնք աշխատում են կանգնած հոսքի մեթոդով և նախատեսված են դանդաղ ռեակցիաների հետազոտության համար։ Լունդեգարդը կիրառել է միաճառագայթ սպեկտրաֆոտոմետր՝ բույսերի արմատներում և մի շարք միկրոօրգանիզմներում ցիտոքրոմների երկու կայուն վիճակների (անաէրոբիոզ-աէրոբիոզ) դիֆերենցիալ սպեկտըրների գրանցման համար։ Միաճառագայթ սարքերը առավել լայն կիրառում գտել են բարձրակարգ բույսերի, ջրիմուռների և ֆոտոսինթեզող բակտերիաների բջիջներում ֆոտոսինթեզի առաջնային ռեակցիաների հետազոտության մեջ։ Ֆոտոկենսաբանական ռեակցիաների հետազոտության համար գոյություն ունի միաճառագայթ դիֆերենցիալ սպեկտրաֆոտոմետրերի երկու տեսակ։ Առաջին տեսակի սարքերը գրանցում են երկարատև ազդակները (0․1վրկ-ից մինչև մի քանի րոպե) և նախատեսված են ռեակցիայի արգասիքների գրանցման համար, որոնք երկարատև լույսի ազդեցության տակ անցնում են նմուշի վրա։ Երկրորդ տեսակի սպեկտրոֆոտոմետրերը իմպուլսային սպեկտրասկոպիկ սարքեր են և թույլ են տալիս գրանցել իմպուլսային լուսավորվածության դեպքում ֆոտոսինթեզի արագ ընթացող ռեակցիայի կինետիկան։ Իմպուլսային և դիֆերենցիալ սպեկտրասկոպիայի մեթոդներով ստացված տվյալների համեմատումը ավելի ընդհանուր պատկերացում է տալիս ֆոտոսինթեզի առաջնային ռեակցիաների կինետիկ առանձնահատկությունների մասին։ Սակայն նույնիսկ աննշան փոփոխությունները փորձի անցկացման պայմաններում, ինչպես նաև չափումների ընթացքում օրգանիզմի ֆիզիոլոգիական վիճակի փոփոխությունները կարող են բերել սխալ տվյալների ստացմանը։ Այդ պատճառով կարևոր նշանակություն ունի այնպիսի սարքերի նախագծումը, որոնց մեջ միաժամանակ գրանցում են միևնույն պայմաններում գտնվող նույն օբյեկտի արագ և դանդաղ ռեակցիաները։ Միաժամանակ գոյություն ունեն մի շարք պատճառներ, որոնք սահմանափակում են միաճառագայթ սարքերի հնարավորությունները։

Վերջիններս պիտանի չեն բջջային կախույթներում և միտոքոնդրիումներում լույսի կլանման շատ փոքր փոփոխությունների գրանցման համար մեծ թվով օբյեկտների դեպքում, որոնցում արտաքին ազդեցությունը առաջացնում է ոչ միայն կլանման սպեցիֆիկ փոփոխություններ, այլև լույսի ցրման ոչ սպեցիֆիկ փոփոխություններ։ Բնականաբար, այս դեպքում ստացված արդյունքները ոչ լիարժեք պատկերացումներ կտան հետազոտվող նմուշի բաղադրիչների վիճակի իրական փոփոխությունների մասին։ Երկարատև պրոցեսների կինետիկայի գրանցման դեպքում ևս իջնում է սարքի զգայունությունը և ճշտությունը` սարքի հանգույցների անկայունության և սխալների հետևանքով, ինչը պայմանավորված է հետազոտվող կախույթի մասնիկների նստեցմամբ և կոնվեկցիոն շարժմամբ։ Կինետիկ օրինաչափությունների հետազոտությունը միայն որոշակի ալիքի երկարության տակ և արգասիքների դիֆերենցիալ սպեկտրների անընդհատ գրանցելու հնարավորության բացակայությունը, որն առաջանում է իրականացվող ռեակցիաների ընթացքում, ևս էականորեն սահմանափակում է հետազոտվող հարցերի շրջանակը։ Միաճառագայթ սպեկտրաֆոտոմետրերի հիմնական թերությունները և սահմանափակումները շտկվել են առավել կատարելագործված երկճառագայթ սարքերում։ Գոյություն ունեն երկճառագայթ դիֆերենցիալ սպեկտրաֆոտոմետրերի երկու հիմնական տեսակ՝ երկալիք և երկճառագայթ։ Երկալիք սարքերը հիմնականում հարմար են պրոցեսների կինետիկական բնութագրիչների մանրամասն հետազոտության համար այն դեպքում, երբ նմուշի վրա արտաքին ազդեցությունը բերում է ոչ միայն կլանման, այլև ցրման փոփոխությանը։ Մասնավորապես, այս սարքերը օգտագործվում են ամբողջական բջիջներում և նրա ֆրագմենտներում էլեկտրոնային տեղափոխման շղթայի բաղադրիչների օքսիդա-վերականգնման վերափոխումների կինետիկ բնութագրիչների հետազոտության համար։ Երկալիք սարքերում (նկ․7, բ) լույսի աղբյուրը լուսավորում է երկու մոնոքրոմատորներ, որոնցից հետո ալիքի տարբեր երկարություններով (λ1 և λ2) լույսի ճառագայթները մոդուլացնող համակարգի միջով ընկնում են հետազոտվող նմուշով կյուվետի վրա։ Նմուշից հետո լույսն

ընկնում է ճառագայթման ընդունիչի վրա։ Ալիքի երկարությունները այնպես են ընտրվում, որ λ1-ը լինի հետազոտվող միացության կլանման փոփոխության պիկում, իսկ λ2-ը՝ դրան հարակից կետում՝ կլանման նվազագույն փոփոխությամբ։ Օրինակ, բջիջների աէրոբ կախույթում ցիտոքրոմ C-ի վերականգնման չափման դեպքում մի ալիքի երկարությունը ընտրվում է 550նմ-ը, մյուսը՝ 540նմ։ Երկու մոնոքրոմատորներից դուրս եկող ճառագայթների ինտենսիվությունը այնպես է ընտրվում, որպեսզի ճառագայթման ընդունիչի ելքի վրա փոփոխական բաղադրիչը հավասար լինի զրոյի։ Դրանից հետո նմուշը ենթարկվում է արտաքին ազդեցությանը, ինչի հետևանքով ցիտոքրոմ C-ն վերականգնվում է։ Քանի որ λ1=550նմ և դիֆերենցիալ սպեկտրում գտնվում է կլանման շերտի մաքսիմումի մոտակայքում, ապա սարքը գրանցում է վերականգնված ցիտոքրոմ C-ի կլանման շերտի ի հայտ գալով պայմանավորված ազդակը, որը համապատասխանում է օպտիկական խտությունների տարբերությանը։ Քանի որ իրար մոտ ալիքի երկարությունների դեպքում ցրման փոփոխության տարբերությունը փոքր է, երկճառագայթ մեթոդի օգտագործումը էականորեն նվազեցնում է սխալը, որը պայմանավորված է նմուշի ցրման հատկությունների փոփոխությամբ որպես ժամանակի ֆունկցիա կամ ռեագենտների ավելացման հետևանք։ Երկալիք տարբերակի օգտագործումը էականորեն նվազեցնում է սխալ տվյալների ստացումը, որը ֆերմենտային ռեակցիաների հետազոտության դեպքում լուծույթում ռեագենտների իրար խառնվելու հետևանք է, իսկ սխալ տվյալները նստեցման կամ կյուվետում միկրոօրգանիզմների ուղղորդված շարժման հետևանք են։ Կենսաբանական օբյեկտների հետազոտության դեպքում հաճախ անհրաժեշտ է լինում գրանցել երկու նմուշների կլանումների տարբերությունը, որպես ալիքի երկարության ֆունկցիա, երբ նմուշները նույնական են բոլոր առումներով, բացի ֆերմենտների օքսիդացված վիճակից։ Այս նպատակի համար առավել հարմար է օգտագործել երկճառագայթ սպեկտրաֆոտոմետրեր։ Երկճառագայթ և երկալիք տարբերակների էլեկտրոնային սխեմաները նման են, մինչդեռ օպտիկական և մեխանիկական սարքերը էականորեն տարբերվում են միմյանցից։

Երկճառագայթ սարքում (նկ․7, գ) լույսը մոնոքրոմատորով անցնելուց հետո բաժանվում է երկու մասի։ Այս ճառագայթները մոդուլյատորով անցնելուց հետո հաջորդաբար ընկնում են երկու միանման կյուվետների վրա, որոնցից մեկի մեջ հետազոտվող նմուշն է, իսկ մյուսի մեջ՝ համեմատականության։ Նմուշներից հետո լույսն ընկնում է ճառագայթման ընդունիչի վրա։ Նմուշներով կյուվետի տեղադրումից հետո գրանցվում է զրոյական գիծը, ուսումնասիրվող նմուշը ենթարկվում է հետազոտվող ազդեցությանը և գրանցվում է կլանման սպեկտըրների տարբերությունը։ Հոսանքը ճառագայթման ընդունիչի ելքի վրա, որը համապատասխանում է համեմատականության նմուշի միջով անցած լույսի ինտենսիվությանը, շղթայի հակադարձ կապի հետևանքով պահպանվում է միևնույն մակարդակի վրա։ Հակադարձ կապի առկայությունն անհրաժեշտ տարր է, որը թույլ է տալիս փոխհատուցել ճառագայթման ընդունիչի զգայունության անհավասարությունը, լույսի աղբյուրի ճառագայթման անհավասարությունը և սպեկտրի ալիքի երկարությունից կախված նմուշի բացթողման փոփոխությունը։ Սպեկտրաֆոտոմետրերի այս երկու տեսակները կարող են միմյանց փոխարինել, միայն թե սահմանային բնութագրիչների անխուսափելի նվազեցմամբ։ Այդ պատճառով մեծ հետաքրքրություն է ներկայացնում այնպիսի սարքերի կիրառումը, որոնք միավորում են երկճառագայթ և երկալիք սարքերի բլոկ սխեմաները։ Այսպես, Ռիկմենսպոլի սպեկտրաֆոտոմետրում օպտիկական մասը հավաքված է կտրված դիֆրակցիոն ցանցով Չերնի-Տերների տեսակի մոնոքրոմատորի վրա, որի յուրաքանչյուր կես ունի մյուսից անկախ մուտք։ Երկճառագայթ տարբերակը իրականացվում է նույն դիրքում ցանցերի ամուր ամրացման և մուտքերից մեկի մոտ դրանց պտտման շնորհիվ։ Ցանցի յուրաքանչյուր կեսի առանձին պտույտի դեպքում սարքը կարող է աշխատել որպես երկալիք։ Ընդ որում, այդպիսի սարքը ցույց է տալիս երկալիք և երկճառագայթ սպեկտրոֆոտոմետրերի տարբերությունները և նմանությունները։ Ճառագայթի բաժանումը երկու մասի բերում է լույսի ինտենսիվության նվազմանը և համապա- 37 -

տասխանաբար զգայունության անկմանը։ Սակայն, ցածր տեխնիկական աղմուկների շնորհիվ, դանդաղ պրոցեսների գրանցման դեպքում այս սարքերի զգայունությունը բարձրանում է միաճառագայթ սարքերի համեմատ։ Գրականության մեջ նկարագրված սարքերի մեծամասնությունն ունի 10-4 միավոր օպտիկական խտություն։

7. ԹՈՒՅԼ ԹԹՈՒՆԵՐԻ ԴԻՍՈՑՄԱՆ ԱՍՏԻՃԱՆԻ ՈՐՈՇՈՒՄԸ

ԹԹՎԱՀԻՄՆԱՅԻՆ ՀԱՎԱՍԱՐԱԿՇՌՈՒԹՅԱՆ

ՎԵՐԼՈՒԾՈՒԹՅՈՒՆԸ

Սպեկտրասկոպիայի մեթոդը մեծ կիրառություն ունի թթվահիմնային հավասարակշռության վերլուծության համար: Թթու են անվանում այն նյութերը, որոնք ունակ են պրոտոն անջատելու, իսկ հիմքեր են կոչվում այն նյութերը, որոնք ընդունակ են պրոտոններ միացնելու։ Թթվահիմնային հավասարակշռությունը կարելի է ներկայացնել հետևյալ կերպ․

H x Ay  H   H x 1 Ay , 

որտեղ H x Ay -ը զուգակցված թթուն է, իսկ H x1 Ay -ը՝ զուգակցված հիմքը։ Տվյալ հավասարակշռությունը բնութագրվում է թթվայնության հաստատունով, որը որոշվում է հավասարակշռության մեջ մասնակցող մասնիկների ակտիվության աստիճանների արտադրյալով, որոնք համապատասխանում են ստեխիոմետրիկ գործակիցներին․

a( H  )  a( H x 1 Ay ) Ka  , a( H x Ay )

(29)

որտեղ Ka-ն թթվայնության հաստատունն է, a-ն՝ թթվային և հիմնային մասնիկների ակտիվության աստիճանը: Ընդ որում, կախված դիտարկվող հավասարակշռությունից՝ նույն մասնիկը կարող է ծառայել ինչպես թթու, այնպես էլ հիմք։ Օրինակ, ծծմբական թթվի դիսոցումը բնութագրվում է հետևյալ հավասարմամբ․  

H 2 SO4  H  HSO4 HSO   H   SO 2

Առաջին ռեակցիայում HSO4–-ը որպես զուգակցված հիմք է, իսկ երկրորդում՝ արդեն որպես զուգակցված թթու, իսկ SO42- իոնը կատարում է հիմքի դեր։ Հետևաբար, մասնիկի թթվայնությունը կախված է ոչ միայն իր, այլև այն մասնիկի հատկություններից, որոնք ընդունում են պրոտոն։ Դիտարկենք լուծույթում թույլ միահիմն թթվի դիսոցման պրոցեսը․

HA  H 2O  A  H 3O

C0 (1   )

C0 C0

Այդ դեպքում դիսոցման հաստատունը կընդունի հետևյալ տեսքը․

Ka 

C A  C H  f A  f H  a 2 C 0 2   f CHA f HA 1 

Բավականին նոսր ջրային լուծույթների դեպքում

(30)

f HA

չեզոք մո-

լեկուլի ակտիվության գործակիցն ընդունվում է հավասար 1-ի, f± միջին իոնային ակտիվության գործակիցը կարելի է հաշվարկել օգտագործելով Դեբայ-Հյուկելի բանաձևը։ Դիսոցման աստիճանը որոշվում է սպեկտրասկոպիկ տվյալներից։ Քանի որ ջուրը և H3O+-ը չեն կլանում լույս սպեկտրի տեսանելի և մոտակա ուլտրամանուշակագույն տիրույթներում, ուստի ալիքի երկարության տվյալ միջակայքում լուծույթի օպտիկական խտությունը կորոշվի միայն թթվի մոլեկուլների և թթվային մնացորդի անիոնների կլանմամբ․

A  l  ( HAC HA   A C A )

(31)

(31)-ը ձևափոխելով ստացվում է՝

A  l  C0 ( HA    ( A   HA ))

(32)

որը ցույց է տալիս, որ լուծույթի օպտիկական խտությունը ֆունկցիա է թույլ թթվի դիսոցման աստիճանից և, հետևաբար, կախված է միջավայրի pH-ից։ Ուժեղ թթուների ավելացման դեպքում հավասարակշռությունը տեղաշարժվում է ձախ, իսկ ուժեղ հիմքերի ավելացման դեպքում՝ աջ։ Դա նշանակում է, որ հետազոտելով լուծույթի կլանումը բավական թթու միջավայրում կարելի է ստանալ թթվի չդիսոցված մոլեկուլների սպեկտրը (α=0), իսկ հիմնային միջավայրում կարելի է գրանցել թթվի անիոնների սպեկտրը (α=1)։ Դիսոցման աստիճանի կտրուկ փոփոխության անցումային միջակայքը (0<α<1) ընկած է pH-ի 2-3 միավորով փոփոխության տիրույթում։ pH-ի հետագա փոփոխության դեպքում դեպի ավելի մեծ և փոքր արժեքներ, ցանկացած ալիքի երկարության տակ օպտիկական խտությունը շատ քիչ է փոխվում՝ ընդունելով Aթթու և Aհիմք հաստատուն արժեքներ։ Իմանալով Aթթու և Aհիմք մեծությունները՝ կարելի է որոշել երկու ձևերի -ի արժեքները․

 HA  AÃÃáõ c 0  I  ,  A  AÑÇÙù c 0  I 

(33)

Տեղադրելով այս արժեքները (29)-ի մեջ՝ կարելի է ստանալ լուծույթում երկու ձևերի կոնցենտրացիաները։ Եթե բոլոր չափումները իրականացվում են օպտիկական շերտի նույն հաստությամբ կյուվետներում, HA թթվի դիսոցման աստիճանը կարելի է արտահայտել օպտիկական խտության մեծություններով․



c A c0



A  AÃÃáõ AÃÃáõ  AÑÇÙù

:

(34)

Սակայն, ջրում թույլ թթվի դիսոցման հաստատունի որոշումը (30)-ով և (34)-ով հաճախ բերում է ոչ ճիշտ արդյունքների, որը պայմանավորված է լուծույթում առկա կողմնակի (այդ թվում ածխաթթուների) խառնուրդներով, որոնք հաճախ անտեսվում են։ Այս դժվարությունը շրջանցվում է, եթե չափումներն իրականացվում են հայտնի pH-ով բու- 41 -

ֆերային լուծույթներում։ Այս դեպքում դիսոցման հաստատունը ընդունում է հետևյալ տեսքը․

Ka 

  a   f 1 H

(35)

(35)-ի միջոցով հաշվարկի առավելությունն այն է, որ թթվի սկզբնական կոնցենտրացիան հաշվի չի առնվում։ Դիսոցման աստիճանը որոշվում է սպեկտրասկոպիկ տվյալներից, ջրածնի իոնների ակտիվությունը որոշվում է անկախ մեթոդով, իսկ թթվային մնացորդի անիոնի ակտիվության գործակիցը հաշվարկվում է Դեբայ-Հյուկելի բանաձևով․

lg f   

0.509 I c 1  Ic

(36)

I c  i Ci Z i2 , որտեղ Ic –ն լուծույթի իոնական ուժն է, որը լուծույթում գոյություն ունեցող բոլոր իոնների գումարն է, Ci և Zi-ն համապատասխանաբար իոնի մոլային կոնցենտրացիան և լիցքն են։ Սովորաբար բուֆերային լուծույթ առաջացնող նյութերի կոնցենտրացիաները զգալիորեն գերազանցում են հետազոտվող նյութերի կոնցենտրացիաները։ Օրինակ, քացախաթթվային բուֆերի իոնական ուժը կորոշվի հիմնականում նատրիումի ացետատի կոնցենտրացիայով։ Հաշվի առնելով, որ pH   lg aH  և լոգարիթմելով (35)-ը՝ կըստանանք վերջնական բանաձև, որը թույլ է տալիս հաշվարկել բուֆերային լուծույթում միահիմն թթվի դիսոցման հաստատունը․

lg K a  lg

  pH  lg f  1 

(37)

7.1. Դինիտրոֆենոլի դիսոցման հաստատունի որոշումը սպեկտրաֆոտոմետրիկ մեթոդով 2,4-դինիտրոֆենոլի (α-ԴՆՖ) կամ 2,6-դինիտրոֆենոլի (β-ԴՆՖ) լուծույթում տեղի ունեցող դիսոցման պրոցեսը կարելի է ներկայացնել հետևյալ կերպ․նոսր լուծույթների համար դիսոցման հաստատունը կապված է դիսոցման աստիճանի (α) և լուծույթի pH-ի հետ (37) հարաբերությամբ։ Դիսոցման աստիճանի արժեքը որոշվում է (34)-ով՝ հայտնի pH-ով բուֆերում ԴՆՖ-ի լուծույթի օպտիկական խտության չափում-

ներից։ Նույն լուծույթի համար (36)-ով որոշվում է f– ակտիվության գործակիցը։ Իմանալով նույն լուծույթի համար α, pH և f– արժեքները՝ կարելի է որոշել Kα դիսոցման հաստատունի մեծությունը, սակայն Kα-ի ճշգրիտ որոշման համար անհրաժեշտ է պահպա-նել հետևյալ պայմանները․ - Թթվային, հիմնային և բուֆերային լուծույթներում ԴՆՖ-ի կոնցենտրացիան պետք է այնպես ընտրել, որ բոլոր լուծույթների օպտիկական խտությունների առավելագույն արժեքները գտնվեն օգտագործվող սարքերի աշխատանքային միջակայքի սահմաններում (0.1<A<1.4): - Բոլոր օգտագործվող լուծույթները պետք է ունենան նույն իոնական ուժը, քանի որ հետազոտվող մասնիկների մարման մոլային գործակիցների արժեքները կարող են կախված լինել լուծույթի իոնական ուժից։ Ավելին, իոնական ուժի արժեքները չպետք է գերազանցեն 0.01 M, որպեսզի իոնների ակտիվության գործակիցների հաշվարկման ժամանակ հնարավոր լինի կիրառել Դեբայ-Հյուկելի բանաձևը։

- Բոլոր փորձերը պետք է կատարվեն միևնույն ջերմաստիճանային պայմաններում, քանի որ մարման մոլային գործակիցը կախված է ջերմաստիճանից։

Լաբորատոր աշխատանք 1 Աշխատանքի նպատակը - Սպեկտրի տեսանելի և ուլտրամանուշակագույն տիրույթներում տարբեր pH-ով α- և β-ԴՆՖ-ի լուծույթների կլանման սպեկտրների գրանցում: - α- և β-ԴՆՖ-ի թթվային և հիմնային վիճակների համար աշխատանքային ալիքի երկարությունների որոշում, իզոբեստիկ կետի հայտնաբերում: - Բուգեր-Լամբերտ-Բերի օրենքի ստուգում։ ԴՆՖ-ի թթվային և հիմնային ձևերի մարման մոլային գործակիցների որոշում: - ԴՆՖ-ի դիսոցման գործակիցների որոշում։

Փորձարարական մաս Լուծույթների պատրաստում Աշխատանքում օգտագործվել են հետևյալ լուծույթները․ - նախնական պատրաստի լուծույթներ, - բուֆերային լուծույթներ, - աշխատանքային լուծույթներ։ Նախնական պատրաստի ջրային լուծույթների կոնցենտրացիաները․ Լուծված նյութ

Կոնցենտրացիա, մոլ/լիտր

α- կամ β-ԴՆՖ

0,001

HCl

0,1

NaOH

0,1

CH3COOH

0,3

1-ին բուֆերային լուծույթը (բուֆեր 1) պատրաստում են 200մլ չափիչ փորձանոթում նատրիումի ացետատից և քացախաթթվից։ Բուֆեր 1-ը պետք է ունենա pH=4,3, եթե աշխատանքում օգտագործվում է αԴՆՖ, և pH=4,0, եթե օգտագործվում է β-ԴՆՖ։ Պատրաստի բուֆերային լուծույթում նատրիումի ացետատի կոնցենտրացիան պետք է լինի 0,02 M։ Քացախաթթվի՝ ACH-ի անհրաժեշտ քանակությունը հաշվարկում են Հենդերսոնի բանաձևով․

pH   lg K a ( AcH )  lg որտեղ

C ( AcNa ) C ( AcH )

,

(38)

K a ( AcH )  1.75 10 5 :

Բուֆեր 1-ի pH-ը կարգավորում են նատրիումի ացետատով կամ քացախաթթվով։ Բուֆեր 2-ը (pH=4,1 α-ԴՆՖ-ի համար, pH=3,8 β-ԴՆՖ-ի համար) պատրաստում են բուֆեր 1-ից՝ 50 մլ բաժակի մեջ վերջինիս վրա կաթիլկաթիլ ավելացնելով քացախաթթու։ pH-ի արժեքը կարգավորում են իոնոմերի միջոցով։ Բուֆեր 3-ը (pH=3,9 α-ԴՆՖ-ի համար, pH=3,6 β-ԴՆՖ-ի համար) պատրաստում են բուֆեր 1-ից՝ 50 մլ բաժակի մեջ, նույն ձևով։ Աշխատանքային լուծույթները պատրաստում են 50 մլ չափիչ փորձանոթներում։ α-ԴՆՖ-ի հետ աշխատելիս պատրաստում են հետևյալ լուծույթները․ Լուծույթի համար

0,001 M α-ԴՆՖ-ի

0,1 M թթվի կամ հիմքի

լուծույթ

լուծույթ

4.0 մլ

5 մլ HCl

2.0 մլ

5 մլ HCl

1.0 մլ

5 մլ HCl

4.0 մլ

5 մլ NaOH

2.0 մլ

5 մլ NaOH

1.0 մլ

5 մլ NaOH

0.5 մլ

5 մլ NaOH

4.0 մլ

25 մլ բուֆեր 1

4.0 մլ

25 մլ բուֆեր 2

4.0 մլ

25 մլ բուֆեր 3

β-ԴՆՖ-ի դեպքում պատրաստվում են նշված լուծույթները․ Լուծույթի

0,001 M β-ԴՆՖ-ի լուծույթ

0,1 M թթվի կամ հիմքի

համարը

լուծույթ

7.0 մլ

5 մլ HCl

3.0 մլ

5 մլ HCl

1.5 մլ

5 մլ HCl

7.0 մլ

5 մլ NaOH

3.0 մլ

5 մլ NaOH

1.5 մլ

5 մլ NaOH

1.0 մլ

5 մլ NaOH

7.0 մլ

25 մլ բուֆեր 1

7.0 մլ

25 մլ բուֆեր 2

7.0 մլ

25 մլ բուֆեր 3

Սպեկտրների գրանցումը α-ԴՆՖ-ի լուծույթի կլանման սպեկտրները գրանցում են 220-500 նմ մարզում, իսկ β-ԴՆՖ-ը՝ 300-550 նմ։ Այդ նպատակով օգտագործում են l=1սմ օպտիկական ուղի ունեցող կվարցե կյուվետներ։ Որպես ստուգիչ լուծույթ օգտագործում են թորած ջուր։ Անհրաժեշտ է ստանալ №1, 4, 8-10 լուծույթների կլանման սպեկտրները։ Ինդիկատորի յուրաքանչյուր ձևի համար որոշում են աշխատանքային ալիքի երկարությունները (λ1 և λ2) և օպտիկական խտությունը` Aλi։ Գտնում են իզոբեստիկ կետը, որոշում են այն բնութագրող մեծությունները (λ, ε)։

Այնուհետև ստանում են № 2, 3, 5-7 լուծույթների սպեկտրները։ Որոշում են ԴՆՖ-ի պրոտոնացված և դեպրոտոնացված ձևերի օպտիկական խտությունները (Aλ)։ Ստուգում են Բուգեր-Լամբերտ-Բերի օրենքը։ Դրա համար կառուցում են Aλ-ի ԴՆՖ-ի կոնցենտրացիայից կախման կորերը թթվային և հիմնային լուծույթների համար։ Հաշվարկում են ինդիկատորի յուրաքանչյուր ձևի ε էքստինկցիայի գործակիցը, և նրա որոշման միջին քառակուսային սխալը՝ σn։ Եթե ունենք տարբեր l (0.2 և 0.5 սմ) օպտիկական ուղիներով կվարցե կյուվետներ, ապա նրանցով հանում են ԴՆՖ-ի №1 կամ №4 լուծույթների կլանման սպեկտրները և կառուցում են Aλ-ի l-ից կախվածության կորը։ Ստուգում են Բուգեր-Լամբերտ-Բերի օրենքը։ ԴՆՖ-ի դիսոցման հաստատունի հաշվարկը կատարվում է (38) բանաձևով, Kα-ի արժեքները համեմատում են տեղեկատուի տվյալների հետ։

7.2. ՄԵԹԻԼԵՆ ՆԱՐՆՋԱԳՈՒՅՆԻ ԴԻՍՈՑՄԱՆ ՀԱՍՏԱՏՈՒՆԻ

ՈՐՈՇՈՒՄԸ

Լաբորատոր աշխատանք 2 Տվյալ աշխատանքում հետազոտվում է մեթիլեն նարնջագույնի (4՛-դիմեթիլամինոազաբենզոլ-4-սուլֆոթթվի նատրիումական աղ) լուծույթում թթվահիմնային հավասարակշռությունը։ Լուծույթում այս ինդիկատորի դիսոցման պրոցեսը պայմանավորված է նրանով, որ մեթիլեն նարնջագույնը դասվում է ամֆոտեր ինդիկատորների թվին, քանի որ դրա մոլեկուլը միաժամանակ պարունակում է թթվային և հիմնային խմբեր։ Այս մոլեկուլի թթվահիմնային դիսոցումն ուղեկցվում է ցիստրանս իզոմերների անցմամբ։ Բավականին նոսր լուծույթների դեպքում դիսոցման հաստատունը կապված է դրա α դիսոցման աստիճանի և լուծույթի pH-ի հետ (38) հարաբերությամբ։ Դիսոցման աստիճանի արժեքը գտնում են հայտնի pH-ով բուֆերում ինդիկատորների լուծույթների օպտիկական խտությունների չափումներից (34)-ով։

Նույն լուծույթի համար Դեբայ-Հյուկելի բանաձևով որոշվում է f– ակտիվության գործակիցը։ Իմանալով նույն լուծույթի α-ն, pH-ը և f–ը՝ կարելի է որոշել Kα դիսոցման հաստատունի արժեքը։

Սակայն Kα-ի ճշգրիտ արժեքի որոշման համար անհրաժեշտ է ապահովել հետևյալ պայմանները. - Թթվային, հիմնային և բուֆերային լուծույթներում ինդիկատորի կոնցենտրացիան պետք է այնպես ընտրել, որ օպտիկական խտությունների առավելագույն արժեքները գտնվեն օգտագործվող սարքերի աշխատանքային միջակայքում (0.1<D<1.4): - Բոլոր օգտագործվող լուծույթները պետք է ունենան միևնույն IC իոնական ուժը քանի որ հետազոտվող մասնիկների էքստինկցիայի գործակիցները կարող են կախված լինել լուծույթի իոնային ուժից։ Բացի այդ, IC-ի արժեքները չպետք է գերազանցեն 0.01 M, որպեսզի իոնների ակտիվության գործակիցների հաշվարկի համար հնարավոր լինի օգտագործել Դեբայ-Հյուկելի բանաձևը։ - Բոլոր փորձերը պետք է կատարվեն միևնույն ջերմաստիճանային պայմաններում, քանի որ էքստինկցիայի գործակիցը կախված է ջերմաստիճանից։

Լաբորատոր աշխատանքի նպատակը -

Սպեկտրի տեսանելի և ուլտրամանուշակագույն մարզում մեթիլեն նարնջագույնի տարբեր pH-ով լուծույթների կլանման սպեկտրերի գրանցում:

-

-

Հետազոտվող ինդիկատորի թթվային և հիմնային ձևերի համար աշխատանքային ալիքի երկարությունների որոշում, իզոբեստիկ կետի հայտնաբերում: Ընտրված ալիքի երկարությունների դեպքում ինդիկատորի թթվային և հիմնային ձևերի էքստինկցիաի գործակիցների որոշում:

-

Մեթիլեն նարնջագույնի դիսոցման հաստատունի որոշում։

Փորձնական մաս Աշխատանքում օգտագործում են հետևյալ լուծույթները․ - նախնական պատրաստի լուծույթներ, - բուֆերային լուծույթներ, - աշխատանքային լուծույթներ։ Նախնական պատրաստի ջրային լուծույթները պետք է լինեն հետևյալ կոնցենտրացիաների․ Լուծված նյութ

Կոնցենտրացիա

Մեթիլեն նարնջագույն

1 գ/լ

HCl

0.1 M

NaOH

0.1 M

CH3COOH

0.3 M

Ι բուֆերային լուծույթը (բուֆեր Ι) ունի pH=3.9 և պատրաստում են 200մլ չափիչ փորձանոթում նատրիումի ացետատից ու քացախաթթվից։ Պատրաստի բուֆերային լուծույթում նատրիումի ացետատի կոն-

ցենտրացիան պետք է լինի 0.02 M։ Քացախաթթվի՝ ACH, անհրաժեշտ քանակությունը հաշվարկում են Հենդերսոնի բանաձևով․

pH   lg K a ( AcH )  lg

C ( AcNa ) , C ( AcH )

(39)

որտեղ Ka(AcH)=1.75·10-5։ Բուֆեր Ι-ի pH-ը կարգավորում են նատրիումի ացետատով կամ քացախաթթվով։ Բուֆեր ΙΙ-ը (pH=3.7) և բուֆեր ΙΙΙ-ը (pH=3.5) պատրաստում են բուֆեր Ι-ից 50 մլ բաժակների մեջ՝ կաթիլկաթիլ ավելացնելով քացախաթթու։ pH-ի արժեքը կարգավորում են իոնոմերի միջոցով։ 0.2գ/լ կոնցենտրացիայով մեթիլեն նարնջագույնի լուծույթը պատրաստում են 50 մլ չափիչ փորձանոթի մեջ։ Այս լուծույթներից պատրաստում են աշխատանքային լուծույթները 50 մլ չափիչ փորձանոթներում․ Լուծույթի համար

Մեթիլեն նարնջագույնի

0.1 M թթվի կամ հիմքի

լուծույթ, 0,2գ/լ

լուծույթ

2.0 մլ

5 մլ HCl

1.5 մլ

5 մլ HCl

1.0 մլ

5 մլ HCl

0.5 մլ

5 մլ HCl

2.5 մլ

5 մլ NaOH

2.0 մլ

5 մլ NaOH

1.5 մլ

5 մլ NaOH

1.0 մլ

5 մլ NaOH

2.0 մլ

25 մլ բուֆեր Ι

2.0 մլ

25 մլ բուֆեր ΙΙ

2.0 մլ

25 մլ բուֆեր ΙΙΙ

Սպեկտրների գրանցում Ինդիկատորի պատրաստված լուծույթների կլանման սպեկտրները գրանցում են 300-600 նմ մարզում։ Այս նպատակով օգտագործում են l=1 սմ օպտիկական ուղի ունեցող կյուվետներ։ Որպես համեմատականության կամ ստուգիչ լուծույթ օգտագործում են թորած ջուր։ №1, 6, 9-11 լուծույթների կլանման սպեկտրներն են ստանում։ Ինդիկատորի յուրաքանչյուր ձևի համար որոշում են աշխատանքային ալիքի երկարությունները (λ1 և λ2) և օպտիկական խտությունը Aλi։ Գտնում են իզոբեստիկ կետը, որոշում են այն բնութագրող մեծությունները (λ, ε)։ Այնուհետև ստանում են №2-5, 7, 8 լուծույթների սպեկտրները։ Որոշում են ինդիկատորի պրոտոնացված և դեպրոտոնացված ձևերի Aλ օպտիկական խտությունները։ Ստուգում են Բուգեր-Լամբերտ-Բերի օրենքը։ Դրա համար կառուցում են Aλ-ի ինդիկատորի կոնցենտրացիայից կախման կորերը թթվային և հիմնային լուծույթների համար։ Հաշվարկում են ինդիկատորի յուրաքանչյուր ձևի ε էքստինկցիայի գործակիցը։ Եթե ունենք տարբեր l (0.2 և 0.5 սմ) օպտիկական ուղիներով կվարցե կյուվետներ, ապա նրանցով ստանում են №1 կամ №4 լուծույթների կլանման սպեկտրները և կառուցում են Aλ-ի l-ից կախվածության կորը։ Ստուգում են Բուգեր-Լամբերտ-Բերի օրենքը։ Մեթիլեն նարնջագույնի դիսոցման հաստատունի հաշվարկը (38) բանաձևով, բերված տեսական մասում, հաշվարկում են ինդիկատորի դիսոցման հաստատունի արժեքը։ Kα-ի արժեքները համեմատում են տեղեկատուի տվյալների հետ։

7.3. ԴՆԹ-ԼԻԳԱՆԴ ԿՈՄՊԼԵՔՍՆԵՐԻ pH ՏԻՏՐՈՒՄԸ:

pKa-Ի ՈՐՈՇՈՒՄԸ

Մոլեկուլային կենսաֆիզիկայի արդիական հիմնախնդիրներից են կենսամակրոմոլեկուլների, այդ թվում նաև ԴՆԹ-ի կառուցվածքի, դրա բազմաձևության և տարբեր արտաքին գործոնների ներքո նրա կոնֆորմացիոն անցումների, ինչպես նաև ԴՆԹ-ի հետ տարբեր մոլեկուլների կամ միացությունների՝ լիգանդների փոխազդեցության առանձնահատկությունների ուսումնասիրությունները: ԴՆԹ-ի կառուցվածքային փոխարկումները զգալիորեն կախված են նրա հետ լիգանդների (դեղանյութեր, հակաբիոտիկներ, սպիտակուցներ և այլն) կոմպլեքսագոյացումից: Ըստ ԴՆԹ-ի հետ փոխազդեցության առանձնահատկության ցածրամոլեկուլային միացությունները (մետաղների իոններ, սպիտակուցային բնույթի մոլեկուլներ և այլ օրգանական միացություններ) բաժանվում են երկու խմբի՝ կովալենտ և ոչ կովալենտ կապվող լիգանդներ: Ոչ կովալենտ եղանակով փոխազդող լիգանդները ԴՆԹ-ի հետ կապվում են դարձելիորեն, ուստի դրանք կարող են վերաբաշխվել կրկնակի պարույրի երկայնքով: Ընդ որում, լիգանդները փոխում են ԴՆԹ-ի կառուցվածքային փոխարկումների բնութագրերը այնպիսի կոնցենտրացիաների դեպքում, որոնք զգալիորեն փոքր են նուկլեինաթթվի կոնցենտրացիայից: Դարձելի կապվող լիգանդներին են պատկանում ծանր մետաղների իոնները (Cu, Fe, Ag), որոշ հակաբիոտիկներ (ակտինոմիցին, նետրոպսին), մի շարք սպիտակուցներ և այլն: Ընդհանրապես, դարձելի կապվող լիգանդների մեծ մասը կայունացնում են ԴՆԹ-ի երկպարույր կառուցվածքը: Կովալենտ եղանակով կապվող լիգանդները ամուր կապվում են ԴՆԹ-ի որոշակի հատվածում և այլևս չեն վերաբաշխվում մոլեկուլի երկայնքով: Այդպիսի լիգանդների թվին են պատկանում ԴՆԹ-ի ֆունկցիոնալ խմբերի տարբեր քիմիական մոդիֆիկատորները, ինչպես նաև մի շարք կենսաբանորեն ակտիվ մոլեկուլներ, մասնավորապես, պլատին կամ պալադիում պարունակող միացությունները: Դրանց թվին են

պատկանում նաև պոլիպեպտիդները, հիստոնային սպիտակուցները ցածր իոնական ուժի պայմաններում, քանի որ բարձր իոնական ուժերում վերջիններիս կապման բնույթը փոխվում է: Դարձելի կապվող լիգանդներն, ըստ փոխազդեցության հիմնական մեխանիզմի, բաժանվում են ինտերկալյատորների և ակոսում կապվող միացությունների, որոնք ներկայումս մեծ հետաքրքրություն են ներկայացնում: Վերջին տարիներին ստացված փորձարարական տվյալները վկայում են այն մասին, որ այս միացություններն իրականում ԴՆԹ-ի հետ կապվում են մեկից ավելի մեխանիզմներով, որոնց դրսևորումը կախված է միջավայրի տարբեր գործոններից՝ ջերմաստիճան, իոնական ուժ, pH և այլն: ԴՆԹ-ի հետ ինտերկալյատորների փոխազդեցության վերաբերյալ ավելի վաղ կատարված աշխատանքները բացահայտել են, որ իոնական ուժը էական ազդեցություն ունի ԴՆԹ-ի հետ լիգանդի կապման վրա, սակայն կապման վրա իոնական ուժի ազդեցության քանակական որոշման տեսություն գոյություն չուներ։ Իոնների կոնցենտրացիայի տեսությունը զարգացվել է Մաննինգի և Ռեկորդի աշխատանքներում, որը թույլ է տալիս պարզաբանելու իոնական ուժի էֆեկտները, ինչպես նաև նուկլեինաթթուների հետ լիգանդների փոխազդեցությունը։ Վիլսոնը և Լոպպը այս տեսությունը կիրառել են ինտերկալյատորների համար: Կոնդենսացիայի տեսության կիրառումը ինտերկալյացիայի համար պահանջում է հաշվի առնել ֆոսֆատ-ֆոսֆատ միջին հեռավորության մեծացումը (լիցքի խտության փոքրացումը) դեզօքսիռիբոզ-ֆոսֆատ շղթայի երկարությամբ, ինչը տեղի է ունենում հարևան զույգ հիմքերի միջև լիգանդի ներդրման հետևանքով։ Այս կոնֆորմացիոն փոփոխությունը նվազեցնում է ԴՆԹ-ի մեկ ֆոսֆատի հետ կոնդենսացված, ինչպես նաև Դեբայ-Հյուկելյան փոխազդեցությամբ կապված կատիոնների միջին քանակությունը, այսինքն տեղի է ունենում լիցքի խտության նվազում 0.88-ից մինչև 0.82՝ չհաշված լիգանդի լիցքը։ Նատրիումի իոնների ազդեցությունը ԴՆԹ-ի հետ ինտերկալյացիոն մեխանիզմով կապվող լիգանդների փոխազդեցության վրա կարող է բացատրվել քանակապես։ Քվինակրինի կապման վերլուծությունը ցույց է տալիս, որ

դիսոցվում են նատրիումի ավելի շատ իոններ, քան հաշվարկված էր տեսականորեն։ Դա հնարավոր է այն դեպքում, եթե քվինակրինը հրահրում է նատրիումի ավելի շատ իոնների դիսոցում, քան անհրաժեշտ է ԴՆԹ-ի ազոտային զույգի հետ դրանց կապման համար, կամ եթե ինտերկալյացիայի արդյունքում, կոնֆորմացիոն փոփոխությունների հետևանքով անջատվում են ավելի մեծ քանակությամբ նատրիումի իոններ, քան ենթադրվում էր։ Վերջինս կարող է տեղի ունենալ, եթե քվինակրինի մեկ մոլեկուլի ինտերկալյացիայի ժամանակ կրկնակի պարույրը երկարում է ավելի քան 3,4Å-ով և/կամ ԴՆԹ-ի մոլեկուլում առաջացնում է լրացուցիչ բեկում՝ թույլ կապման արդյունքում։ Մյուս կողմից, Na+-ի տարբեր կոնցենտրացիաների դեպքում փորձերի և հաշվարկների միջև ստացվող ոչ մեծ տարբերությունը կարող է պայմանավորված լինել տեսական ենթադրությունների սխալներով և անճշտություններով փորձարարական մեթոդներում, ինչպես նաև կապման տեսական մոդելների արդյունքների վերադրմամբ։ Լիգանդների ինտերկալյացիայի պրոցեսում իոնական ուժի ազդեցությունը պարզաբանելու համար որպես հիմնական պարամետր ծառայում է լիգանդի pKa-ն, քանի որ այն քանակապես կախված է լուծույթում առկա կատիոնների կոնցենտրացիայից։ Լիգանդի pKa-ի վարքի վերլուծության համար անհրաժեշտ է ինտերկալյացիոն այնպիսի հատված, որտեղ ազոտային զույգի հետ իոնի կապման ընթացքում չի առաջանում կոնֆորմացիոն փոփոխություն։ Դրա համար կիրառվում է այնպիսի ինտերկալյատոր, որը տիտրվում է ԴՆԹ-ի հետ pH-ի այնպիսի միջակայքում, որում ԴՆԹ-ն գտնվում է երկշղթա վիճակում։ Այդ դեպքում կոմպլեքսի պրոտոնացումը նույնն է, ինչ որ ԴՆԹ-ի հետ ցանկացած պարզ կատիոնի միացման պրոցեսը։ Համաձայն Վիլսոնի և Լոպպի, հետազոտվող ռեակցիան կունենա հետևյալ տեսքը․

D  L  H   D  L  H,

(40)

որտեղ D  L -ը ԴՆԹ-ինտերկալյատոր կոմպլեքսն է չպրոտոնացված  վիճակում, D  L  H -ը՝ նույն կոմպլեքսն է պրոտոնացված վիճակում։ Տվյալ բանաձևը նկարագրող թերմոդինամիկ հավասարումն ունի հետևյալ տեսքը․

D  L  (c*  Na  )  H   D  L  H   c*  Na 

(41)

որտեղ c*-ն ԴՆԹ-ի ինտերկալյացիոն կոնֆորմացիայում մեկ ֆոսֆատի վրա կոնդենսացված նատրիումի իոնների միջին թիվն է։ Տվյալ իոնական ուժի դեպքում (40)-ով նկարագրվող ռեակցիայի համար հավասարակշռության հաստատունը հանդիսանում է ԴՆԹ-լիգանդ կոմպլեքսից պրոտոնի դիսոցման հավասարակշռության հաստատունի (Ka) հակադարձ մեծությունը։ Կապված լիգանդի pKa-ի կախվածությունը նատրիումի իոնների կոնցենտրացիայից հետևյալն է․

  log K a pKa    * :    log[ Na ]  log[ Na ]

(42)

Քննարկվում է այնպիսի ինտերկալյատոր, որը չի առաջացնում կոնֆորմացիոն փոփոխություններ և ԴՆԹ-ի հետ չի փոխազդում կոոպերատիվորեն, ընդ որում այդ համակարգը հանդիսանում է ինտերկալյացիոն հատվածների համար որպես սպեցիֆիկ նմուշ, ուստի դա թույլ է տալիս անմիջապես չափել *-ը և այն համեմատել հաշվարկված տվյալների հետ, ինչը կապահովի իոն-կոնդենսացիայի տեսության փորձարկման համար անկախ մեթոդ, որը չի պահանջում ԴՆԹ-լիգանդ կոմպլեքսների նկարագրության որևէ այլ մոդել։ Ավելի վաղ կատարված աշխատանքներում ցույց էր տրված հակաիոնների կոնցենտրացիայի ազդեցությունը ԴՆԹ-ի հետ կապվող միացությունների pKa-ի սպեցիֆիկ արժեքների կամ ԴՆԹ-լիգանդ փոխազդեցության վրա pH-ի սպեցիֆիկ էֆեկտների վրա։ Այնուամենայնիվ, լիգանդի pKa-ի վրա լուծույթի իոնական ուժի ազդեցության բացահայտման համար առավել հետաքրքրական են ԴՆԹ-ի հետ դասական ինտերկալյատոր էթիդիումի բրոմիդի (ԷԲ) կամ նրա ածանցյալ միացության՝ 3,8-դիամի- 55 -

նո-6-ֆենիլ-ֆենանտրիդինի (ԴԱՖՖ) փոխազդեցության ուսումնասիրությունները pH-տիտրման միջոցով։

Br Դ ԱՖ Ֆ

ԷԲ

Լաբորատոր աշխատանք 3 Աշխատանքի նպատակը -

-

-

Սպեկտրի տեսանելի տիրույթում տարբեր pH-ով ԷԲ-ի և ԴՆԹ-ի հետ դրա կոմպլեքսների լուծույթների կլանման սպեկտրների գրանցում: ԷԲ-ի և ԴՆԹ-ի հետ դրա կոմպլեքսների թթվային վիճակների համար աշխատանքային ալիքի երկարությունների որոշում, իզոբեստիկ կետի հայտնաբերում: ԴՆԹ-ի հետ ԷԲ-ի ինտերկալյացիոն մեխանիզմով փոխազդեցության վրա իոնական ուժի ազդեցության որոշում, Լիգանդի pKa-ի որոշում։

Փորձարարական մաս Անհրաժեշտ լուծույթներ Աշխատանքում օգտագործում են հետևյալ լուծույթները. - հորթի ուրցագեղձի ԴՆԹ, ԷԲ (գերմաքուր), HCl (խիտ), NaCl, Na-ցիտրատ (քիմիապես մաքուր), - նախնական պատրաստի լուծույթներ, - 0.002; 0.004; 0,01; 0,02; 0,05 իոնական ուժերով լուծույթներ, - ԴՆԹ-ի և ԷԲ-ի աշխատանքային լուծույթներ։

Լուծույթի

Լուծույթի

համար

իոնական ուժը

0.002

0.004

0.01

0.02

0.05

pKa

ԷԲ-ի և ԴՆԹ-ի աշխատանքային լուծույթները պատրաստվում են 3մլ ծավալով, որոնց ավելացվում է էթիլենդիամինտետրաացետատ՝ 105 մոլ/լ կոնցենտրացիայով: pH-ի թթվային արժեքներ ստանալու համար ԷԲ-ԴՆԹ կոմպլեքսների աշխատանքային լուծույթներին ավելացվում է 0.1ն HCl-ի լուծույթ: ԴՆԹ-ի հետ լիգանդների փոխազդեցության վերլուծության համար պետք է հաշվի առնել ջրածնի իոնների ակտիվությունը՝ ( a H  որը չափվում է փորձնականորեն և որոշվում է հավասարակշռության հաստատունը՝ (Ka)).

(K a ) 

( D  L) aH   K a H  (D  L  H  )

:

(43)

 H  -ը ջրածնային իոնի ակտիվության գործակիցն է։ pKa-ի և Ka-ի հաշվարկված արժեքները համեմատական են ԴՆԹ-լիգանդ ասոցիացիայի համար որոշված հավասարակշռության գործակիցների հետ։ Տարբեր իոնական ուժերում լիգանդի կապման տիտրման ժամանակ պետք է ի հայտ գան իզոբեստիկ կետեր: Այդ կետերում կապված լիգանդի pKa-ի արժեքների հաշվարկման համար կլանման արդյունքներից որոշվում են մարման մոլային գործակիցները (էքստինկցիայի գործակիցները) և կառուցվում է pH-ի կախվածությունը log E  Ea  E  -ից ըստ․



H



H



pH  pK a  log

E  E

a

H

 EH  

,

(44)

որտեղ Ea-ն ԴՆԹ-ի հետ կապված լիգանդների իոնների էքստինկցիայի գործակիցն է, իսկ E H  -ը՝ ցանկացած pH-ի արժեքների դեպքում չափվող էքստինկցիայի գործակիցը։ pH5 արժեքների դեպքում տեղի է ունենում իզոբեստիկ կետի անհետացում, ինչը, ամենայն հավանականությամբ, պայմանավորված է ԷԲ-ի 8-րդ դիրքում ամինոխմբի պրոտոնացմամբ։ Ամինախմբերի պրոտոնացման համար pK-ն բավականին ցածր է (pK=2.4) ազատ լիգանդների դեպքում, ԴՆԹ-ի հետ միացումը կարող է մեծացնել pK-ի արժեքը նշված երկու լիգանդների համար, ուստի pH5 արժեքների դեպքում Ea և pKa արժեքները կարելի է հաշվարկել՝ օգտագործելով փորձարարական տվյալները ( E H  և pH արժեքները) 5≤pH≤10 սահմաններում: pH5 արժեքների դեպքում իզոբեստիկ կետի անհետացման մյուս պատճառը կարող է լինել ԴՆԹ-ի բնափոխումը։ Սակայն 260նմ-ում սպեկտրալ վերլուծությունը ցույց է տալիս, որ ԴՆԹ-ն գրեթե չի բնափոխվում pH4 արժեքների դեպքում։ Ուստի pKa-ի որոշման համար նպատակահարմար է հետազոտությունները իրականացնել pH5 դեպքում, քանի որ 0.02≤[Na+]≤1,0 պայմաններում կլանման սպեկտրների վրա առկա է իզոբեստիկ կետ։ Հարկ է նշել, որ լիգանդի կոնցենտրացիան միշտ փոքր է նատրիումի իոնների կոնցենտրացիայից, ուստի ԴՆԹ-ի հետ կապման արդյունքում նատրիումի ազատ իոնների կոնցենտրացիայի զգալի փոփոխություններ գրեթե տեղի չեն ունենում։

7.4. ՍՊԻՏԱԿՈՒՑՆԵՐԻ pH-ՏԻՏՐՄԱՆ

ՈՒՍՈՒՄՆԱՍԻՐՈՒԹՅՈՒՆԸ

Սպիտակուցների կառուցվածքի ուսումնասիրություններում անհրաժեշտություն է առաջանում որոշել ամինաթթուների իոնացվող կողմնային խմբերից պրոտոնների դիսոցման pK-ի արժեքները։ Դա թույլ է տալիս որոշելու տվյալ ամինաթթվի տեղակայումը սպիտակու- 58 -

ցում, քանի որ որոշ ամինաթթուների դեպքում տեղի է ունենում λmax շեղում և ε-ի արժեքի փոփոխություն՝ կախված լուծիչի բևեռայնությու-

նից, ինչպես նաև pH-ից (նկ. 8)։ Նկար 8. Թիրոզինի կլանման սպեկտրները pH=6 և pH=13 արժեքների դեպքում:

Նման դեպքերում սպիտակուցի կլանման սպեկտրները փոփոխության են ենթարկվում։ Դա հիմնականում պայմանավորված է թիրոզինի կլանման բնութագրերի փոփոխությամբ։ Մասնավորապես, եթե թիրոզինը գտնվում է սպիտակուցի մակերևույթին և pH-ի արժեքների մեծացմանը զուգընթաց իոնացվում է, ապա սպիտակուցի կլանման սպեկտրը շեղվում է դեպի ազատ թիրոզինի սպեկտրը (նկ. 9)։ Եթե թիրոզինային մնացորդները գտնվում են սպիտակուցի մոլեկուլի ներսում ոչ բևեռային միջավայրում (հիդրոֆոբ միջուկ), ապա սպիտակուցի և ազատ թիրոզինի կլանման սպեկտրները շեղված են մնում իրարից՝ pHի փոփոխության դեպքում։ Հետևաբար, կլանման կորի միջնակետից տարված ուղղահայացի միջոցով կարելի է որոշել թիրոզինի pK-ի արժեքը տվյալ սպիտակուցում։

Նկար 9. Թիրոզինի տիտրման կորերը 295-ի դեպքում: Վարկածային սպիտակուցը պարունակում է թիրոզինային 5 մնացորդ: Ա – բոլոր 5 մնացորդները մակերեսային բաշխվածություն ունեն, Բ – 2 մնացորդ ունի մակերեսային բաշխվածություն, իսկ 3-ը՝ ներքին, ոչ բևեռային միջավայրում են տեղավորված և հետևաբար չեն տիտրվում, Գ – 3 ներքին մնացորդները գտնվում են բևեռային միջավայրում և հասանելի են լուծիչին:

Լաբորատոր աշխատանք 4 Աշխատանքի նպատակը -

Ստանալ թիրոզինի կլանման սպեկտրները pH=6 և pH=13 արժեքների դեպքում: Ստանալ սպիտակուցի կլանման սպեկտրը pH-ի թթվային և հիմնային արժեքների տիրույթներում: Որոշել սպիտակուցի pK-ի արժեքներրը pH-ի թթվային և հիմնային տիրույթներում:

-

Որոշել թիրոզինի մնացորդների հնարավոր տեղակայումը սպիտակուցի մոլեկուլում։

Աշխատանքի համար օգտագործել են հետևյալ լուծույթները․ - մարդու արյան շիճուկային ալբումին, - թիրոզին, - HCl (խիտ) NaOH, - նախնական պատրաստի լուծույթներ: Սպիտակուցի և թիրոզինի աշխատանքային լուծույթները պատրաստվում են 3մլ ծավալով: pH-ի թթվային և հիմնային արժեքներ ստանալու համար սպիտակուցի և թիրոզինի աշխատանքային լուծույթներին ավելացվում է 0.1ն HCl-ի լուծույթ և սպեկտրաֆոտոմետրի միջոցով ստացվում է դրանց կլանման սպեկտրը ալիքի երկարության փոփոխության 220≤≤300 նմ տիրույթում: Այնուհետև կառուցվում է կլանման կախվածության կորը pH-ի փոփոխության թթվային և հիմնային տիրույթներում: Այդ կորից pH-ի առանցքին տարված ուղղահայացի միջոցով որոշվում է թիրոզինի և սպիտակուցի pK-ի արժեքները:

ԳՐԱԿԱՆՈՒԹՅԱՆ ՑԱՆԿ

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.

Վարդևանյան Պ.Հ., Նուկլեինաթթուների կենսաֆիզիկա: Բուհական ուսումնական ձեռնարկ, Հայրապետ հրատ., Երևան, 2010, 212 էջ: Кантор У., Шиммел П., Биофизическая химия. В 3-х кн. М.: Мир. 1985. Маршелл Э., Биофизическая химия. В 2-х кн. М.: Мир. 1981. Рубин А.Б. Биофизика. В 2-х кн. Учебник. 3-е изд. М.: Изд-во Московского госуниверситета и изд-во Наука. 2004. Фрайфелдер Д., Физическая биохимия. М.: Мир. 1980. Краткий справочник физико-химических величин // Под ред. А.А. Равделя, А.М. Пономаревой. СПБ.: Иван Федоров, 2003. Лурье Ю.Ю., Справочник по аналитической химии. М.: Химия, 1965. Индикаторы: В 2 т. Под ред. Э. Бишоп; Пер. С англ. И.В. Матвеевой. М,: Мир, 1976. Т. 1. Миронов И.В., Основы оптических методов анализа: Учеб. пособие. Новособ. гос. ун-т. Новосибирск, 1991. Практикум по физической химии. Под ред. И.В. Кудряшова. М.: Высш. Шк., 1986. Бахшиев Н.Г., Введение в молекулярную спектроскопию: Учеб. пособие. Л.: Изд-во ЛГУ, 1987. Браун Д. и др., Спектроскопия органических веществ. Д. Браун, А. Флой, М. Сейнзбери; Пер. с англ. А.А. Кирюшкина. М.: Мир, 1992. Лукьяненко С.В., // Спектр. М.: АСТ, 2002. Хольцбехер З., Дивиш Л., Крал М. и др., Органические реагенты в неорганическом анализе. Пер. с чеш. З.З. Высоцкого. М.: Мир, 1979.

Պ.Հ.Վարդևանյան, Ա.Պ.Անտոնյան, Մ.Ա.Փարսադանյան

ՄՈԼԵԿՈՒԼԱՅԻՆ ԿԵՆՍԱՖԻԶԻԿԱՅԻ ԼԱԲՈՐԱՏՈՐ

ԱՇԽԱՏԱՆՔՆԵՐԻ ՈՒՍՈՒՄՆԱՄԵԹՈԴԱԿԱՆ ՁԵՌՆԱՐԿ

ՄԱՍ 2

ՄԱԿՐՈՄՈԼԵԿՈՒԼՆԵՐԻ ՀԵՏ ԼԻԳԱՆԴՆԵՐԻ ԿՈՄՊԼԵՔՍՆԵՐԻ

pK-ի ՈՐՈՇՈՒՄԸ: ԹԹՎԱՀԻՄՆԱՅԻՆ ՀԱՎԱՍԱՐԱԿՇՌՈՒԹՅԱՆ

ՎԵՐԼՈՒԾՈՒԹՅՈՒՆԸ ՍՊԵԿՏՐԱՖՈՏՈՄԵՏՐԻԱՅԻ ՄԵԹՈԴՈՎ

гٳϳñ·ã³ÛÇÝ Ó¨³íáñáõÙÁª Î. â³É³µÛ³ÝÇ Î³½ÙÇ Ó¨³íáñáõÙÁª ². êï»÷³ÝÛ³ÝÇ Ðñ³ï. ëñµ³·ñáõÙÁª È. ÐáíѳÝÝÇëÛ³ÝÇ

â³÷ëÁª 60x84 1/16: îå. Ù³ÙáõÉ 4: îå³ù³Ý³ÏÁª 100 ûñÇݳÏ:

ºäÐ Ññ³ï³ñ³ÏãáõÃÛáõÝ ù. ºñ¨³Ý, 0025, ²É»ù سÝáõÏÛ³Ý 1