Նուլեինաթթուների հետազոտման մեթոդները և տեխնոլոգիաները

ՄԵԼՔՈՆՅԱՆ Լ.Մ.

ՄՈՎՍԻՍՅԱՆ Ի.Ռ.

ՎԱՐԴԱՆՅԱՆ Մ.Վ.

ՆՈՒԿԼԵԻՆԱԹԹՈՒՆԵՐԻ

ՀԵՏԱԶՈՏՄԱՆ ՄԵԹՈԴՆԵՐԸ

ԵՎ ՏԵԽՆՈԼՈԳԻԱՆԵՐԸ

ՈՒՍՈՒՄՆԱԿԱՆ ՁԵՌՆԱՐԿ

ԵՐԵՎԱՆ ՀԱԱՀ

ՀՏԴ 577.113(07) ԳՄԴ 28.072.511.2ց7 Մ 537

Երաշխավորվել է հրատարակության ՀԱԱՀ գիտական խորհրդի կողմից Գրախոսներ՝ կ.գ.թ., դոց. Դ.Ս. Բալասանյան ք.գ.թ., Ա. Ավագյան Խմբագիր՝ Ս.Ռ. Պետրոսյան

Մ 537

ՄԵԼՔՈՆՅԱՆ ԼՅՈՒԴԱ ՄՀԵՐԻ

Նուկլեինաթթուների հետազոտման մեթոդները և տեխնոլոգիաները: Ուսումնական ձեռնարկ / Լ.Մ. Մելքոնյան, Ի.Ռ. Մովսիսյան, Մ. Վ. Վարդանյան. - Եր.: ՀԱԱՀ, 2024. - 618 էջ: Ուսումնական ձեռնարկում ներկայացված են մոլեկուլային գենետիկայի բնագավառում կիրառվող նուկլեինաթթուների անջատման, կրկնապատկման, մոլեկուլներրի կազմի, կառուցվածքի, ֆունկցիաների և էքսպրեսիայի մեխանիզմների հետազոտմանը ուղղված ժամանակակից մեթոդները և տեխնոլոգիաները, դրանց տեսական հիմունքները: Ձեռնարկը նախատեսված է անասնաբուժական, անասնաբուծական և ագրոնոմիական մասնագիտությունների ուսանողների, մագիստրանտների, ասպիրանտների համար: ՀՏԴ 577.113(07) ԳՄԴ 28.072.511.2ց7

ISBN 978-9939-77-186-1

© © © ©

Մելքոնյան Լ. Մ., 2024 թ. Մովսիսյան Ի. Ռ., 2024 թ. Վարդանյան Մ. Վ., 2024 թ. Հայաստանի ազգային ագրարային համալսարան, 2024 թ. Ստորագրված է հրատարակման 07.02.2024 թ. ՀԱԱՀ գրադարանի էլ. կայք http://library.anau.am

ՆԵՐԱԾՈՒԹՅՈՒՆ

ՄՈԼԵԿՈՒԼԱՅԻՆ ԳԵՆԵՏԻԿԱՅԻ ԽՆԴԻՐՆԵՐԸ ԵՎ ՄԵԹՈԴՆԵՐԸ

Նուկլեինաթթուները գենետիկական ինֆորմացիա կրող գործոններ են ու ապահովում են կյանքի կարևորագույն ֆունկցիաների՝ բազմացման և կենսագործունեության իրականացումը: Հիմնարար կենսաբանական գործընթացները՝ հատկանիշների փոխանցումը սերնդեսերունդ, օրգանիզմների աճը, զարգացումը, տարատեսակումը իրականացվում են ՆԹ-ների և ամենակարևորը՝ ԴՆԹ-ների անմիջական մասնակցությամբ: Ավելին, վերջին տարիների հետազոտությունների արդյունքներով առաջարկվել է վարկած ՆԹ-ների մասնակցության մասին հիշողության պրոցեսներին: Նուկլեինաթթուների կազմակառուցվածքային փոփոխությունները էվոլյուցիոն զարգացման կարևոր գործոն են և մորֆոլոգիական ու ֆունկցիոնալ շեղումների պատճառ: Ուստի օրգանիզմներում տեղի ունեցող պրոցեսների նորմալ կամ պաթոլոգիկ ընթացքը պայմանավորված է ՆԹ-ների կազմի և գործունեության ճշգրտությամբ: ՆԹ-ները, լինելով բոլոր տեսակի կենսաբանական պրոցեսների առաջացման և կատարման հիմք, դառնում են կենսաբանական հետազոտությունների ամենահուսալի օբյեկտը՝ այն առաջնային աղբյուրը, որի ուսումնասիրությունը թույլ է տալիս ոչ միայն ծանոթանալ կենսաբանական երևութների ընթացքին և օրինաչափություններին, կազմակառուցվածքային փոփոխություններին, այլև բացահայտել դրանց շեղումների ձևավորման մեխանիզմները, մշակել դրանց կարգավորմանն ուղղված տեխնոլոգիաները: Արդեն 20-րդ դարի վերջին տասնամյակներում հետազոտական տեխնոլոգիաների զարգացման շնորհիվ, աշխարհի առաջադեմ երկրների կառավարությունների օժանդակությամբ և ֆինանսավորմամբ, սկիզբ դրվեց միջազգային գենետիկական ծրագրի, որի նպատակն էր մարդու գենոմը կազմող ԴՆԹ-ների նուկլեոտիդային հերթականությունների որոշումը (The Human Genome Project, HGP): Այդ ժամանակ արդեն հասկանալի էր, որ հիվանդությունների առաջացման, ձևավորման և հաղթահարման բազմաթիվ մեխանիզմները պայմանավորված

են ԴՆԹ-ի կազմով և ակտիվությամբ, այսինքն՝ նուկլեոտիդային հերթականության մեջ գրանցված ժառանգական ինֆորմացիայով: «Գենոմ» ծրագիրը կոչված էր լուծել առողջապահության հարցերը, ապահովել բժշկագիտության և անասնաբուժության խնդիրների ճշգրիտ և հիմնավորված լուծումը: Հետազոտության արդյունքներն իսկապես մեծ հնարավորություններ բացեցին գենետիկական և առողջապահական հետազոտությունների համար, բայց և առաջարկեցին նոր, անսպասելի խնդիրներ և պրոբլեմներ: Դրանց անդրադառնալու նպատակով «Մարդու գենոմ» ծրագրի ավարտից հետո՝ 2003 թվականին, 32 լաբորատորիաներում մոտ 400 գիտնականներից կազմված միջազգային խումբը ձեռնարկեց նոր ծրագիր, որը կոչվեց ENCODE - ԴՆԹ-ի տարրերի հանրագիտարան: Ծրագրի խնդիրն էր բացահայտել ԴՆԹ-ի կազմում բոլոր իմաստային հերթականությունները, այսինքն՝ գտնել ԴՆԹ-ի բոլոր հատվածների կենսաքիմիական կամ այլ ֆունկցիաները: Ծրագրի աշխատանքները շարունակվեցին ավելի քան 10 տարի: Այդ ընթացքում ստացված տվյալները սկզբունքորեն փոխեցին գենետիկայի գիտական պատկերը, բացահայտեցին ժառանգական ինֆորմացիայի գրանցման, ընթերցման և իրականացման մեխանիզմների բարդագույն յուրահատկությունները միաբջիջ և բազմաբջիջ օրգանիզմներում: Ծրագրի ղեկավար Յուան Բյորնիի (Ewan Birny) կարծիքով՝ աշխատանքները դեռ պետք է շարունակվեն, քանի որ անհրաժեշտ է ավելի մանրամասն հետազոտել ինչպես տարբեր տեսակների գենոմների առանձին տարրերի, այնպես էլ դրանց փոխկապակցված գործունեության դերն օրգանիզմների բազմացման և կենսագործունեության պրոցեսում: Նշենք, որ կատարվող հետազոտությունները պարզաբանում են նաև երկրագնդի վրա կյանքի առաջացման և էվոլյուցիոն զարգացման մեխանիզմները, բացահայտում տաքսոնների, ընտանիքների, ցեղերի ու տեսակների առաջացման մոլեկուլային հիմքերը: Կատարվող աշխատանքները մեծ նշանակություն ունեն նաև բժշկագիտության և անասնաբուժության համար, քանի որ օգնում են առավել ճշգրիտ հասկանալ հիվանդությունների առաջացման պատ4

ճառները և առաջարկել դրանց հաղթահարման ավելի նուրբ, նպատակաուղղված եղանակներ: Այսօր արդեն հետազոտված են բազմաթիվ տեսակների գենոմներ, կազմված են դրանց գենային պատկերները, կատարվում են համեմատական հետազոտություններ տարբեր խմբերի գենոմների կառուցվածքային և ֆունկցիոնալ տարրերի նմանությունների ու տարբերությունների բացահայտման ուղղությամբ: ՆԹ-ների հետազոտություններում ստացված գիտելիքները ունեն ինչպես տեսական, այնպես էլ կիրառական մեծ նշանակություն և մնում են ակտուալ: Նուկլեինաթթուների հետազոտման, դրանց նուկլեոտիդային հերթականության և դրա փոփոխությունների բացահայտման համար օգտագործվող մեթոդները բազմաթիվ են ու բազմազան: Հետազոտական այս մեթոդների համալիրը մոլեկուլային գենետիկայի հիմքն է: Դրա շնորհիվ ձևավորվել է կենսաբանական նոր բնագավառ՝ մոլեկուլային կենսաբանությունը: Նշենք, որ կիրառվող մեթոդները շարունակաբար բարելավվում են, ճշգրտվում, առաջանում են ուսումնասիրությունների նոր տեխնոլոգիաներ, եղանակներ և ուղղություններ: Դրանցից առավել տարածված են էլեկտրաֆորեզը, ՊՇՌ-ն, սեկվենացիայի եղանակը, մոլեկուլային հիբրիդացման մեթոդը, տարատեսակ գունավորման մեթոդները: Հետազոտությունների կատարման ճշգրտության և արդյունավետության մակարդակի բարձրացման, նմուշների մաքրության որակի և հետազոտության համար անհրաժեշտ քանակի ստացման նպատակով մշակվել են ՆԹ-ների անջատման և մաքրման մի շարք եղանակներ: Դրանք հիմնվում են ֆիզիկաքիմիական և կենսաբանական մեթոդների վրա և թույլ են տալիս անջատել ժառանգական նյութը բջիջների կազմից, նախապատրաստել հետագա գենետիկական և բժշկաբանական հետազոտությունների համար: Առաջարկվող ձեռնարկի խնդիրն է ծանոթացնել երիտասարդ մասնագետներին և ուսանողներին հետազոտությունների խնդիրներին, սկզբունքներին, մոտեցումներին ու ներկայացնել ՆԹ-ների հետ աշխատանքի կատարման ժամանակակից մեթոդները:

Ինչպես նշում է Բ. Ռասելը, ճշգրիտ և արդյունավետ հետազոտության կատարման համար անհրաժեշտ է սկզբում որոշել հետազոտության խնդիրը, ապա ձևակերպել սպասվող արդյունքները բացատրող վարկածը, երրորդ փուլում կատարվող հետազոտության միջոցով ստուգել վարկածը և ապա անել եզրահանգում (https://s.naturalsciences.ru/pdf/2012/7/30.pdf): Այսօրինակ հետազոտությունը նախատեսում է վարկածի ստուգման համար կատարվող հետազոտության մեթոդների ճշգրիտ ընտրություն: Տեքստում բերվող հետազոտական մեթոդների մեկնաբանությունները բացատրում են օգտագործվող մեթոդների ճշգրիտ ընտրության հիմունքնները և դրանց համապատասխանությունը դրված խնդիրներին, օգնում կազմակերպել ուսումնասիրության ճշգրիտ իրականացում փորձերի բոլոր փուլերում: Ձեռնարկը ծանոթացնում է մոլեկուլային գենետիկայի մեթոդների տեսական հիմունքներին, ներկայացնում է փորձերի գործնական կատարման մեթոդները, նպաստում ուսանողների, մագիստրոսների և այլ երիտասարդ մասնագետների ավելի բարձր տեսական և գործնական պատրաստվածությանը՝ աշխատելու ժամանակակից հետազոտական կենտրոններում, ձեռնարկելու և կատարելու գիտականորեն հիմնավորված մասնագիտական ուսումնասիրություններ:

ԳԼՈՒԽ 1. ՆՈՒԿԼԵԻՆԱԹԹՈՒՆԵՐԻ ԱՆՋԱՏՄԱՆ

ՄԵԹՈԴՆԵՐԸ

ՆԹ-ների հետազոտման կարևոր փուլերից առաջինը նմուշից ԴՆԹ-ի անջատման գործընթացն է: Այս փուլը անհրաժեշտ է ամպլիֆիկացիայի, սեկվենացիայի, մոլեկուլային հիբրիդացման, նմուշում ԴՆԹ-ի քանակի որոշման և այլ հետազոտությունների կատարման համար, քանի որ ուսումնասիրություններում կիրառվող մեթոդների զգալի մասը պահանջում են ՆԹ-ների անջատված և մաքրված նմուշներ: ՆԹ-ների անջատման մեթոդի ընտրության ժամանակ պետք է հաշվի առնել և ՆԹ-ի առանձնահատկությունները, և փորձի ընթացքում առաջացող վտանգները, և ՆԹ-ների անջատված քանակի խտությունը, և միջավայրի ազդեցությունները, և նախապատրաստվող հետազոտության մեթոդական առանձնահատկությունները: ՆԹ-ների անջատման գործընթացը կապված է որոշակի դժվարությունների հետ, որոնք պայմանավորված են ԴՆԹ-ի կառուցվածքով, լոկալիզացիայով և ֆունկցիաներով: Առաջին հերթին պետք է քայքայել բջիջը և անջատել ԴՆԹ-ի մոլեկուլը քրոմատինի սպիտակուցային բաղադրիչներից՝ այնպես, որ հնարավորինս պահպանվի դրա ամբողջականությունը: ԴՆԹ-ի անջատման համար ընտրված մեթոդները պետք է կազմված լինեն մի քանի քայլերից. - բջջի քայքայում, -

ԴՆԹ-ի անջատում այլ տարրերից,

-

ստացված նմուշի խտության բարձրացում,

-

ինհիբիտորային բնույթի նյութերի հեռացում նմուշից:

Բացի դրանից՝ կարևոր է մեթոդների համապատասխանությունը մի շարք պայմանների. - փորձի պարզություն և բարձր արագություն, -

կոնտամինացիայի հնարավորության բացառում,

-

պրոցեսի ավտոմատացման հնարավորություն:

Ընդհանուր դեպքում ՆԹ-ների անջատման գործընթացը կազմված է մի քանի հաջորդական փուլերից. լիզիսի փուլ, որի ժամանակ քայքայվում են բոլոր բջջային թաղանթները, հեռացման փուլ, որի

ժամանակ դուրս են բերվում մակրոմասնիկներ` թաղանթների մնացորդները և օրգանելները, սպիտակուցների ապաակտիվացման և լուծույթից հեռացման փուլ, ՆԹ-ների խտության բարձրացման ու մաքրման փուլ: Նշենք նաև, որ կատարվող աշխատանքների կարևորագույն և դժվարհասանելի խնդիրը ԴՆԹ-ի մեծ գծային մոլեկուլների ամբողջականության պահպանումն է: ՆԹ-ների անջատման փուլերը իրականացվում են տարբեր մեթոդներով, բայց դրանց միայն մի մասն է ապահովում մաքրման բարձր մակարդակ, և շատ քչերը կարող են ենթարկվել ավտոմատացման: Կատարվող աշխատանքների ճշգրտության բարձր աստիճանի ապահովման համար անհրաժեշտ է ստացված նմուշներից հեռացնել բոլոր բջջային տարերը և կոնտամինացիա առաջացնող ու ՆԹ-ների ակտիվությունը արգելակող ինհիբիտորային բնույթի նյութերը: Ինհիբիտորային նյութերը բազմազան են. դրանց թվին են պատկանում ՆԹ-ների անջատման համար օգտագործվող ռեագենտները՝ էթանոլ, իզոպրոպանոլ, ֆենոլ, որոշ աղեր՝ նատրիումի ացետատ և քլորիդ, միզանյութ, սպիտակուցները՝ հեմոգլոբին, հեպարին, և այլն: Շատ կարևոր խնդիր է նաև ՆԹ-ների պաշտպանումը էնդոնուկլեազ՝ ՆԹ-ներ քայքայող ֆերմենտների ազդեցությունից: Հետազոտությունների նպատակների համաձայն՝ ՆԹ-ների անջատման և մաքրման համար կիրառվող մեթոդի ընտրությունը կատարվում է հետևյալ չափանիշներով. - թիրախ ՆԹ-ի տեսակը, -

նմուշի տեսակը, հյուսվածքը և այլն,

-

սպասվող արդյունքները՝ ստացված նմուշի որակը, մաքրության աստիճանը, մաքրման արագությունը,

-

ստացված նյութի օգտագործման նպատակային բնագավառի առանձնահատկությունները՝ ՊՇՌ, մոլեկուլային հիբրիդացում, կլոնավորում, ԴՆԹ-ի սինթեզ և այլն:

ՆԹ-ների անջատման և մաքրման ժամանակակից մեթոդներից մի քանիսը կներկայացվեն հաջորդ բաժնում:

1.1. ՆԹ-ՆԵՐԻ ԱՆՋԱՏՄԱՆ ՄԵԹՈԴՆԵՐԻ ԲՆՈՒԹԱԳԻՐԸ

ՆԹ-ների անջատման մեթոդները պայմանականորեն բաժանում են երկու խմբի՝ պատրաստուկային (պրեպարատիվ) և վերլուծական (անալիտիկ): Մեթոդները տարբերվում են նպատակային նյութի քանակով և համապատասխանորեն օգտագործվող ռեագենտների ծավալով: Ինչպես ասվել է, ՆԹ-ների անջատման մեթոդի ընտրությունը կախված է հետազոտությունում դրվող խնդրից, ստացվող նմուշի մաքրության աստիճանից և ստացման ժամկետներից: ՆԹների անջատման մեթոդները պետք է համապատասխանեն մի շարք պահանջների և ապահովեն՝ 1) կենսաբանական նյութի քայքայումը, 2)

ընտրողական ադսորբցիան՝ կլանումը,

3)

խտացումը մեծ ծավալներից,

4)

ՊՇՌ-ի ինհիբիտորների հեռացումը,

5)

ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի բաժանումը,

6)

ելքի բարձր տոկոսը,

7)

բաժանումն ըստ չափսերի և քաշի,

8)

կոնտամինացիայի բացառումը,

9)

պրոցեսի կարճատևությունը,

10) ավտոմատացման հնարավորությունը: ՆԹ-ների մաքրման եղանակները սովորաբար կազմվում են մի քանի ընդունված մեթոդների համադրման սկզբունքով և պայմանավորված են մոլեկուլների կազմակառուցվածքային և ֆիզիկաքիմիական առանձնահատկություններով: Այսօր օգտագործվող մեթոդները մեծ մասամբ հիմնվում են սորբցիայի տարատեսակների օգտագործման վրա և ներկայացված են նկար 1.1-ում:

նրթ-ներ,t, ան2 աl/lն ան ներորlներ,o

Նկ. 1.1. ՆԹ-ների անջատումը նմուշից սովորաբար կատարվում է նկարում բերված 7 մեթոդներով:

ԴՆԹ-ների անջատման մեթոդները, համաձայն օգտագործվող հինմական ֆիզիկական և կենսաքիմիական գործոնների, բաժանվում են երկու խմբի. 1. Հեղուկֆազային կամ դասական եղանակներ: 2. Պինդֆազային եղանակներ:

1.2. ՀԵՂՈՒԿՖԱԶԱՅԻՆ ՄԵԹՈԴՆԵՐ

Հեղուկֆազային մեթոդներն օգտագործվում են այն դեպքում, երբ անհրաժեշտ է ՆԹ-ները անջատել բարդ նմուշներից՝ արյան կամ հյուսվածքների կազմից: Լիզիսի կատարման մեթոդը կարող է կազմվել մի քանի տարբեր եղանակներից և բջջային կառույցների քայքայման համար լինել կոշտ, բայց միաժամանակ բավարար մեղմ ՆԹ-ների ամբողջականության պահպանման համար: Լիզիսը կատարվում է հետևյալ եղանակներով. 1. Ֆիզիկական՝ մեխանիկական մանրացում, հիպոտոնիկ քայքայում, ուլտրաձայնային հարված և այլն: 2. Քիմիական մշակում՝ բջջա- և կորիզաթաղանթի քայքայում դետերգենտների կիրառմամբ, քաոտրոպ ագենտների օգտագործմամբ կամ թիոլային վերականգնման եղանակով:

Թաղանթների քայքայման և բջջային սպիտակուցների դենատուրացիայի պրոցեսները հաճախ կատարվում են զուգահեռ: Օրինակ՝ նույն լուծույթը կարող է պարունակել բջջային և կորիզային մեմբրանը քայքայող դետերգենտներ և սպիտակուցները ապաակտիվացնող քաոտրոպ աղեր կամ ֆերմենտներ. այս դեպքում հաճախ օգտագործվում է նատրիումի դոդեցիլսուլֆատը: Դետերգենտի փոխազդեցությունը լիպիդային շերտի հետ կոչվում է մեմբրանի սոլյուբիզացում (նկ. 1.2): Որոշ դեպքերում քրոմատինի սպիտակուցների քայքայման համար կարող են օգտագործվել պրոտեազ ֆերմենտները: ԴՆԹ-ի հետ անջատվում է նաև ՌՆԹ-ն, որի հեռացման համար կիրառվում են ՌՆԹ-ազ խմբի ֆերմենտները:

բ ա Նկ. 1.2. ա - կորիզաթաղանթի լիպիդային շերտի կազմությունը, բ - լիպիդային երկշերտի և դետերգենտի փոխազդեցության և մեմբրանի ամբողջականության խախտման սխեման (М. Сомма):

Բջիջների մեխանիկական լիզիսից հետո նույնպես կատարում են սպիտակուցների ապաակտիվացում ֆերմենտի օգտագործմամբ, օրինակ՝ K պրոտեազով: Հաջորդ փուլում կատարվում է ՆԹ-ների մաքրում. հոմոգենատի բջջային տարրերը հեռացվում են ֆիլտրման, ցենտրիֆուգման կամ սորբցիայի եղանակով: 1.2.1. ՆԹ-ների անջատումը բջիջներից և հյուսվածքներից և բաժանումը թորամասերի դասական մեթոդներով 1. ՆԹ-ների անջատում Ֆենոլ/քլորոֆորմ համալիրի օգտագործման մեթոդով: Բջջի քայքայումից ստացված հոմոգենատից ԴՆԹ-ի անջատման համար օտար նյութերը՝ լիպիդները, շաքարները և սպիտակուցները, հեռացվում են առանձնացնող լուծույթների օգտա11

գործման միջոցով: Օրինակ՝ ֆենոլ/քլորոֆորմ խառնուրդը օգտագործվում է քրոմատինի սպիտակուցային մասի և բջջի այլ սպիտակուցների հեռացման համար: Ֆենոլ/քլորոֆորմ կամ որոշ դեպքերում էթանոլ նյութերի ազդեցությամբ ձևավորվում է երկֆազային համակարգ: Լիզատի մշակումը 1 մաս ֆենոլ/1 մաս քլորոֆորմ խառնուրդով կոչվում է Ֆենոլային էքստրակցիա: Փրփուրի առաջացումը արգելակելու համար հաճախ ավելացվում է իզոամիլային սպիրտ: pH≥7-8 պայմաններում ԴՆԹ-ն և ՌՆԹ-ն, լինելով բևեռավորված մոլեկուլներ, չեն լուծվում օրգանական լուծույթներում և առաջացնում են ինքնուրույն՝ ջրային թորամաս, իսկ շաքարները և լիպիդները լուծվում են օրգանական լուծույթներում և ձևավորում են երկրորդ՝ ստորին թորամասը (նկ. 1.3): Տրայt,G ,lրագա ../. կ

~

-

նDNՃ+ RNՃ)

'

{ Ո 2 _1...: 1 ... \' ,

tlt,ա,lրագայt,G 2tրո k,g ~ - ~ - - ( 1ոծկած Ulկt,ոաljոց)

-

'-

\'"'~._! Բ2t,2Gt.րt, t!'Ulllf1ակlll

'.եtGո1

9.11ա1t,ն .'jրագան ան2աոոնl ցtնո11t,.'jրոգtlան հաtlար1

'.եեGո1t, հեո iնարGոր'lti ՀlL.աljորոtl

Նկ. 1.3. ՆԹ-ների անջատում ֆենոլի օգտագործման եղանակով (Г. Кулмамабетова, 2012):

Սպիտակուցները առաջացնում են երկու թորամասերը բաժանող սպիտակ շերտ: ԴՆԹ-ի լրիվ անջատմանը քրոմատինի սպիտակուցներից նպաստում է պրոտեազների և նատրիումի գերքլորատի օգտագործումը: ՆԹ-ներ պարունակող թորամասը առանձնացվում է, և ԴՆԹ-ն իջեցվում է նստվածք էթանոլի լուծույթով: Ցենտրիֆուգումից հետո ԴՆԹ պարունակող նստվածքը նորից լուծում են էթանոլում և ցենտրիֆուգում՝ ԴՆԹ-ի մաքուր նմուշներ ստանալու համար: Սուպերնատանտը հեռացվում է և ՆԹ-ների նստվածքը բարձր խտության լուծույթ ստանալու նպատակով լուծում բուֆերի փոքր ծավալում:

ՆԹ-ների խտության բարձրացման համար օգտագործում են նաև իզոպրոպանոլ: Եթե նմուշում ՆԹ-ների խտությունը շատ ցածր է, հաճախ ավելացնում են պրեցիպիտացիայի արդյունավետությունը բարձրացնող չեզոք նյութ, օրինակ՝ գլիկոգեն: ՆԹ-ների խտության բարձրացման համար կարող են օգտագործվել նաև բարձր խտության աղեր, որոշ դեպքերում սպիտակուցները իջեցվում են նստվածք pH-ի փոփոխման միջոցով: Այս մեթոդի թերություններից է ավտոմատացված պրոցեսի ստեղծմանը խոչընդոտող թունավոր նյութերի՝ ֆենոլ/քլորոֆորմի օգտագործումը և ուլտրացենտրիֆուգումը: ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի անջատման այն մեթոդները, որոնցում բացակայում է ցենտրիֆուգման փուլը, ավելի հարմար են նաև այն պատճառով, որ այս դեպքում օգտագործվող ֆենոլը ազդում է նաև որպես ուժգին ապրոտեինացնող գործոն և ոչ միայն քայքայում է բջջաթաղանթները, այլ և բնափոխում սպիտակուցները: Օրգանիկ լուծույթներով ՆԹ-ների անջատման մեթոդի առավելություններն են բարձր որակի և խտության նմուշների ստացումը, տարբեր նմուշների հետազոտման հնարավորությունը, ստացված ՆԹների կայունությունը և երկարատև պահման հնարավորությունը: Մեթոդի թերություններն են տոքսիկության բարձր մակարդակը, ինհիբիտորների ոչ լրիվ հեռացումը, կոնտամինացիայի հնարավորությունը, երկարատևությունը և, ինչպես արդեն նշել ենք ավտոմատացման դժվարությունը: 1.2.2. ԴՆԹ-ի անջատման Պ. Կրիգի մեթոդը Պ. Կրիգը համահեղինակների հետ միասին առաջարկում է անջատել բարձրամոլեկուլային ԴՆԹ լիզիսի, էքստրակցիայի և էթանոլային պրեցիպիտացիայի միջոցով: Այս եղանակով ՆԹ-ների անջատումը տևում է 2 ժամ: ԴՆԹ-ի հետ միասին հաճախ անջատվում է և ՌՆԹ-ի որոշ քանակ: Դրանից ազատվելու համար օգտագործվում է ՌՆԹ-ազ ֆերմենտը: Եթե անհրաժեշտ է առանձնացնել ՌՆԹ-ն, ԴՆԹ-ի հեռացումը

կատարում են լիտիումի քլորիդի հետ սելեկտիվ ինկուբացիայի միջոցով, կամ յուրահատուկ ոչնուկլեազային մեկուսացում գուանիդինքլորիդի կամ գուանիդինթիոցիանատի օգտագործմամբ, որոնց հաջորդում է օրգանիկ լուծույթների՝ ֆենոլի կամ էթանոլի կիրառման փուլը: Հաշվի առնելով ԴՆԹ-ի մոլեկուլային առանձնահատկությունները և այն հանգամանքը, որ նմուշում կարող են լինել նուկլեազ ֆերմենտներ, անջատված նմուշը անհրաժեշտ է պահել սառեցված վիճակում՝ - 56օ-ից ոչ բարձր պայմաններում, խուսափելով դրա բյուրեղացման հնարավորությունից, որը առաջացնում է գծային մոլեկուլի մասնատում: Սառեցման համար օգտագործվում են կրիոգեներատորներ կամ կրիոստատներ: Առանձին դեպքերում կարող են օգտագործվել նաև սովորական սառցախցիկները: ԴՆԹ-ի պահման մեկ այլ եղանակ է նստվածքի ձևավորումը ոչ ջրային՝ 70 % խտությամբ էթանոլային միջավայրում: Այս վիճակում ԴՆԹ-ն կոմպակտ է և չի ենթարկվում մեխանիկական կամ ֆերմենտային ազդեցությունների (ֆերմենտները այս պայմաններում ապաակտիվ են): ԴՆԹ-ի որակական և քանակական գնահատման համար օգտագործվում է էլեկտրաֆորեզի եղանակը, որի միջոցով ԴՆԹ-ի բծերը գնահատում են՝ ստացված արդյունքը համեմատելով թեստային շարքի հետ, իսկ առավել ճշգրիտ քանակական գնահատական կարելի է ստանալ սպեկտրոֆոտոմետրիկ վերլուծության եղանակով: 1.2.3. ԴՆԹ-ի աղային էքստրակցիա կենդանական բջիջներից ԴՆԹ-ի հեղուկֆազային եղանակով անջատման հայտնի մեթոդներից մեկն է ԴՆԹ-ի աղային էքստրակցիան: Սովորաբար փորձի համար օգտագործվում է արյան նմուշը, որի կազմի լեյկոցիտները, լինելով կորիզավոր բջիջներ, պարունակում են բավարար քանակի ՆԹ-ներ: Կենդանական բջիջների թաղանթը բարակ է, կազմված հիմնականում լիպիդային երկու շերտից և գլիկոպրո-

տեինային ներառուկներից և հեշտ է քայքայվում սովորական դետերգենտներով: Աշխատանքի նպատակն է ծանոթանալ ԴՆԹ-ի անջատման մեթոդին աղային էքստրակցիայի միջոցով: Մեթոդի հիմքում ընկած է բարձր իոնային ուժի ազդեցությամբ առաջացող դոդեցիլսուլֆատ Naի՝ ԴԴՑ-Na բյուրեղների ունակությունը կապվել սպիտակուցների և լիպիդների հետ: Փորձում օգտագործվող նյութերը և սարքերը. 1. Միկրոթերմոստատ՝ միկրոփորձանոթների համար (65 ºС): 2.

Միկրոցենտրիֆուգա՝ վորտեքս միկրոփորձանոթների համար (մինչև 100000 g արագությամբ):

3.

Լաբորատոր կշեռք՝ 0,01-10 գ ճշգրտության մակարդակով:

4.

Ապակե փայտիկներ՝ հոմոգենիզացման համար:

5.

Փոփոխվող ծավալով ավտոմատիկ դոզատորներ:

6.

Միկրոփորձանոթներ 1,5 մլ ծավալով, Էպպենդորֆի տիպի (նկ. 1.4):

7.

Լատեքսային ձեռնոցներ:

8.

100 մգ կենդանական հյուսվածքի նմուշ:

9.

Թորած ջուր:

10. 96 %-անոց էթանոլ:** 11.

Քայքայող բուֆեր (պարունակում է 0,4 М NaCl, 10 մՄ տրիսHCl, рН=8, 2 մՄ ԷՔՏԱ-Na рН=8):

12. 6 Մ NaCl-ի լուծույթ:* 13. 20 %-անոց ԴԴՑ-Na լուծույթ: 14. Ապաիոնիզացված ջուր: 15. Պրոտեին կինազ К-ի լուծույթ (20 մգ/մլ, պատրաստել թորած ապաիոնիզացված ջրով):** * - պահել 2-8 ºС պայմաններում, ** - պահել -18 ºС պայմաններում:

Նկ. 1.4. Էպպենդորֆի միկրոփորձանոթներ՝ 1,7 մլ ծավալով:

Աշխատանքի ընթացքը 1. Կենդանական նմուշի 50-100 մգ հատվածը դրվում է Էպպենդորֆի միկրոփորձանոթի մեջ, ավելացվում է 400 մկլ քայքայող բուֆեր: Ապակե փայտիկով նմուշը հոմոգենիզացվում է 20 վրկ: 2. Ավելացվում են 20 մկլ 20 %-անոց ԴԴՑ-Na և 8 մկլ պրոտեինկինազ К-ի լուծույթներ: 3. Միկրոփորձանոթի պարունակությունը 15 վրկ խառնվում է վորտեքսի վրա: 4. Միկրոանոթը ինկուբացվում է միկրոթերմոստատում 30 րոպե՝ -65 ºС պայմաններում: 5. Ինկուբացիայի ավարտից հետո միկրոփորձանոթի մեջ ավելացվում է 300 մկլ 6 Մ NaCl: 6. Միկրոփորձանոթի պարունակությունը խառնվում է վորտեքսի վրա 15 վրկ, ապա ցենտրիֆուգվում 20 րոպե 15000 պտույտ/րոպ արագությամբ: 7. Սուպերնատանտը տեղափոխվում է նոր փորձանոթի մեջ, ավելացվում է նույն ծավալի էթիլային սպիրտ (-18 ºС): 8. Փորձանոթը դրվում է սառցարան 15 րոպե -18 ºС պայմաններում: 9. Ինկուբացիայից հետո փորձանոթը ցենտրիֆուգում են 20 րոպե, 10000 պտ/րոպ արագությամբ: 10. Սուպերնատանտը լրիվ հեռացվում է, մնացած նստվածքը չորացվում 5-7 րոպե բաց փորձանոթում՝ 65 ºС պայմաններում: 11. Չորացրած նստվածքին ավելացնում են 500 մկլ ապաիոնիզացված ջուր, թողնում 24 ժամ 70 ºС պայմաններում, որ լուծվի (О.Ш. Карапетьян, Е.М. Вечканов, И.А. Сорокина, 2015):

1.2.4.

ԴՆԹ-ի անջատումը բակտերիալ բջիջներից

ԴՆԹ-ի անջատումը բակտերիաներից կատարվում է ԴԴՑ-ի (SDS, sodium dodecyl sulfate), պրոտեինկինազների և ֆենոլի օգտագործմամբ (П. Дхазе и др., 1979): Այս մեթոդը հասարակ է կատարման առումով և կարող է բարելավվել այլ մեթոդների մասնակի ներգրավման միջոցով: Բակտերիաների բջիջներից անջատվող ՆԹ-ի կազմում առկա են նուկլեոիդը, պլազմիդները, ՌՆԹ-ները, եթե բջիջը հարուցված է ֆագի ՆԹ-ով: Այս դեպքում նույնպես պլազմատիկ մեմբրանը քայքայվում է ԴԴՑ-ի՝ բարձր մակերեսային ակտիվության նյութով: Նշենք որ պեպտիդոգլիկանային շերտը նույնպես վնասվում է: Բակտերիալ բջջի լիզատի մշակումը ֆենոլով ապահովում է բոլոր սպիտակուցների հեռացումը և չի վնասում ԴՆԹ-ն: Բջջի այլ օրգանական և փոքրամոլեկուլային բաղադրիչները հեռացվում են էթանոլով, որն իջեցնում է ԴՆԹ-ի մոլեկուլները նստվածք: Ցենտրիֆուգումից հետո առաջացած ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի նստվածքը լուծվում է հատուկ՝ TE բուֆերում: Բուֆերի կազմում առկա քելատացնող գործոնը (chelating agent)՝ էթիլենդիամինեռաքացախային թթուն (ԷԴԵԹ), կապում է Mg2+ կատիոնները, որի շնորհիվ նուկլեազ խմբի ֆերմենտները ապաակտիվանում են և չեն ազդում ՆԹ-ների վրա: Փորձում օգտագործվող նյութերը և սարքերը. 1. Միկրոթերմոստատ՝ միկրոփորձանոթների համար (65 ºС): 2.

Միկրոցենտրիֆուգա:

3.

Մակրոցենտրիֆուգա:

4.

Վորտեքս՝ միկրոփորձանոթների համար (մինչև 100000 g արագությամբ):

5.

Լաբորատոր կշեռք՝ 0,01-10 գ ճշգրտության մակարդակով:

6.

Ջերմապահարան:

7.

pH-մետր:

8.

Սառնարան և սառցարան:

9.

Ավտոկլավ:

10. Ապակե փայտիկներ՝ հոմոգենիզացման համար: 11.

Փոփոխվող ծավալով ավտոմատիկ դոզատորներ:

12. Միկրոփորձանոթներ՝ 1,5 մլ ծավալով, Էպպենդորֆի տիպի (նկ. 2): 13. Լատեքսային ձեռնոցներ: 14. Սովորական լաբորատոր սարքեր՝ էլեկտրական ջեռուցիչ, հոսանքի աղբյուր, չորացնող պահարան և այլն: 15. Հողային բակտերիաների Azospirillum brasilеnse Sp245 շտամ: 16. 2YT միջավայր. 16 գ տրիպտոն, 8 գ խմորասնկերի էքստրակտ, 5 գ NaCl խառնել, թորած ջրով ծավալը հասցնել 1 լ, pH=7: Պինդ միջավայրի ձևավորման համար ավելացնել է 1,5 % ագար և ախտահանել ավտոկլավում: 17. 5 % SDS նատրիումի դոդեցիլսուլֆատի 5 %-անոց լուծույթ: 18. N-laurylsarcosine՝ լուծվում է TE բուֆերում: 19. Պրոնազ՝ 5մգ/մլ TE բուֆերում: 20. TE բուֆեր՝ 10 մՄ Тris–HCl, Ph=8,0, 1 մՄ ԷԴԵԹ: 21. 5 Մ NaCl. 292,5 գ NaCl լուծել 800 մ թորած ջրի մեջ և ծավալը հասցնել 1 լ: 22. Ֆենոլ-քլորոֆորմ խառնուրդ: Ջրահագեցած ֆենոլը խառնում են 1/1 հարաբերությամբ քլորոֆորմ-իզոամիլային սպիրտ խառնուրդի հետ: 23. Քլորոֆորմ-իզոամիլային սպիրտ խառնուրդում ծավալային հարաբերությունը հավասար է 24/1: Աշխատանքի ընթացքը 1. Կատարել A.brasilense-ի Sp245 շտամի միագաղութ ցանք 2YT միջավայրի 5 մլ ծավալում և բակտերիաները աճեցնել 8-10 ժամ 30 ºС և աերացիայի պայմաններում: 2. Միկրոպիպետով տեղափոխել կուլտուրայի 1,5 մլ էպպենդորֆի փորձանոթի մեջ և ցենտրիֆուգել 5 րոպե 10 000 պտ./րոպ արագությամբ:

3. Հեռացնել սուպերնատանտը, նստվածքին ավելացնել 300 մկլ TE բուֆեր և պիպետի օգնությամբ ձևավորել բջջային սուսպենզիա: 4. Ավելացնել սուսպենզիային 100 մկլ 5 %-անոց SDS և խառնել լուծույթը փորձանոթը 3 անգամ շրջելու միջոցով: 5. Ավելացնել 150 մկլ պրոնազի լուծույթ և խառնել: 6. Ինկուբացնել 0.5 ժամ ջերմապահարանում 30 ºС պայմաններում: Այս ընթացքում կատարվում է բջիջների լիզիս և սպիտակուցների ֆերմենտային հիդրոլիզ: 7. Նուկլեինաթթուները իջեցնել նստվածք սպիրտով անջատման եղանակով: Այս նպատակով ավելացնել փորձանոթի մեջ 550 մկլ իզոպրոպանոլ և ցենտրիֆուգել 10 րոպե 10 000 պտ/րոպ արագությամբ: Նշենք, որ սպիրտային լուծույթը անհրաժեշտության դեպքում կարող է պահվել սառնարանում երկար ժամանակ: 8. Ցենրիֆուգումից հետո հեղուկը հեռացնել միկրոպիպետով, իսկ նստվածքը լուծել TE բուֆերի 500 մկլ ծավալում՝ ապապրոտեինացման համար: 9. Ավելացնել լուծույթին նույն՝ 500 մկլ ծավալով ֆենոլ-քլորոֆորմ խառնուրդ և թափ տալով ձևավորել կայուն սուսպենզիա: 10. Ցենտրիֆուգման եղանակով բաժանել ջրային և օրգանական ֆազաները 5 րոպեի ընթացքում: Ջրային ֆազան մնում է վերևի շերտում, ֆենոլայինը իջնում է ներքև: ԴՆԹ-ի հետ կապված սպիտակուցները դիսոցիացվում են, անջատվում և առաջացնում ինքնուրույն շերտ երկու ֆազաների միջև: ԴՆԹ-ն անջատվում է սպիտակուցներից: 11.

Ջրային ֆազան զգուշորեն տեղափոխել նոր 1,7 մլ փորձանոթի մեջ:

12. Կատարել ևս մեկ ԴՆԹ-ի էքստրակցիա քլորոֆորմով ֆենոլի վերջնական հեռացման համար: Այդ նպատակով նմուշով փորձանոթի մեջ ավելացնել նույն ծավալով քլորոֆորմ-իզոամիլային սպիրտի խառնուրդ և ցենտրիֆուգել 3 րոպե, ապա ջրային ֆազան տեղափոխել մաքուր փորձանոթի մեջ:

13. Միկրոպիպետ-դոզատորով որոշել տեղափոխված նմուշի ծավալը և ավելացնել 5 Մ NaCl-ի 1/25 ծավալ, ստանալով փորձանոթում 0,2 Մ աղային լուծույթ: Հետո ավելացնել սառը էթանոլի (–20 ºС) 2,5 ծավալ և 1-2 ժամ պահել սառցարանում –20 ºС պայմաններում: Այս վիճակում նմուշը կարող է պահվել բավական երկար ժամանակ: 14. ՆԹ-ները իջեցնել նստվածք ցենտրիֆուգելով 10 րոպե: Միկրոցենտրիֆուգի առավելագույն արագությամբ, ապա հեռացնել վերնստվածքային հեղուկը և ավելացնել նստվածքին 1 մլ սառը 70 %-անոց էթանոլ և նորից ցենտրիֆուգել 3 րոպե: 15. Թափել սուպերնատանտը, փորձանոթը շուռ տալ ներծծող թղթի վրա և թողնել, որ ամբողջ հեղուկը թափվի: Ապա նստվածքում ՆԹ-ներ պարունակող փորձանոթը թողնել չորանա այնքան ժամանակ, մինչև սպիրտի հոտը անհետանա: Վերջում նստվածքը լուծել 50 մկլ ծավալով TE բուֆերի: 1.2.5. ԴՆԹ-ի անջատումը բուսական հյուսվածքներից Բուսական բջիջներից ՆԹ-ների անջատման պրոցեսում շատ կարևոր է բջջապատերի քայքայման պրոցեսը: Կիրառվող մեթոդների մեծ մասը առաջացնում է ՆԹ-ների հիդրոդինամիկ վնասվածքներ և շղթայի ընդհատումներ: Մեկ այլ դժվար խնդիր է ԴՆԹ-ի անջատումը բջջային բազմաթիվ տարրերից՝ սպիտակուցներից, բազմաշաքարներից, պիգմենտներից, տանիններից և այլ բաղադրիչներից: Սովորաբար բջջապատը քայքայում են ուժեղ դետերգենտների ազդեցությամբ և քելատային նյութերի ներկայությամբ: Առաջինները քայքայում են բջջային մեմբրանները, իսկ երկրորդ բաղադրիչը կապում է բիվալենտ կատիոնները և արգելակում նուկլեազների ազդեցությունը: Քրոմատինի կազմի սպիտակուցներից ազատվում են ֆենոլային մշակման եղանակով: Որոշ դեպքերում սպիտակուցներից ազատվելու համար կիրառում են պրոտեինազ ֆերմենտները:

Սպիտակուցներից ազատված ՆԹ-ների լուծույթում դեռ մնում են մեծ քանակությամբ բազմաշաքարներ: ԴՆԹ-ի մեծ ծավալներ ստանալու համար կատարում են ուլտրացենտրիֆուգում ցեզիումի խտության գրադիենտում (տես բաժին 1.5): Բուսական հյուսվածքներից ԴՆԹ-ի անջատման համար հաճախ օգտագործվում են երկու դետերգենտներ՝ CTAB (cetyl trimethyl aммonium bromid) և SDS (sodium dodecyl sulfate): 1985 թ. Ս.Օ. Ռոջերսը և Ա.Ջ. Բենդիչը առաջարկել են CTAB մեթոդը, որը թույլ է տալիս ստանալ ՊՇՌ-ի, մոլեկուլային հիբրիդացման և ռեստրիկցիոն վերլուծության համար օգտագործվող ԴՆԹի նմուշներ: CTAB-ը լավ է քայքայում բջջային մեմբրանները և, բացի դրանից, անջատում է ԴՆԹ-ն բազմաշաքարներից, քանի որ CTAB-ի կազմի աղերի բարձր խտության պայմաններում ԴՆԹ-ն կապվում է դրանց հետ՝ առաջացնելով ամուր, բայց լուծվող համալիրներ: Երբ NaCl-ի խտությունը իջնում է 0,4М սահմանից ԴՆԹ- CTAB համալիրը իջնում է նստվածք իսկ բազմաշաքարների մեծ մասը մնում է լուծույթում: Ստացված նստվածքը նորից լուծում են 1М NaCl-ի լուծույթում և ապա իջեցնում նստվածք արդեն իզոամիլային սպիրտով: ԴՆԹ-ների անջատման երկրորդ եղանակը նույնպես նախատեսում է դետերգենտի, այս դեպքում SDS-ի օգտագործում: SDS-ը լավ է քայքայում բջջաթաղանթները և արագ բնափոխում սպիտակուցները, այդ թվում և նուկլեազ ֆերմենտները: Սպիտակուցները և բազմաշաքարները 0 0C պայմաններում առաջացնում են SDS-ի հետ նստվածք իջնող համալիրներ, իսկ ԴՆԹ-ն մնում է լուծույթում: Սուպերնատանտի ԴՆԹ-ն մշակվում է ֆենոլով, ապա իջեցվում նստվածք սպիրտով և համապատասխան բուֆերում լուծելուց հետո պատրաստ է հետազոտությունների համար:

Բուսական հյուսվածքներից ԴՆԹ-ի անջատման CTAB մեթոդը (Doyle and Doyle, 1987 թ.) Մեթոդի հիմքում ընկած է թաղանթների քայքայումը CTAB-ով՝ ացետիլեռամեթիլամոնիբրոմիդով, ԴՆԹ-ի անջատումը քլորոֆորմով և ԴՆԹ-ի իջեցումը նստվածք իզոամիլային սպիրտով: Պետք է հիշել, որ քլորոֆորմը ուժեղ կանցերոգեն (քաղցկեղածին) է, և հետազտությունը կատարելիս պետք է անպայման միացնել օդափոխիչ սարքավորումները: Փորձում օգտագործվող նյութերը և սարքերը. 1. CTAB բուֆեր՝ 2 % CTAB (10,0 գ), 1,4 գ NaCl (40,91 գ), 20 мM ԷԴԵԹ (20 մլ 0,5 M ԷԴԵԹ ), 100 мM Tris–HCl pH=8,0, (50 մլ 1 M Tris– HCl), ավելացնել թորած ջուր և ծավալը հասցնել 500 մլ: 2. Te բուֆեր՝ 10 мM Tris–HCl pH=8,0, 1 мM ԷԴԵԹ: Պահել 2-8

C պայմաններում: 3. Իզոպրոպանոլի լուծույթ: 4. Մաքրող լուծույթ (92 % քլորոֆորմ և 8 % իզոամիլային

սպիրտ): 5. 70 %-անոց էթանոլ: 6. Օգտագործվում են լաբորատոր աշխատանքների համար կիրառվող

սովորական

սարքերը

և

ամանները,

պիպետները,

փորձանոթները: Աշխատանքի ընթացքը 1. Բուսական նյութի՝ տերևների, ցողունների կամ այլ հատվածների նմուշների մոտ 2 սմ2 դնել 1,5 մլ փորձանոթի մեջ: 2.

Ավելացնել 2 % CTAB-ի 400 մկլ և արագ մանրացնել հատուկ

սարքով: 3.

Ավելացնել 10 մկլ ՌՆԹ-ազ և թափ տալ փորձանոթը վոր-

տեքսի վրա 5 վրկ: 4.

Ինկուբացնել 60-80 րոպե 65 0C պայմաններում և ժամա-

նակ առ ժամանակ թափահարել:

5.

Ավելացնել 400 մլ մաքրող լուծույթ (92 % քլորոֆորմ և 8 %

իզոամիլային սպիրտ): 6.

Ցենտրիֆուգել 13 000 պտ/րոպ արագությամբ 1 րոպե:

7.

Պիպետով զգուշորեն անջատել վերնստվածքային հեղուկը՝

չկպնելով սպիտակուցային շերտին և տեղափոխել նոր փորձանոթ: 8.

Կրկնել 5-8 կետերը:

9.

Ավելացնել 350 մլ սառը իզոպրոպանոլ և զգուշորեն խառնել

լուծույթը: 10. 10 րոպե ցենտրիֆուգել 13 000 պտ/րոպ արագությամբ: 11. Զգուշորեն հեռացնել հեղուկ իզոպրոպանոլը և 70 %-անոց էթանոլով լվանալ նստվածքի ԴՆԹ-ն: 12. Ցենտրիֆուգել 5 րոպե 13 000 պտ/րոպ արոգությամբ: 13. Սպիրտը թափել և փորձանոթը մոտ մեկ ժամ բաց թողնել, որպեսզի նստվածքը չորանա: 14. Չորացած ԴՆԹ-ն լուծել Te բուֆերում:

1.3. ԴՆԹ-Ի ԱՆՋԱՏՄԱՆ ՊԻՆԴՖԱԶԱՅԻՆ ՄԵԹՈԴՆԵՐԸ

ԴՆԹ-ի անջատման պինդֆազային մեթոդները կապված են ԴՆԹ-ի և այլ մասնակից նյութերի ֆիզիկաքիմիակենսաբանական հատկանիշների և որոշակի պրոցեսների ու սկզբունքների օգտագործման հետ: Դրանք իրականացվում են՝ - սովորաբար քաոտրոպ պայմաններում կվարցի հետ ոչմոդիֆիկացված ջրածնային կապերի առաջացման եղանակով, -

ջրային

միջավայրում

իոնոփոխարկիչների

օգտագործմամբ

իոնների փոխանակման միջոցով, -

աֆինային կապերի առաջացման միջոցով,

-

ըստ չափսի մոլեկուլների բաժանման միջոցով:

Նուկլեինաթթուներ ադսորբցող պինդֆազային համակարգերը քրոմատոգրաֆիայի համար օգտագործվող կվարցի մասնիկների, ապակե թելիկների կամ անիոնափոխարկող կրիչների քրոմատոգրաֆիկ ծորակասյուներ են: Կրիչները օգտագործվում են ՆԹ-ների

անջատման համար բարձր խտության քաոտրոպ աղերի (նատրիումի յոդիտի, նատրիումի գերքլորատի, գուանիդին տիոցիանատի) հետ միասին: ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի անջատման ընդունված մեթոդները բարելավվում են, ստեղծվում են նոր մեթոդներ: Աշխատանքների շարունակականությունը պայմանավորված է նրանով, որ ներկայումս անհրաժեշտություն է ծագել ստեղծել ՆԹ-ների անջատման արդյունաբերական և ավտոմատացված մեթոդներ, կատարելագործել արդեն հայտնի լաբորատոր մեթոդները՝ արագ ու էժան ստանալ մեծ քանակով ավելի մաքուր նմուշներ: Հայտնի մեթոդների մի մասը կներկայացնենք ստորև: 1.3.1. Քրոմատոգրաֆիայի մեթոդ Նյութերի բաժանման այս եղանակը առաջարկել և իրականացրել 1903 թ. ռուս գիտնական Մ. Ցվետը: Բուսական լուծված պիգմենտների բարդ խառնուրդը նա անցկացրել է կալցիումի կարբոնատ՝ սիլիկա պարունակող ուղղահայաց խողովակով և ստացել գունավոր շերտեր (նկ. 1.5): Այստեղից և առաջացել է անվանումը՝ քրոմո – գույն, գրաֆիա - գրել: Ինչպես պարզվեց կատարված հետազոտությունների արդյունքում, նույն եղանակով բաժանվում են նաև անգույն նյութերը: Բազմաթիվ գիտնականների՝ Լ. Մարտինի, Ռ. Սինջի և ուրիշների ջանքերով քրոմատոգրաֆիայի մեթոդը զարգացվել ու մշակվել է, և այժմ քրոմատոգրաֆիան իրականացվում է բազմաթիվ մեթոդներով՝ բազմազան սարքավորումների օգտագործմամբ: Ըստ էության՝ քրոմատոգրաֆիան նյութերի բաժանման ֆիզիկաքիմիական մեթոդ է, որը թույլ է տալիս անջատել նյութերի խառնուրդի բաղադրիչները՝ դրանք բաժանելով երկու ֆազաների միջև, որոնցից մեկն անշարժ է (սորբենտ), իսկ երկրորդը՝ շարժուն (էլյուենտ): Սովորաբար բաժանումը կատարվում է հատուկ սյունակային կազմություն ունեցող սարքերում՝ spin column-ներում: Անշարժ պինդ ֆազան փորձից առաջ լցվում է սարքի խողովակի մեջ և մնում անշարժ: Երկրորդ ֆազան կազմված է բջջային լիզատից կամ այլ,

անջատվող նյութը պարունակող խառնուրդից: Շարժվող լուծույթի բաղադրիչ նյութերը, անցնելով անշարժ ֆազայի երկարությամբ, բաժանվում են թորամասերի: կա(lոtiltյU T

:եեո.'.րtiU1tiu

~1որո:Pti1 8 Lոնոl:itiն '--ltiրյ.աQUաUոtiն l,l:iոQUաULոtiն

Նկ. 1.5. Բույսերի կանաչ պիգմենտի քրոմատոգրաֆիկ պատկերը (http://www.xumuk.ru/biologhim/010.html):

Քրոմատոգրաֆիայի մեթոդի առանձնահատկությունն այն է, որ շարժվող ֆազայի բաղադրիչները բազմակի անգամներ աբսորբվում են անշարժ ֆազայի մակերեսին և դեսորբվում: Քանի որ սորբցիան հետադարձելի պրոցես է, նյութերի անցումը շարժվող ֆազայից անշարժի կազմ և հակառակը մշտական է: Բաժանվող բաղադրիչը անցնում է անշարժ ֆազայով ադսորբցիայի և դեսորբցիայի պրոցեսին բնորոշ արագությամբ: Ադսորբցիայի ունակության աստիճանը՝ ինտենսիվությունը, ազդում է շարժման արագության վրա: Ուժեղ ադսորբվող բաղադրիչների շարժը դանդաղ է, թույլ ադսորբվող նյութերը արագ են անցնում անշարժ ֆազայով, և նյութերը բաժանվում են անշարժ ֆազայի՝ սյունակի երկարությամբ առաջացնելով առանձին շերտեր: Շարժվող ֆազայի շերտերը հերթով դուրս են գալիս սյունակից: Նյութի անջատումը սորբենտից կոչվում է էլյուացում (նկ. 1.6): Անշարժ ֆազան կարող է լինել պինդ կամ հեղուկ, իսկ շարժվողը, համապատասխանաբար՝ հեղուկ կամ գազային:

Ադսորբցիայի եղանակով ՆԹ-ների անջատման ընթացքը կարող է բաժանվել 3 փուլերի. 1. Սորբենտ պարունակող սյունակի պատրաստում և ադսորբցիոն հատկանիշների բարելավման համար մշակում բուֆերով: 2. Սյունակի մեջ հետազոտվող խառնուրդի ներմուծում: Ներմուծվող բջջային հոմոգենատը պետք է լուծել ՆԹ-ները կապող լուծույթում՝ binding solution-ում, որի կազմում առկա աղերի բարձր խտության և հատուկ pH ազդեցությամբ դրանք կապվում են սորբենտի մակերեսին: Հոմոգենատի կազմի այլ բաղադրիչները՝ սպիտակուցները, նույնպես կարող են կապվել սյունակի պատերին, բայց դրանք հաջորդ փուլում հեռացվում են լվացող բուֆերի՝ wash buffer-ի օգնությամբ: 3.

Ադսորբված և մաքրված ՆԹ-ները դեսորբցիայի եղանակով անջատվում են սորբենտից, անցնում շարժվող ֆազա և դուրս գալիս քրոմատոգրաֆիկ սյունից կամ մաքրվում ցենտրիֆուգման եղանակով: Դեսորբցիայի համար օգտագործվում են բուֆերային լուծույթներ (նկ. 1.6):

4. 5.

Բ2t,2նե11t, [t,գt,ն L,

1օOօզեO~զ:::,

~~,:,Պi

$2աոlI1յ1ո~ ա11.ե11t,

օmii s, ~m , LL[ացոնl

'Պ\ենոր րցt,ա L,

հեր,աgոul, ut11tոոակոguերt, րuաit,ոtuո~

Նկ. 1.6. Սիլիկիի եղանակով ԴՆԹ-ի անջատման մեթոդի սխեման (https://www.dia-m.ru/news.php?newsid=58003):

Քրոմատոգրաֆիկ պրոցեսի կարևոր ցուցանիշներից են տարբեր թորամասերի անջատման ժամանակահատվածները՝ փորձի սկզբից մինչև առաջին թորամասի անջատումը, առաջին թորամասի

անջատման տևողությունը, ընդմիջումը մինչև հաջորդ թորամասի անջատումը, երկրորդ թորամասի անջատման տևողությունը և այլն: Եթե սյունակի ելքի մոտ տեղադրվի դուրս եկող հեղուկում նյութերի խտությունը չափող ստուգիչ սարք՝ Ինդիկատոր l, ապա կստացվի C գրաֆիկ պատկերը՝ քրոմատոգրամման, որտեղ նշվում են հետազոտվող նյութերի և հեղուկ լուծողի անցման ժամանակային հատվածներն ու արագությունը (նկ. 1.7): Է

Է

l

l

C I ll Il l Il l Il l Il l Il l Il l I ll

Է

A•E Il l

a

IIlll

Ill

ե

Ը

Il l Ill

մ

tարժljո~ Էո'il!ilil Ճ 8 - րաԸtանո.նորi. :t,ազա E tllil ~•ր ' Uյոtր3եր1

Նկ. 1.7. Էլյուենտային քրոմատոգրաֆիայի սխեման. а - А և В նյութերի ներմուծումը քրոմատոգրաֆիկ սյան մեջ շարժվող ֆազայի Е-ի կազմում, b, c, d - А և В նյութերի շարժը անշարժ ֆազայի Е-ի կազմում: С- փորձի գրաֆիկ պատկերը (Г.Ф. Пругло и др., 2017):

Դուրս մղող քրոմատոգրաֆիայի մեթոդի դեպքում, բացի սովորական անշարժ և շարժվող ֆազաներից, օգտագործվում է D՝ դուրս մղող նյութը, որը ավելի ուժեղ է կապվում սորբենտի հետ, քան հետազոտվող նյութերը և դրա շնորհիվ դուրս է մղում դրանք սյունակից (նկ. 1.8): Չափիչ սարքն այս դեպքում գրանցում է լուծույթի խտության՝ С-ի հարաբերությունը դուրս եկած լուծույթի ծավալի՝ V-ի նկատմամբ, և այդ տվյալներով կառուցում է կուտակային քրոմատոգրամ: Պետք է նշել, որ D լուծույթի օգտագործումը սղում է առանձին թորամասերի միջև առկա լուծույթային միջանկյալ շերտերը, և թորամասերը դուրս են գալիս սյունակից գրեթե անընդհատ, նույնիսկ մասամբ խառնված:

ո

EE

a

V

Նկ. 1.8. Դուրս մղող քրոմատոգրաֆիայի սխեման. а - А և В նյութերի ներմուծումը քրոմատոգրաֆիկ սյան մեջ շարժվող ֆազայի Е-ի կազմում, b - D լուծույթի ներմուծում, c - բաղադրիչների դուրս մղում, d - կուտակային քրոմատոգրամ (Г.Ф. Пругло, О.В. Фёдорова, Р.А. Смит, 2017):

1.3.1.1. Ընտրողական ադսորբցիայի եղանակ Ադսորբցիոն քրոմատոգրաֆիայի դեպքում քաոտրոպ աղերի ներկայությամբ ՆԹ-ները ընտրողական սկզբունքով կապվում են քրոմատոգրաֆիկ սյան մեջ գտնվող, մակերեսի վրա ակտիվ լիցքային կենտրոններ ունեցող սիլիցիումային կամ ապակե բնույթի կրողների հետ (նկ. 1.9): Հեղուկային ֆազան բևեռավորված չէ և կոչվում է էլյուենտ: Նպատակային նյութի և ադսորբենտի միջև առաջացող կապերը դոնոր-ակցեպտորային են կամ ջրածնային: Լուծույթում առկա այլ նյութերը այդպիսի կապեր չեն առաջացնում:

Նկ. 1.9. Ադսորբցիոն քրոմատոգրաֆիայի համար օգտագործվող սորբենտի կազմային սխեման (http://www.chemnet.ru/ rus/teaching/oil/spezprakt-chr.html):

Այսօրինակ կապերի առաջացման եղանակով ՆԹ-ները հուսալիորեն անջատվում են քայքայված բջիջների լիզատում առկա այլ նյութերից, և դրանք ազատ հեռանում են սյունից: Այսուհետև ադսորբ28

ված ԴՆԹ-պարունակող սորբենտի լվացումը թույլ աղային լուծույթով կամ ջրով անջատում է մաքրված ՆԹ-ների ֆրակցիան: 1.3.1.2. ՆԹ-ների անջատումը ապակու վրա ՆԹ-ների անջատման արդյունավետ և հարմար եղանակ են առաջարկել Բումը և իր համահեղինակները: Սկզբում բջջային մեմբրանները քայքայվում են քաոտրոպ գործոններով, զուգահեռ, ապա ակտիվացվում է ՌՆԹ-ազ ֆերմենտը: ՆԹ-ները սորբվում են կրող մասնիկների՝ ապակե գնդերի, թելիկների կամ դիատոմային հողի վրա: ՆԹ-ն կապվում է ապակուն քաոտրոպ աղերի բարձր խտության պայմաններում՝ գուանիդին քլորիդինի կամ գուանիդին տիոցիանատինի: Քաոտրոպ գործոններ են նաև միզանյութը և նատրիումի քլորիդը: Քաոտրոպ գործոնները խախտում են ջրի կարգավորված կազմությունը և նպաստում բջջային մեմբրանների քայքայմանը: Այսպիսով՝ դրանք ոչ միայն ապահովում են ՆԹ-ների ադսորբումը ապակու վրա (նկ. 1.10), այլև նպաստում բջջային թաղանթների քայքայմանը և ՆԹ-ների անջատմանը: Խառնուրդի կազմի այլ տարրերը լվացվում են սյունից քաոտրոպ աղերով, իսկ քաոտրոպ աղերը հեռացվում են 80 %անոց էթանոլով: Մաքրված ՆԹ-ն ապակու մակերեսից անջատվում է բուֆերային թույլ լուծույթով:

Նկ. 1.10. ԴՆԹ-ի ադսորբումը սիլիկումի մակերեսին՝ քաոտրոպ աղերի միջնորդությամբ (https://www.pngwing.com/ru/freepng-yjlab):

Վերջին տարիներին առաջարկվել է ԴՆԹ-ի անջատման համար օգտագործել բուֆերներ, որոնց կազմում առկա են քաոտրոպ աղեր և SiO2-իոնոդիսպերսիոն կլոր մասնիկներ (տրամագիծը՝ 100-500 նմ սահմաններում): Ավելի փոքր տրամագծով մասնիկների օգտագործման շնորհիվ սորբենտի փոքր ծավալին համապատասխանում է ավելի

մեծ ակտիվ մակերես, և փորձի համար օգտագործվող սորբենտի քանակը նվազում է: ԴՆԹ-ի հետ կապված մոնոդիսպերսիոն մասնիկները ցենտրիֆուգում են բարձր արագությամբ և իջեցնում նստվածք, ապա ՆԹ-ները դեսորբվում են ջրով կամ ցածր խտությամբ բուֆերով: Ստացված էլյուանտը մաքրված ՆԹ-ների լուծույթ է, որը կարող է օգտագործվել մոլեկուլային հետազոտություններում: Առաջարկված մեթոդի առավելություններից են սորբենտի քանակի փոքրացումը, ցենտրիֆուգման ժամկետների նվազումը և դեսորբցիայի պրոցեսի արդյունավետությունը կլոր մասնիկների մակերեսից: Կլոր մասնիկներից ՆԹ-ների դեսորբցիան կատարվում է արագ և արդյունավետ. անջատվում է գրեթե ամբողջ կապված ՆԹ-ն: Պարզվել է, որ լավագույն արդյունքները ստացվում են այն դեպքում, եթե մոնոդիսպերսիոն մասնիկների տրամագիծը 400-500 նմ սահմաններում է: Այս դեպքում ցենտրիֆուգումը տևում է ընդամենը 10 վրկ: 1.3.1.3. Արյան նմուշից ԴՆԹ-ի անջատումը մոնոդիսպերսիոն մասնիկների օգտագործման եղանակով Փորձում օգտագործվող նյութերը և սարքերը. 1. 100 մկլ բջջային սուսպենզիա: 2. 10 մլ 0,5 M ԷԴԵԹ: 3. 2 մկլ К պրոտեինկինազ: 4. 400-500 նմ տրամագծով մոնոդիսպերսիոն մասնիկների ջրային լուծույթ: 5. 6 М-անոց նատրիումի յոդիտ (pH=6,0): 6. 40 մկլ 1 мМ Տրիս-HCl (pH=8,5) բուֆեր: 7. 80 %-անոց էթանոլի ջրային լուծույթ: 8. Օգտագործվում են լաբորատոր աշխատանքների համար կիրառվող սովորական սարքերը և ամանները, պիպետները, փորձանոթները, Eppendorf ֆիրմայի լաբորատոր ցենտրիֆուգա:

Աշխատանքի ընթացքը. 1. Էպպենդորֆի փորձանոթում գտնվող բջջային սուսպենզիայի 100 մկլ-ին ավելացնել 10 մլ 0,5 Մ ԷԴԵԹ և խառնել: 2. Խառնուրդին ավելացնել 2 մկլ К պրոտեինկինազ և ինկուբացնել 55 ºС պայմաններում 10 րոպե: Այս ընթացքում բջիջների թաղանթը քայքայվում է, իսկ սպիտակուցները և ֆերմենտները ապաակտիվացվում են: 3. Ստացված լիզատի ամեն 10 մկլ-ին ավելացնել մոնոդիսպերսիոն սորբենտի 10-40 մկլ ծավալ: 6 Մ-անոց նատրիումի յոդիտի (pH=6,0) ավելացման միջոցով հասցնել խառնուրդի ծավալը 200 մկլ-ի և խառնել: 4. Թողնել սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում 10 րոպե՝ սորբենտի վրա ԴՆԹ-ի մոլեկուլների ադսորբման համար: 5. Սորբենտի հետ կապված ԴՆԹ-ն իջեցնել նստվածք՝ ստացված խառնուրդը ցենտրիֆուգելով 25 վրկ 14 000 պտ/վրկ արագությամբ: 6. Նստվածքին ավելացնել 1 մլ 80 %-անոց էթանոլի լուծույթ, խառնել և ցենտրիֆուգել 25 վրկ. 14 000 պտ/վրկ արագությամբ: 7. Սուպերնատանտը հեռացնել, իսկ նստվածքը չորացնել սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում 10 րոպե: 8. Նստվածքը ռեսուսպենզավորել 40 մկլ 1 мМ Տրիս-HCl (pH=8,5) բուֆերում և թողնել 10 րոպե 37 ºС աստիճանի պայմաններում՝ ԴՆԹ-ի մոլեկուլների դեսորբցիայի համար: 9. Սորբենտը իջեցնել նստվածք՝ ցենտրիֆուգելով 10 վրկ 14 000 պտ/վրկ արագությամբ: Անջատված ԴՆԹ պարունակող սուպերնատանտը զգուշորեն հեռացնել և օգտագործել մոլեկուլային կենսաբանական հետազոտություններում: Ներկայացվող մեթոդի առավելություններից են կատարման պարզությունը, արագությունը, ցածր ինքնարժեքը, ինհիբիտորների բացակայությունը և ավտոմատացման հնարավորությունը: Միակ թերությունն այն է, որ նմուշի փոքր ծավալների դեպքում մեթոդը քիչ արդյունավետ է:

Այսօր արդեն մի շարք ընկերություններ (ZymoResearch, Promega, Qiagen, Analytik Jena, NEB, Thermo Fisher dia Gene և այլն) մշակել և առաջարկում են ՆԹ-ների անջատման համար օգտագործվող պատրաստի ապակյա կրողների սյունակներ և ռեագենտների պատրաստի հավաքածուներ: Դրանց օգտագործումը նախատեսում է ցենտրիֆուգման փուլ, բայց ՆԹ-ների անջատման պրոցեսը տևում է ընդամենը 15 րոպե: 1.3.1.4. Դոնդողային ֆիլտրացիայի եղանակ Քրոմատոգրաֆիայի այս եղանակի հիմքում ընկած է բաժանումն ըստ չափսերի: Անշարժ ֆազայի՝ դոնդողի մասնիկները առաջացնում են փոքրիկ խցիկներից կազմված մոլեկուլային մաղ: Սյան մեջ գտնվող լուծույթը կամ ազատ շարժվում է դոնդողի հատիկներից դուրս, կամ գտնվում է դոնդողի ուռած հատիկների ներսում:

Նկ. 1.11. 1 - Փոքր մոլեկուլների կլանումը դոնդողի ներհատիկային խցիկներում, 2 - մեծ մոլեկուլները արագ են հասնում դոնդողի ծայրին, միջինները՝ ավելի դանդաղ, իսկ փոքր մոլեկուլների շարժը շատ դանդաղ է (Г.Ф. Пругло и др., 2017, https://www.creative-biostructure.com):

Ուռած հատիկները բազմաշաքարների ճյուղավորված մոլեկուլներ են, որոնք առաջացնում են դոնդողի եռամեր ցանցանման կազմությունը: Դոնդողային ֆիլտրացիան կամ մաղային ֆիլտրացիան

օգտագործվում է մոլեկուլային զանգվածների որոշման կամ պոլիմերային մոլեկուլների անջատման և խտության բարձրացման համար: Սովորաբար դոնդողային ֆիլտրացիայի համար օգտագործվում են ագարոզային, պոլիակրիլամիդային կամ պոլիդեքստրանային դոնդողներ: Դոնդողային ֆիլտրացիայի արդյունավետությունը պայմանավորված է ներհատիկային և միջհատիկային խցիկների չափսերով: Փոքր մասնիկները կլանվում են ներհատիկային խցիկների մեջ, դրանց շարժը դոնդողի շերտում գրեթե արգելակվում է: Միջին չափսի մասնիկների շարժը դանաղում է, բայց շարունակվում: Մեծ մոլեկուլները անցնում են միջհատիկային մեծ խցիկներով և արագ շարժվում դոնդողի շերտում (նկ. 1.11): Նյութերի բաժանման այս եղանակը կիրառվում է մեծ մոլեկուլների անջատման համար: Մեծ մոլեկուլները (օրինակ՝ ՆԹ-ների) չեն կլանվում մաղի խցիկների մեջ և, անցնելով դոնդողի շերտով, դուրս են գալիս սյունից փորձանոթ (նկ. 1.12): Կապված նյութերի անջատման համար անհրաժեշտ է օգտագործել անջատող լուծույթներ, որոնց ազդեցությամբ ավելի փոքր մասնիկների թորամասերը նույնպես դուրս են բերվում սյունից: Uu2աu,կո11 uրa-uե11t, tuա11uորt10

'1ոut1ո11t, հաu,t,կuե110

Uljգրո~ ծորաljաUյ11LUt,ց 'lոtրն են գա1t,ն ~եo գoայtiն ~ոtեlյոգներD

., •

Նկ. 1.12. Դոնդողային քրոմատոգրաֆիայի սխեման (https://fr.slideserve.com/kenyonhines/chapter-3-amino-acids-peptidesproteins)

12J4S ♦

1.3.1.5. Իոնափոխանակող քրոմատոգրաֆիայի եղանակ Այս դեպքում ազդեցիկ գործոնը էլեկտրոստատիկ ուժերն են: Այն դեպքում, երբ անջատվող նյութն ունի բացասական լիցք, անշարժ ֆազան պետք է լինի դրական լիցքավորված՝ կատիոնային, և հակառակը դրական լիցքով նյութի անջատման համար օգտագործվում են անիոնային՝ բացասական լիցքավորված անշարժ ֆազաներ: Անշարժ ֆազայի մակերեսային դրական լիցքով մասնիկների իոնոգեն ֆունկցիոնալ խմբերի և անջատվող նյութի բացասական լիցքով իոնոգեն ֆունկցիոնալ խմբերի միջև կատարվում է իոնների փոխանակում (նկ. 1.13): Լիցքավորված սորբենտները կոչվում են իոնիտներ:

Նկ. 1.13. Անջատվող մոլեկուլների և իոնիտի փոխազդեցության սխեման: Անջատվող մոլեկուլները կապվում են իոնիտի մասնիկների մակերեսին (Г.Ф. Пругло, О.В. Фёдорова, Р.А. Смит, 2017):

Անշարժ ֆազայի իոնիտները սովորաբար կազմված են պինդ, ջրում չլուծվող, բայց տրզողական հատկանիշներով օժտված հիդրոֆիլ, խոշոր ծակոտիներով և բարձր թափանցելիությամբ նյութերից՝ սիլիկատներից, դեքստրաններից, սինթետիկ պոլիմերներից կամ ցելյուլոզային բնույթի նյութերից: ԴՆԹ-ի մոլեկուլներն ունեն բացասական լիցք՝ գծային պոլիանիոններ են, որոնք փոխազդում են քրոմատոգրաֆիկ սյան մեջ գտնվող կատիոնիտի ֆունկցիոնալ թույլ թթվային խմբերի հետ: Անջատվող ՆԹ-ները և սորբենտի լիցքավորված խմբերը փոխազդում են՝ առաջացնելով ամուր, բայց հետադարձելի էլեկտրոստատիկ կապ: Թույլ էլեկտրական փոխազդեցությամբ կապված ՆԹ-ների մոլեկուլները հեշտությամբ անջատվում են սորբենտից և աղային բուֆերի լուծույթով իջեցվում նստվածք (նկ. 1.14):

Բաժանկոij Uյոt~ր~ րնարնորij

A

t'lոնոj1ոtնLUր1կորl !)[lոUUյlllոգ[lLU~tiLUյti նtնեLiUյ

-

Շl

~

ա

10-i

Cl

Բար~ր րացանա~ան 1~ցրոկ ~անն~~ներն ակե1~ արագ են 2արժկո~

ctասա(Jաlm

Նկ. 1.14. 1 - մեծ բացասական լիցք ունեցող մոլեկուլները կապվում են սորբենտի կատիոնային լիցքով հատիկների հետ, 2 - թորամասերի անջատման ժամկետների գրաֆիկ պատկերը (https://fr.slideserve.com/kenyon-hines/chapter-3-amino-acids-peptides-proteins):

1.3.1.6. Chilex տիպի քրոմատոգրաֆիա Քրոմատոգրաֆիայի այս մեթոդը կապված է Chilex տիպի իոնափոխանակող նյութերի օգտագործման հետ: Խեժը ստիրոլի և դիվինիլբենզոլի համապոլիմեր է: Chilex տիպի խեժերը դրսևորում են առավել բարձր աֆինություն երկվալենտ մետաղների իոնների նկատմամբ: Փորձում սովորաբար օգտագործվում են մագնեզիումի իոնները: Chilex նյութերը, ի տարբերություն այլ իոնիտների, փոխազդում են ոչ թե ԴՆԹ-ի մոլեկուլների հետ, այլ բջջային հոմոգենատի կազմի մյուս բոլոր նյութերի հետ, և մաքուր ԴՆԹ-ն մնում է սուպերնատանտում (նկ. 1.15): Սակայն այս եղանակով մաքուր ԴՆԹ ստանալ հաջողվում է ոչ բոլոր նմուշներից՝ որոշ դեպքերում նմուշում գտնվող նյութերի մի մասը չի կապվում Chilex իոնափոխանակող խոժի հետ և մնում է լուծույթում ԴՆԹ-ի հետ: Ասյ դեպքում մնացորդային նյութերը պետք է անջատել

հաշվի առնելով դրանց բնույթը և ԴՆԹ-ի մաքրության աստիճանին ներկայացվող պահանջները:

~1] -

2. Ut.lt[ացOtt Շհelex 5%

L, t:եր1ացնtեl 30[7.

56° 3. ե11ացնtե1 կ. Տtենորti.'րոգոն

Q

5. Uոն1յGրl· UաUlաUUljl ան2աոոն

Նկ. 1.15. Chilex տիպի քրոմատոգրաֆիայի սխեման. 1-ին փուլ՝ բջիջների լիզիս, 2-րդ փուլ՝ Chilex խեժի ավելացում, ինկուբացում բարձր ջերմաստիճանի պայմաններում, 3րդ փուլ՝ խառնուրդի եռացում նուկլեազների ակտիվության արգելակման համար, 4-րդ փուլ՝ ԴՆԹ-ի անջատում ցենտրիֆուգման եղանակով, 5-րդ փուլ՝ ԴՆԹ-ն սուպերնատանտի կազմում պատրաստ է հետազոտման համար (www.s-vfu.ru/universitet/rukovodstvo-istruktura/instituty/bgf/nilmb_bgf):

ԴՆԹ-ի անջատումը արյան կազմից Chilex խեժի օգտագործմամբ: Պրոցեսը կազմված է մի շարք փուլերից: Առաջին հերթին կատարվում է պրոտեինների և բջջային այլ տարրերի անջատում: Ապա լուծույթը եռացվում է Chilex 100 խեժի հետ, վերջում ստացվող սուպերնատանտը կարող է օգտագործվել կենսատեխնոլոգիական հետազոտություններում: 1. 2 մլ-անոց ցենտրիֆուգային փորձանոթ լցնել 1 մլ ստերիլ թորած ջուր և ավելացնել 5 մկլ թարմ արյուն կամ 3 մմ3 չորացած արյան նմուշ: Լավ խառնել: 2. 20 ր ինկուբացնել լուծույթը սենյակի ջերմաստիճանի պայմաններում ժամանակ առ ժամանակ խառնելով (խորհուրդ է տրվում օգտագործել ցենտրիֆուգային ռոտատորը): 3. Ցենտրիֆուգել 3 ր 10 000 պտ/րոպ արագությամբ, հետո զգուշորեն հեռացնել սուպերնատանտը, թողնել մի փոքր մնացորդ նստվածքը (բջիջները կամ հյուսվածքները) չխառնելու համար:

4. Ավելացնել 5 %-անոց Chilex 100 խեժ, հասցնելով ծավալը մինչև 200 մկլ (օգտագործել թորած ջրում լուծված Chilex-ի նատրիումի աղը: Օգտագործելուց առաջ խեժը խառնել լայնածայր պիպետով): 5. Ինկուբացնել 30 րոպե 56 ºС պայմաններում, ապա 10 վրկ թափահարել: 6. Եռացնել նմուշը 8 րոպե 95 ºС պայմաններում, ապա 10 վրկ թափահարել և ցենտրիֆուգել 3 րոպե 10 000 պտ/րոպ արագությամբ: 7. Անջատել սուպերնատանտը և օգտագործել նախատեսված հետազոտությունում: Սուպերնատանտի չօգտագործված մնացորդը կարող է պահվել -20 ºС պայմաններում մինչև հաջորդ փորձը: Մեթոդը բնութագրվում է կատարման ցածր ինքնարժեքով, արագությամբ, պարզությամբ, ավտոմատացման հնարավորությամբ, և, բացի բոլոր սովորական նմուշներից, կարող է կիրառվել նաև ոսկրից ԴՆԹ-ի անջատման համար, բայց ստացված ԴՆԹ-ն կտրտված է, երբեմն միաշղթա, վատ մաքրված և անկայուն: 1.3.1.7. Աֆինային քրոմատոգրաֆիա Քրոմատոգրաֆիայի այս եղանակը ադսորբցիոն քրոմատոգրաֆիայի տարատեսակ է: Այս մեթոդի հիմնական յուրահատկությունն այն է, որ սորբենտի մակերեսին ամրացված լիգանդները (կենսաբանական յուրահատուկ հատկանիշներով օժտված մասնիկները) կոմպլեմենտար են խառնուրդից անջատվող նպատակային նյութին: Դրա շնորհիվ միայն նպատակային նյութն է կապվում սորբենտին աֆինային կապով և մնում քրոմատոգրաֆիկ սյունում, նմուշ խառնուրդի բոլոր այլ բաղադրիչները ազատ անցնում են սյունով և դուրս գալիս: Այսպիսի բարձր յուրահատկությամբ բնութագրվող ընտրողական ադսորբցիան ապահովում է անջատվող նյութի մաքրման բարձրագույն մակարդակ: Աֆինային փոխազդեցությունը ոչկովալենտ է և կարող է հաղթահարվել կամ թուլացվել рН-ի փոփոխման միջոցով կամ կոմպլեմենտար կապի առաջացումը խոչընդոտող նյութերի ավելացման եղանակով:

Աֆինային քրոմատոգրաֆիայում ամենահաճախ օգտագործվող սորբենտը՝ սեֆարոզան կազմված է հատուկ եղանակով մշակված ագարոզի հատիկներից: ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի անջատման համար օգտագործվում են օլիգոնուկլեոտիդային բնույթի լիգանդներ: Օրինակ՝ այն դեպքում, երբ անհրաժեշտ է հյուսվածքի նմուշից անջատել որոշակի իՌՆԹ-ի բոլոր մոլեկուլները որպես լիգանդ օգտագործվում է համապատասխան գենի ԴՆԹ-ի որոշակի փոքր հատված: Կամ եթե իՌՆԹի նմուշով անհրաժեշտ է գտնել գենոմի ԴՆԹ-ում դրան կոդավորող գենը որպես լիգանդ օգտագործվում է իՌՆԹ-ի փոքր հատված: Աֆինային քրոմատոգրաֆիայի միջոցով նպատակային նյութի անջատման պրոցեսը կարող է ներկայացվել նկար 1.16-ում պատկերված սխեմայով: Uգարոգայ~նյ նանն~~

L~QաUll~ անրացոն

:յ +ն 0 ----:յր>

:le>,+~+~§-~~+§§

.

Uրiնորրց~ա

ՄԼ

~ -:յi> ՄԼ '1tiնորրց~ա

+l9

h. tնաQնորi11ոt'i գոնl[որi OUlարl UյոLlՀ)Gրl 0 lա11նորiրl[որi րարiա11րl'1lներi

Լ 1'1գան11, L LiաlllLնած 1'1գան11

U ան2աոlնորi րթtiրiաtն նiորթ ՄԼ կեննա1որiահաոոLt հաt'iաtllրl

Նկ. 1.16. Աֆինային քրոմատոգրաֆիայի կատարման փուլերի սխեման (https://es.niv.ru/doc/encyclopedia/chemistry/articles/126/affinnayahromatografiya.html):

Քրոմատոգրաֆիկ սյունակի մեջ ներմուծվում է լիգանդի հետ կապված ագարոզային սորբենտ: Ապա ավելացվում է լիգանդի նկատմամբ ակտիվ և անջատվող նյութը պարունակող խառնուրդը, օրինակ`

բջջի քայքայումից առաջացած հոմոգենատը: Լիգանդը կոմպլեմենտար կապվում է միայն կենսայուրահատուկ նյութի հետ և մնում ադսորբված սորբենտի վրա: Խառնուրդի այլ բաղադրիչները չեն կապվում լիգանդի հետ և, մնալով ազատ, լվացող բուֆերի հետ դուրս են գալիս սյունակից: Այս փուլից հետո թիրախ նյութը կարող է անջատվել լիգանդից որևէ եղանակով, օրինակ՝ անջատող բուֆերի կիրառմամբ (միջավայրի pH-ի փոփոխման, կամ կոմպլեմենտար կապն արգելակող նյութի ավելացման միջոցով), և դուրս հանվել սյունակից: Այժմ աֆինային քրոմատոգրաֆիայի մեթոդը լայնորեն օգտագործվում է բազմաթիվ ՀԾ-ների և ՀՄ-ների բացահայտման համար: Այս եղանակով անջատում են ֆերմենտները, հորմոնները, բջջային ռեցեպտորները, ՆԹ-ները և նուկլեոտիդները, լիպիդները և այլն: Աֆինային քրոմատոգրաֆիայի մեթոդը օգտագործվում է իմունաքրոմատոգրաֆիկ թեստերի՝ ԻՔՏ-ների ստեղծման համար: 1.3.2. Մագնիսային սեպարացիայի մեթոդ Մագնիսային սեպարացիան ժամանակակից հետազոտական մեթոդ է, որը հիմնվում է մագնիսային ուժերի օգտագործման վրա: Սովորական սորբենտային անջատման մեթոդի կատարելագործված այս եղանակը թույլ է տալիս զգալիորեն հեշտացնել և արագացնել ԴՆԹ-ի անջատման մեթոդը: Պետք է նշել, որ սիլիցիումով պատված երկաթի օքսիդը՝ Fe2O3 կամ, այլ կերպ, Fe2O3/SiO2 համալիրը հեշտությամբ աբսորբում է բջջի լիզատում գտնվող ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի մոլեկուլները: Ձևավորվող մասնիկները մագնիսով ֆիքսվում են փորձանոթում, իսկ լիզատի այլ բաղադրիչները առանց հատուկ մեթոդների կիրառման դուրս են գալիս կամ հեռացվում են: Համալիրների կազմի ՆԹ-ները ենթարկվում են դեսորբցիայի և կարող են օգտագործվել հետագա հետազոտություններում: Մեթոդի յուրահատկությունը կարող է օգտագործվել ԴՆԹ-ի նպատակային տարատեսակների անջատման համար, եթե մագնիսի

հետ փոխազդող սորբենտին միացվեն հատուկ աֆինային լիգանդներ կամ սորբենտը ձևավորվի ԴՆԹ-ի որոշակի տեսակի նկատմամբ աֆինություն դրսևորող բիոպոլիմերից և մոդիֆիկացվի երկաթի օքսիդով: Վերջին տարիների հետազոտություններում բացահայտվել է, որ մագնիսային մասնիկների սորբենտային արդյունավետության բարձրացման համար անհրաժեշտ է ձևավորել փոքր կլոր նանոմասնիկներ՝ beads, որոնց ադսորբցիոն հատկանիշները ավելի բարձր են քան մեծ կամ տձև մասնիկներինը: ԴՆԹ-ի փոքր մոլեկուլները փաթաթվում են նանոմասնիկների շուրջը և ավելի լավ անջատվում լիզատից: Վերջերս առաջարկվել է ՆԹ-ների անջատման եղանակ, որի համաձայն նանոմասնիկները կազմվում են մագնիսային միջուկից և շրջապատող ցելյուլոզային պատանից: Որպես մագնիսային միջուկ օգտագործվում են մագնիսավորված նիկելի կամ երկաթի օքսիդներ: Ընդհանուր առմամբ ՆԹ-ների անջատումը մագնիսային ուժերի օգտագործման եղանակով կատարվում է նկար 1.17-ում բերվող սխեմայով. 1. Հետազոտվող նյութը պարունակող փորձանոթ ներմուծվում են բջջաթաղանթները քայքայող նյութերիխումբ և պրոտեինկինազ K, որը ապաակտիվացնում է բջջային ֆերմենտները և բնափոխում սպիտակուցները: 2. Ստացված լիզատին ավելացվում են մագնիսի հետ փոխազդող նանոմասնիկները: 3. ՆԹ-ները կապվում են սորբենտի մասնիկներին և մագնիսի ազդեցությամբ հավաքվում են փորձանոթի հատակում: 4. Լիզատը հեռացվում է փորձանոթից իսկ ԴՆԹ-սորբենտ համալիրները լվացվում են: Լվացումը պետք է կրկնել մի քանի անգամ: Լվացման համար օգտագործվում են թորած ջուրը կամ թույլ աղային լուծույթներ: 5. Դեսորբցիան կատարվում է թույլ բուֆերային լուծույթով և ՆԹ-ներ պարունակող լուծույթը տեղափոխվում է այլ փորձանոթ: Նմուշը պատրաստ է հետազոտությունների համար:

Ii

v

•

►

►

►

►

►

նllո2 ~այDայորi. K LկDոlll Uագ.նոն U

►

►•

Lt.lացո~ Uն2աlllկ. րո:j)եոհ -ագհ գ.նրiեոո· ագ. l'U. t նոացոա uրa աt.11:itացո~ աt.11:itաց.աt.ll:itաց. րաժանո~ llll:ill.աt.րոjնո~ (յհ

Նկ. 1.17. ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի անջատումը մագնիսային մասնիկների օգտագործման եղանակով (http://www.veld.kz/index.html?id=2243):

Սովորաբար մագնիսը ամրացվում է անոթի պատին, որտեղ և հավաքվում են մագնիսավորված մասնիկները: Չմիացած նյութերը հեշտ արտահանվում են: Այս եղանակով հեռացվում են ԴՆԹ պոլիմերազ ֆերմենտների ինհիբիտորները՝ բազմաշաքարները, ֆենոլային կոմպոնենտները, հումուսը: Մագնիսային կրողները պատրաստվում են տարբեր նյութերից՝ սինթետիկ պոլիմերներից, կենսապոլիմերներից, ծակոտկեն ապակուց կամ անօրգանական մշակված մակերեսով մագնիսային երկաթից: Ամենահարմարն են գերմագնիսային մասնիկները, որոնք չեն փոխազդում մագնիսային դաշտի բացակայության պայմաններում: Այսպիսով՝ դաշտի անջատումից հետո ԴՆԹ-ի հետ կապված մագնիսային մասնիկները, դառնալով չեզոք, անցնում են լուծույթի կազմ և մշակվում դեսորբցիա առաջացնող նյութերով: Անջատված ՆԹ-ները լուծվում են լուծույթում, իսկ սորբենտի մասնիկները իջեցվում են նստվածք միացված մագնիսային դաշտի ազդեցությամբ: ՆԹ-ները տեղափոխվում են այլ անոթ:

Այժմ արդեն բազմաթիվ ֆիրմաներ՝ Qiagen, AnalytikJena, ThermoFisher և այլն արտադրում և առաջարկում են փորձի կատարման համար անհրաժեշտ պարագաների պատրաստի հավաքածուներ: Մեթոդի առավելություններից է մեծ քանակությամբ ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի անջատման հնարավորությունը: Նպատակային մոլեկուլների կորուստի բացառումը անջատման պրոցեսում: Կոնտոմինացիայի առաջացման վտանգի բացառումը ամբողջ ՆԹ-ների ադսորբցիայի շնորհիվ: Ստացված նմուշի մաքրության բարձր մակարդակը: Որպես հիմնական թերություն նշվում է մեթոդի թանկարժեքությունը: 1.3.3. Խելոք էքստրակցիայի մեթոդ Վերջին տարիներին Analytik Jena ֆիրմայի մասնագետները առաջարկեցին ԴՆԹ-ի անջատման համար օգտագործվող սորբենտի բավարար ակտիվության աստիճանի ստեղծման համար կիրառել քաոտրոպ և ոչքաոտրոպ աղերի խառնուրդ: Առաջարկված մեթոդը անվանվեց DualChemistry: Ավելի ուշ նույն ֆիրմայի աշխատակիցները բարելավեցին DualChemistry մեթոդը փոխարինելով սորբենտի մագնիսային մասնիկները ոչմագնիսային, բայց խելոք մակերեսով մասնիկներով: Փորձի կատարման համար օգտագործվում է խելոք մակերեսով մասնիկներ պարունակող դոզատորի ծայրակալ (նկ. 1.18): Ինչպես և ՆԹ-ների անջատման բոլոր այլ մեթոդների ժամանակ առաջին փուլում կատարվում է բջիջների քայքայյում լուծող բուֆերով և պրոտեինկինազ ֆերմենտով: Ապա լիզատը ծայրակալի միջոցով հավաքվում է դոզատորի մեջ: Լիզատի ՆԹ-ները կապվում են ծայրակալում գտնվող մասնիկներին, լիզատը հեռացվում է: Լվացված մասնիկներից ԴՆԹ-ները դեսորբվում են և պատրաստ են հետազոտությունների համար:

uմո2րն աljե1աgljոմ , t 1ո6ոզ րոlեր l, UյլlոU1երնljրնազ K: UUյա րնljորաgljո

-.

I~

P22այր0 1: զաU1Q հաljազljոմ t iuե1ոյl մաuնրljներ Ujարոնաljոզ նայլ1աljա1ր մե2:

uilոշQ ll!աUlլlաUUl

t

. • ' ·

· t">նljորաgljոմ

Նկ. 1.18. ԴՆԹ-ի անջատում խելոք մակերեսով մասնիկների օգտագործմամբ (http://propionix.ru/sekvenirovaniye-i-ptsr):

1.4. ՆԹ-ՆԵՐԻ ԱՎՏՈՄԱՏԻԿ ԱՆՋԱՏՄԱՆ ՍԱՐՔԵՐ

Այժմ արդեն ՆԹ-ների անջատման համար օգտագործվում են բազմաթիվ ֆիրմաներում արտադրվող ավտոմատիկ սարքեր: Սարքերի մեծ մասի աշխատանքային պրոցեսում օգտագործվում է մագնիսային փոխազդեցություններով պայմանավորված մեթոդը: Ավտոմատիկ կայանները կատարում են ՆԹ-ների անջատումը արագ և արդյունավետ: Դրանց աշխատանքում օգտագործվող նյութերը համապատասխան ֆիրմաները արտադրում են որպես ռեագենտների հավաքածուներ: ՆԹ-ների ավտոմատիկ անջատման համար որոշ դեպքերում օգտագործվում են ապակեպատ մագնսային մասնիկներ (J. Hoorfar, N. Cook, et al, 2003): ՆԹ-ն կապվում է մասնիկների ապակե մակերեսին և անցնում մշակման փուլերը Boom-ի մեթոդի համաձայն: Չնայած մեթոդը ապահով է և հարմար, սակայն հնարավոր են ՆԹ-ների կորուստներ ինչպես մասնիկներին կպած մոլեկուլների, այնպես էլ լվացումների ժամանակ կորցրածների հաշվից: ՌՆԹ-ները և ԴՆԹ-ները կարող են անջատվել միասին: Վերջում, եթե նպատակն է անջատել ԴՆԹ-ն, ՆԹ-ների խառնուրդը մշակվում է ՌՆԹ-ազներով և հակառակը՝ ՌՆԹ-ի անջատման համար օգտագործվում են ԴՆԹ-ազ ֆերմենտները:

Որպես օրինակ ներկայացնում ենք MagMAX™ Express Magnetic Particle Processors-ների երկու տարատեսակի սարքերը (նկ. 1.19, 1.20):

Նկ. 1.19. MagMAX™ Express-24 Նկ. 1.20. MagMAX™ Express-96 (http://www.spt.by/content/view/1006/9/):

MagMAX™ Express-24-ը միաժամանակ մշակում է 24 նմուշ, MagMAX™ Express-96-ը՝ 96: MagMAX™ Express տեխնոլոգիայի հիմքում ընկած է մագնիսային սորբենտային մասնիկների օգտագործումը: Հետազոտվող նմուշների լիզիսից հետո ՆԹ-ները հատուկ բուֆերային միջավայրում ադսորբվում են մագնիսային մասնիկների մակերեսի վրա: Ապա մագնիսային մասնիկներ* ՆԹ-ներ համալիրները, օգտագործելով մագնիսային ուժերը, տեղափոխվում են լվացող բուֆեր պարունակող այլ անոթ: Մի շարք լվացումներից հետո ՆԹ-մագնիսային մասնիկ համալիրները մշակում են սոլյուցիա առաջացնող լուծույթով: Դեսորբված ՆԹ-ները անցնում են լուծույթ, իսկ մագնիսային մասնիկները հեռացվում են: Մագնիսային մասնիկների տեղափոխումը անոթից անոթ կատարում են պլաստիկ պատյանների մեջ գտնվող սռնիներով: Քանի որ նուշները մեկուսացված են առանձին անոթներում, կոնտոմինացիայի հավանականությունը շատ ցածր է: Բոլոր նմուշները մշակվում են զուգահեռ՝ նույն ժամանակում, ուստի պրոցեսը շատ արագ է ընթանում: Աշխատանքների կատարման համար օգտագործվում են ռեագենտների ամբողջական հավաքածուներ:

MagMAX™ Express տեխնոլոգիայով բոլոր տեսակի ՆԹ-ները՝ միկրո-ՌՆԹ-ները, հյուսվածքային արտաբջջային ՆԹ-ները, բջջային կուլտուրաների ՆԹ-ները անջատվում են բոլոր նմուշներից՝ բակտերիաներից, վիրուսներից, նվազ թվով բջիջներից և բջիջ չպարունակող նմուշներից: Փորձի համար օգտագործվում են երկու տեսակի սռնիներ կրող տախտակներ, որոնք թույլ են տալիս աշխատել 10-ից 200 և 200-ից 1000 մկլ ծավալների հեղուկի հետ (նկ. 1.21): Գրեթե նույն սկզբունքով են աշխատում Zinexts ֆիրմայի MagPurix 12s փոքր սեղանային ռոբոտիզացված համալիրները:

f

,:;,• •~a e'~ l""l'յյlաP'I

Նկ. 1.21. Սարքերում օգտագործվող պարագաներ. 1 - ռեագենտների հավաքածու և 96 խցիկ պարունակող պլանշետներ, որոնք օգտագործվում են MagMAX™-96 Viral RNA Isolation Kit տիպի սարքի աշխատանքի համար (անջատում են վիրուսային ԴՆԹ-ները և ՌՆԹ-ները), 2 - տախտակներ՝ 96 սռնիով (http://www.spt.by/content/view/1006/9/):

Ներկայումս արտադրվող ՆԹ-ների էքստրակտորների ամենահայտնի

տեսակներն

են

NUCLISENS®EASYMAG®,

գերմանական

Qiagen ֆիրմայի EZ1 AdvancedXL, Ա QIAsymphonySP, 8-31-01 NorDiag Arrow (DiaSorin) և GenoXtract®, KingFisherFlex 96 (ThermoScientific) ու շատ ուրիշները: NUCLISENS®EASYMAG® սարքի աշխատանքային պրոցեսի փուլերը ներկայացվում են նկար 1.22-ում:

~~urորակցt,այt, uկqրոՇI~[! U. Բ22այրU [րգաlilր րնկորացրաjր LLl[iոցl:iնոն րո[ո[l նրo-Ul:iրl[! կաtijկոն l:iն նագնրնա-նհ1հliա1րն նանն_րկնl:iրր նակ1:iրl:iնհն : Բ. LյագնրUայրU Uա[ljե)[l UjահոLU t րո[ո[l նաննրկնl:iր[l I.. աUjահոկոն նlo-նl:iրր աLI2աlilոLU 1րգաU1րց tLlացոնՇյl:iրlր [!UրlաQյերոLU: . Q, Տաiերացնան Uj[lոցl:iնոնl նlo-UG[l[! ան2աU1կոն ծն1 նորրl:iնUlր llաննրկնtրրց: '1. կl:iրl2ոLU նlo-Ul:i[l[! ան2աU1կոն l:iն նորրl:iնUlրց նագնրUայրU UարlյերԲ oգ նյոLրlյաUր:

=ր7 ~-'0

յ ~~ ~

ր7 =·7 \~ ~

i==i.1~

Uագնtiն U. tՊiնljորացtiա , Բ. Litացոն'i ՏաQացնորi նար,Q Uրiնոր,րցրա 0 . t նոցtiա '1. Ll.եր,2նական l'iաQր,ոն'i Նկ. 1.22. NUCLISENS® EASYMAG® սարքի աշխատանքային պրոցեսի սխեման (https://www.biomerieux-russia.com/Клиническаядиагностика/продукт/экстрактор-нуклеиновых-кислот):

1.5. ՑԵՆՏՐԻՖՈՒԳՄԱՆ ՄԵԹՈԴ

Վերջին տասնամյակներում մոլեկուլային գենետիկայի բազմաթիվ խնդիրների լուծման համար մշակվող մեթոդների մի մասը հիմնվում է ցենտրիֆուգացիայի մեթոդի վրա: Ցենտրիֆուգացիայի ազդեցությունը պայմանավորված է նրանով, որ կենտրոնախուսման դաշտում տարբեր ձևի, չափսի և խտության մասնիկները տարատեսակ են իջեցվում նստվածք՝ ունեն սեդիմենտացիայի տարբեր արագություն: Ցենտրիֆուգումը օգտագործվում է բարդ դիսպերսիոն խառնուրդների և բջջային օրգանելների թորամասերի բաժանման, մեծ մոլեկուլների՝ սպիտակուցների և ՆԹ-ների բաժանման և մոլեկուլային զանգվածի որոշման համար: Կենտրոնախույս ուժի չափը պայմանավորված է պտտման արագությամբ և նմուշների հեռավորությամբ կենտրոնական առանցքից: Ցենտրիֆուգումը լինում է պատրաստուկային և վերլուծական: Պատրաստուկայինը օգտագործվում է կենսաբանական նյութերի

անջատման համար: Վերլուծականը օգտագործվում է մաքուր նյութերի կամ մասնիկների հետազոտման համար: Բարձր արագության՝ 20 000 պտ/րոպ արագ պատրաստուկային ցենտրիֆուգումը օգտագործվում է մինիմասնիկների, մակրոմասնիկների և կորիզի տարաբաժանման համար (նկ. 1.23): Այս տարբերակը կոչվում է դիֆերենցիալ կամ տարատեսակող ցենտրիֆուգում և պայմանավորված է տարատեսակ չափսերով ու խտությամբ օժտված մասնիկների սեդիմենտացիայի արագության տարբերություններով: Սկզբում բոլոր մասնիկները հավասար բաշխված են ցենտրիֆուգային փորձանոթի ծավալով: Ցենտրիֆուգման ընթացքում դրանք սեդիմենտացվում են ըստ իրենց չափսերի և խտության:

ն t,

Ը 5C

2..

~

C C.

s

~

.D

յ

ր

... .•... .. .. o•,, .. .

~~ ~ · ... ... . •

b

.. , A• •

')

....,.. ... ,. ··.·

· · ••:

6,,..:

..

•::,2

ե

Lոoորi նiոiթ

.: . .:- .

.. ,..

6./).6 b,.

••:.2

9ենl11ր,tilրոգtlան ԸtաtlանաLto

Uանր, tlաննtil.lներi Ut°'lր ն112tiն tlաննtiLtներi UUlր lնո2որ, tlաննtil.lUերl

Նկ. 1.23. Տարատեսակող ցենտրիֆուգման սխեմատիկ պատկերը: ՄաՖ՝ մակրոսոմալ ֆրակցիա (միթոքոնդրիումներ, լիզոսոմներ), ՄիՖ՝ միկրոսոմալ ֆրակցիա (մեմբրանի հատվածներ, ռիբոսոմներ) (https://www.google.ru/search):

Օրինակ՝ բակտերիաների բջիջները նստվածք իջեցնելու համար կատարում են ցենտրիֆուգում 5-ից 10 րոպե՝ 3000-5000 պտ/րոպ արագությամբ: Ներբջջային մակրոսոմալ ֆրակցիաների միտոքոնդրիումները և լիզոսոմները նստվածք իջեցնելու համար պահանջվում է կատարել ցենտրիֆուգում բարձր՝ 20 000 պտ/րոպ և ավելի արագությամբ, 20 րոպե: Ամեն փուլի ավարտից հետո սուպերնատանտը՝ վերնստվածքային ֆրակցիան անջատվում է և նստվածքը մի քանի անգամ լվացվում է խառնուրդների հեռացման նպատակով: Ցավոք, լիովին մաքուր նմուշ ստանալ գրեթե չի հաջողվում: Հաջորդ փուլում ավելի մանր և թեթև մասնիկներ պարունակող սուպերնատանտը

ենթարկվում է ցենտրիֆուգման՝ ավելի բարձր արագությամբ: Ամբողջ պրոցեսը կրկնվում է: Այսպես փուլ առ փուլ անջատվում են ավելի և ավելի փոքր մասնիկները: Միկրոսոմալ ֆրակցիան՝ մեմբրանի հատվածները և ռիբոսոմները նստվածք են իջնում 200 000 պտ/րոպ արագությամբ 1 ժամ ցենտրիֆուգումից հետո: Վերջին տասնայմակներում առաջարկվել են ցենտրիֆուգման մի շարք եղանակներ: 1.5.1. Բարձր արագության գոտային ցենտրիֆուգում Ցենտրիֆուգման այս տարատեսակը կատարվում է որոշակի նյութի գրադիենտներում. ցենտրիֆուգումը խտության գրադիենտներում կոչվում է նաև s գոտային ցենտրիֆուգում: Խտության գրադիենտները լինում են անընդհատ՝ հետզհետե փոփոխվում բարձրագույնից դեպի փոքրագույն կամ սանդղակային՝ առաջացնում խտությունների 2-3 շերտեր: Դրանց պատրաստման համար պիպետով ավելի ցածր խտության լուծույթը ավելացվում է փորձանոթի առաջին շերտում գտնվող ավելի բարձր խտությամբ լուծույթի վրա՝ ձևավորելով ինքնուրույն շերտեր: Շերտերի քանակը կախված է նախատեսվող հետազոտության խնդրից: Այն դեպքերում երբ շերտերի քանակը մեծ է կարելի է խոսել խտությունների անընդհատ շարքի մասին: Ցենտրիֆուգումը խտության գրադիենտներում լինում է երեք տեսակի՝ գոտիներ առաջացնող, իզոպիկնոտիկ և հավասարակշռող: s գոտային ցենտրիֆուգում կատարելու համար նմուշը ավելացվում է լուծույթի խտությունների անըննդհատ շարքի մակերեսի վրա (նկ. 1.24.): Այնուհետև կատարում են ցենտրիֆուգում, մինչև նյութերի մասնիկները դասավորվեն սյունում ըստ խտությունների գրադիենտի, առաջացնելով առանձին գոտիներ կամ շերտեր: Խտությունների գրադիենտի շնորհիվ ներթափանցումը նյութերի միջև արգելակվում է:

Պ' յեր

~

Ը:-

Ը:. CT

Պ'3 ~ Ը

րatրat. llաuuրկuե11 uր2րԸ. llաuuրկuե11

•t Ո •: նաu11 llաuuրկuե11

.2

Նկ. 1.24. Բարձր արագության գոտային ցենտրիֆուգման սխեման (Е.В. Воробьева, 2005):

Այժմ գոտիներ առաջացնող ցենտրիֆուգումը զուգավորում են որևէ այլ մեթոդի հետ՝ թորամասերի ավելի հստակ բաժանման համար: Օրինակ՝ ցեզիումի քլորիդի ինքնաձևավորվող գրադիենտներում քայքայված բջիջների տարրերը ցենտրիֆուգման պրոցեսում հետզհետե դասավորվում են որոշակի ճշգրիտ հերթականությամբ, և յուրաքանչյուր թորամաս կազմված է որոշակի միավորներից կամ մոլեկուլներից (նկ. 1.25): Բաժանոյաo

8ե Շյ l1111 tՊl '.jրո զո ul '-----'~=-=ա=Ըu::.::u=Շ e..:t:i!յ.!l.!__յ

§8

ՇsՇI

julilոLf!յաU Qf)ար)t,t:iulյl

__/

ՑԸt.

կ

Նկ. 1.25. Բջջային հոմոգենատի բաժանումը թորամասերի CsCl-ի գրադիենտում ցենտրիֆուգման եղանակով (http://www.chem.msu.su/rus/teaching/kolman-/202.htm):

ՆԹ-ները բջջի ցածրամոլեկուլային տարերից անջատելու համար ցենտրիֆուգումը զուգավորվում է դոնդողային ֆիլտրման կամ ընտրողական ադսորբցիայի մեթոդների հետ: Մասնիկները սուզվում են լուծույթում, եթե դրանց խտությունը բարձր է լուծույթի խտությունից և մնում են լուծույթի մակերեսին, եթե մասնիկների խտությունը զիջում է լուծույթի խտությանը: Սուզվելը կոչ49

վում է սեդիմենտացիա, իսկ մակերեսին բարձրանալը՝ ֆլոտացիա: Երբ մասնիկների և լուծույթի խտությունները հավասար են մասնիկները մնում են անշարժ (իզոպեկնիկ պայմաններ): Մասնիկների սեդիմինտացիոն հատկությունները բնութագրվում են սեդիմենտացիայի գործակիցով՝ S-ով և հաշվարկվում են Սվերբերգի միավորներով: Իզոպեկնիկ ցենտրիֆուգում: Իզոպեկնիկ ցենտրիֆուգումը կատարում են և խտությունների գրադիենտում և հասարակ լուծույթում: Հասարակ լուծույթի դեպքում սկզբում կատարում են ցենտրիֆուգում, որի ժամանակ հետազոտվող նյութի ծանր մասնիկները իջեցվում են նստվածք և հեռացվում են: Այնուհետև կատարում են հետաքրքրող նյութի ցենտրիֆուգում այնքան ժամանակ, մինչև նպատակային նյութի մասնիկներն իջնում են նստվածք, իսկ թեթև մասնիկները բարձրանում են մակերես (նկ. 1.26):

u

ր

Հt:ոոազոոlորi. oանրi i:iաննtilրներiti ննն,կաo9

Նկ. 1.26. Հասարակ լուծույթում իզոպեկնիկ ցենտրիֆուգման սխեման. Ա - փորձի սկզբում նմուշի մասնիկները հավասար բաշխված են ամբողջ ծավալով, Բ - ցենտրիֆուգման վերջում թեթև մասնիկները անցնում են մակերես, իսկ նպատակային նյութը իջնում է նստվածք (Е.В. Воробьева, 2005):

Իզոպեկնիկ ցենտրիֆուգումը խտությունների անընդհատ գրադիենտում Կատարման համար նմուշը տարածում են լուծույթի մակերեսին: Ցենտրիֆուգումը կատարում են այնքան ժամանակ մինչև մասնիկների լողայնությունը հավասարվում է լուծույթի խտության գրադիենտին որոշակի շերտում, այսինքն՝ մինչև տարբեր չափսերի մասնիկները բա50

ժանվում են շերտերի: Այս եղանակը անվանվեց գոտային-իզոպեկնիկ ցենտրիֆուգում, քանի որ հիմնված է մասնիկների խտությունների վրա: Ամփոփելով ներկայացված մեթոդները՝ կարելի է եզրակացնել, որ ՆԹ-ների անջատման պրոցեսը պետք է լինի կարճատև, ենթարկվի ավտոմատացման, ապահովի ՆԹ-ների մաքրման բարձր մակարդակ և բավարար քանակների անջատում, ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի առանձին անջատման հնարավորություն: Արդեն արտադրվում կամ նախապատրաստվում են արտադրման ՆԹ-ների անջատման ավտոմատ համակարգեր, օրինակ՝ BioRobotEZ1 (QIAGEN) և MagNAPureLCinstrument (Roche) (նկ. 1.27):

Նկ. 1.27. Նուկլեինաթթուների ավտոմատ էքստրակտոր MagCore® HF16, որն օգտագործվում է արյան, կենդանական և բուսական հյուսվածքներից ՆԹ-ների անջատման համար, գործում է MagCoreտիպի մագնիսային մասնիկների կիրառությամբ (https://yandex.ru/images/search?text):

Սպասվում է նոր կատարելագործված համակարգերի ստեղծում: Օրինակ՝ Ռուսաստանի անալիտիկ սարքավորումների գործարանում մշակվել է ՆԹ-ներ անջատող համակագ, որում օգտագործվում է, այսպես կոչված, «մագնիսային ռոտացիայի» մեթոդը: Մագնիսային մասնիկները ՆԹ-ների հետ միասին ադսորբվում են լուծույթ տեղադրված սռնիների վրա, որոնք ապա տեղափոխվում են հաջորդ ռեակցիոն միջավայր: Նոր միջավայրում մագնիսային դաշտն անջատելուց հետո սռնիները պտտում և հավասար բաշխում են մագնիսային մասնիկները

սուսպենզիայում: Այս եղանակով ապահովվում է լուծույթների մաքուր մնալը և կատարվող պրոցեսների ճշգրիտ կատարումը: Մշակվող սարքի փորձարկումները շարունակվում են:

1.6. ՆԹ-ՆԵՐԻ ԱՆՋԱՏՈՒՄ FTA ՇԵՐՏԻԿՆԵՐԻ ԵՂԱՆԱԿՈՎ

ՆԹ-ների անջատման մեկ այլ ժամանակակից եղանակ է FTA շերտիկը, որը կազմված է խիտ բուֆերային լուծույթով հագեցված ցելյուլոզային ֆիլտրից (Ватман BFC180): Բուֆերային լուծույթի տարրերը քայքայում են բջիջները, բնափոխում սպիտակուցները, պաշտպանում ԴՆԹ-ն օքսիդացումից, նուկլեազներից և ուլտրամանուշակագույն ճառագայթներից: FTA շերտիկները արագ չեզոքացնում են հարուցիչների բջիջները, արգելակում դրանց բազմացումն ու աճը: Բջջային մեմբրանները և օրգանոիդները քայքայվում են, բայց ԴՆԹ-ները կապվում են շերտիկի թելիկներով և ֆիքսվում, մնում անվնաս: Այս վիճակում նմուշները կարող են պահվել երկար ժամանակ՝ սենյակի ջերմաստիճանի պայմաններում, և տեղափոխվել մեծ հեռավորությունների վրա: FTA շերտիկների մեթոդի առավելություններից են փորձի կատարման անվտանգությունը, նմուշների պահպանման երկարատևությունը, բարձրորակ նմուշների պատրաստման արագությունը (Н.Е. Аукенов и др., 2014): ԴՆԹ-ի արագ ստացման մեկ այլ մեթոդ է անջատումը սիլիկիումի կիրառմամբ: Այս դեպքում բջջային էքստրակտին ավելացվում է բացի ԴՆԹ-ներից բջջի բոլոր այլ տարրերը քայքայող գուանիդին թիոցիանատը: ԴՆԹ-ն միանում է սիլիկիի գնդերին, ապա էլյուացվում լուծույթի մեջ: ԴՆԹ-ի անջատման այս եղանակին բնորոշ են բարձր արագությունը, հեշտ կատարումը, ինհիբիտորների հեռացումը, ավտոմատացման հնարավորությունը: Թերություններից է ոչ արդյունավետ անջատումը փոքրածավալ նմուշներից: Այժմ

ԴՆԹ-ների

բացահայտման

համար

ավելի

հաճախ

օգտագործվում են թեստ-համակարգեր (kit), որոնք աչքի են ընկնում

բարձր ճշգրտությամբ և զգայունությամբ: Օրինակ՝ վարակիչ հիվանդությունների ախտորոշման նպատակով օգտագործում են պատրաստի թեստ-համակարգեր՝ «ДНК-экспресс (Литех, Москва)», «ПробаНК» «ДНК-технология», «DNA Purification and Extractionkit» (Promega, USA) և այլն: Այսպիսով՝ ԴՆԹ-ի անջատման մեթոդի ընտրությունը պետք է կատարվի նախատեսվող հետազոտությունների նպատակներին համապատասխան՝ հաշվի առնելով հետազոտվող նմուշի և ՆԹ-ների առանձնահատկությունները: Կարևոր է հիշել, որ անջատման մեթոդի ճիշտ

ընտրությունը

կապահովի

նախատեսվող

հաջողությունը:

աշխատանքների

ԳԼՈՒԽ 2. ՆԹ-ՆԵՐԻ ՀԵՏԱԶՈՏՄԱՆ ԵՂԱՆԱԿ՝

ԷԼԵԿՏՐԱՖՈՐԵԶ

2.1. ԷԼԵԿՏՐԱՖՈՐԵԶԻ ԸՆԴՀԱՆՈՒՐ ԲՆՈՒԹԱԳԻՐԸ

Էլեկտրաֆորեզը էլեկտրական դաշտում մոլեկուլների շարժն է դեպի կատոդ կամ անոդ՝ դրանց գումարային լիցքին համապատասխանող արագությամբ: Էլեկտրաֆորեզի մեթոդը թույլ է տալիս բաժանել մակրոմոլեկուլները դրանց չափսերի, կառուցվածքի, էլեկտրական լիցքի համաձայն և կարող է կիրառվել տարբեր նյութերի ինչպես որակական, այնպես էլ քանակական հետազոտման համար: Նշենք, որ մեթոդը բավականին հասարակ է և ճշգրիտ, որի շնորհիվ լայն օգտագործվում է մակրոմոլեկուլների ուսումնասիրման համար: Արյան շիճուկի սպիտակուցների բաժանման համար այս մեթոդը առաջինը կիրառել է Ա. Տիզելիուսը 1930 թ., իսկ 1948 թ. այդ աշխատանքի համար արժանացել է Նոբելյան մրցանակի: Անցյալ դարի 70-ական թվականներին հայտնաբերվել է էլեկտրաֆորեզի եղանակով ԴՆԹ-ների չափսերի որոշման հնարավորությունը: Պարզվել է նաև, որ էլեկտրաֆորեզի եղանակով բաժանվող ԴՆԹ-ի տարբեր չափսի հատվածները կարող են առանձնացվել և առանձին հետազոտվել: Էլեկտրաֆորեզը ակտիվ օգտագործվում է մակրոմոլեկուլների հետազոտման համար տարբեր բնագավառներում՝ կենսաքիմիայում, մոլեկուլային կենսաբանությունում, մոլեկուլային գենետիկայում, կլինիկական ախտորոշումներում, կենսատեխնոլոգիայում: Նշենք նաև, որ վերջին տասնամյակներում մշակվել են էլեկտրաֆորեզի նորագույն մեթոդներ և տեխնոլոգիաներ, որոնք ընդլայնել են մեթոդի հետազոտական հնարավորություններն ու կիրառման բնագավառները: Էլեկտրաֆորեզի հիմքում ընկած է այն օրինաչափությունը, համաձայն որի բուֆերային լուծույթում գտնվող մակրոմոլեկուլներն ունենում են որոշակի գումարային էլեկտրական լիցք, որի մեծությունը և նշանը պայմանավորված են ինչպես մոլեկուլների սեփական լիցքով, այնպես էլ միջավայրի рН-ով:

Եթե լուծույթ պարունակող մեկուսացնող խողովակով անցկացվի էլեկտրական հոսանք, խողովակում կձևավորվի էլեկտրական դաշտ: Էլեկտրական դաշտի լարվածությունը պայմանավորված է խողովակի երկու ծայրերում ձևավորվող էլեկտրական լարվածության տարբերությամբ և դրանց հեռավորությամբ: Այսինքն՝ կարող է հաշվարկվել V/sm բանաձևով, որտեղ V-ն լարվածությունների տարբերությունն է, իսկ sm-ը՝ խողովակի երկարությունը: Էլեկտրական դաշտի ազդեցությամբ մակրոմոլեկուլները իրենց գումարային լիցքի համաձայն շարժվում են դեպի անոդ (+), եթե լիցքը բացասական է, կամ կատոդ (-), եթե լիցքը դրական է, շարժման արագության վրա ազդում է նաև միջավայրի հետ շփման ուժը: Շարժման արագությունը ձևավորվում է մակրոմոլեկուլների էլեկտրական լիցքին, մոլեկուլների չափսերին և կառուցվածքին համապատասխան: Ուստի շարժի պրոցեսում տարբեր մոլեկուլների խառնուրդից կազմված նմուշը բաժանվում է մի քանի խմբի՝ թորամասի, որում հավաքվում են նույն լիցքն ու չափսերն ունեցող և նույն արագությամբ շարժվող մոլեկուլները: Այսօր օգտագործվող էլեկտրաֆորեզի տարբերակները նախատեսում են դոնդողի օգտագործում: Խողովակի բուֆերային լուծույթում գտնվող դոնդողը, ցանցային կազմության շնորհիվ, նպաստում է թորամասերի կայունությանը և ավելի ճշգրիտ բաժանմանը: Շարժվող մակրոմոլեկուլները, բախվելով դոնդողի ձողերին փոխում են դրա ցանցային կազմությունը, և շարժը դանդաղում է: Եթե դոնդողի ցանցի խորշերի և մակրոմոլեկուլի չափսերը մոտ են, շարժի արագությունը նվազում է զգալի չափով, և այս դեպքում արագության վրա ազդում է միայն մակրոմոլեկուլի երկարությունը: Հնարավոր է նույնիսկ, որ շատ խոշոր մոլեկուլները ամբողջովին կկլանվեն խորշերի կազմ և դրանց շարժը կարգելակվի: Ուստի դոնդողի պատրաստման ժամանակ պետք է հաշվի առնվեն և հետազոտության թիրախ նյութի, և դոնդողի կառուցվածքային առանձնահատկությունները: Դոնդողների պատրաստման համար օգտագործվող կրիչ նյութերը պետք է՝ - լինեն հարմար դոնդողի պատրաստման համար,

- ունենան

ջերմափոխանակման

բարձր

մակարդակ՝

հեշտ

սառեցվեն, - օժտված լինեն կոնվեկցիան նվազեցնելու ունակությամբ, - քիմիական տեսակետից չեզոք բաժանվող նյութերի նկատմամբ և չունենան ադսորբցիոն հատկություններ, - չունենան մակերեսի վրա լիցքավորված խմբեր և չառաջացնեն էնդոէլեկտրաօսմոս: Ժամանակակից հետազոտություններում սովորաբար օգտագործվում են պոլիակրիլամիդային՝ ՊԱԱԴ կամ ագարոզային դոնդողներ: ՊԱԱԴ-ի կամ ագարոզային դոնդողի խտության փոփոխման միջոցով հնարավոր է ձևավորել տարբեր չափսի խորշեր ունեցող բազմազան տարբերակներ: Կենսաբանական բարդ նյութերի՝ ՆԹ-ների և սպիտակուցների մոլեկուլները կազմված են լիցք ունեցող մոնոմերներից և ամբողջական պոլիմերային մոլեկուլի լիցքը հավասար է մոնոմերների լիցքի գումարին: Ամեն մի նուկլեոտիդ ունի 1-ի հավասար բացասական լիցք իսկ ամբողջական մոլեկուլի լիցքը հավասար է դրա կազմում գտնվող մոնոմերների քանակին: Սպիտակուցների կազմի ամինաթթուները կարող են լինել դրական կամ բացասական լիցքավորված և ամբողջական մոլեկուլի լիցքը հավասար է դրանց գումարային լիցքին: Պինդ միջավայրում մոլեկուլների շարժման արագությունը ձևավորվում է էլեկտրական դաշտի լարվածության և բուֆերային միջավայրում իոնիզացված մասնիկների լիցքի հարաբերությանը համապատասխան: Նույն լիցք, բայց տարբեր զանգված ունեցող մոլեկուլները շարժվում են տարբեր արագությամբ՝ այս երևույթի պատճառը լիցք/մասսա հարաբերության տարբերությունն է: Այսպիսով՝ ՆԹ-ների մոլեկուլների տարբեր լիցքավորվածության և զանգվածների շնորհիվ դրանք էլեկտրական դաշտում շարժվում են տարբեր արագությամբ և բաժանվում են թորամասերի: Բնական մակրոմոլեկուլները նշադրված կամ գունավորված չեն, այդ պատճառով դրանց շարժը դոնդողի կազմում տեսանելի չէ: Շարժը տեսանելի դարձնելու նպատակով նմուշի կազմ փորձից առաջ ավե56

լացվում է լիցքավորված ներկանյութ, որի մասնիկները, ունենալով հետազոտվող մոլեկուլներին բնորոշ լիցք, էլեկտրական դաշտում շարժվում են նույն ուղղությամբ, բայց չեն փոխազդում նպատակային նյութի հետ: Ներկանյութի շարժի արագությունը մի փոքր գերազանցում է ամենաարագ թորամասինը և ներկանյութը, գունավորելով դոնդողը, առաջինն է հասնում դրա հակառակ ծայրին: Էլեկտրաֆորեզն այս փուլում ավարտվում է: Տարբեր բնագավառներում օգտագործվում են էլեկտրաֆորեզի բազմաթիվ տարբերակներ՝ շարժուն սահմանով, գոտիավոր և ստացիոնար: Շարժուն սահմանով էլեկտրաֆորեզը կատարվում է հեղուկ միջավայրում: Գոտիավոր էլեկտրաֆորեզը կատարում են պինդ միջավայրի՝ թղթի, դոնդողների, ցելյուլոզային մեմբրանի վրա: Էլեկտրաֆորեզի այս տարբերակը բնութագրվում է բարձր ճշգրտությամբ և ստացված թորամասերի մաքրությամբ: Ստացիոնար էլեկտրաֆորեզի դեպքում որոշակի փուլում առաջանում է հավասարակշիռ վիճակ, և թորամասերի շարժն ընդհատվում է: Էլեկրոդների միջև նախապես ձևավորված рН-ի գրադիենտների սանդղակը նպաստում է դրանց շարժի արգելակմանը. մոլեկուլի լիցքին համապատասխանող գոտում շարժը արգելակվում է: Ինչպես նշվել է, ԴՆԹ-ի մոլեկուլների բաժանումը թորամասերի էլեկտրաֆորեզի միջոցով կատարվում է դոնդողի վրա: Դոնդողի խտությունը անմիջականորեն ազդում է բաժանվող մոլեկուլների շարժի արագության վրա, այդ պատճառով ԴՆԹ-ի տարբեր չափսերի հատվածների բաժանման համար առաջարկվել է օգտագործել տարբեր խտության դոնդողներ: Այժմ փոփոխելով դոնդողի խտությունը՝ հաջողվում է բաժանել ընդամենը մի քանի նուկլեոտիդով տարբերվող ՆԹ-ների հատվածները (Pingoud, et al., 2005):

2.2. ԷԼԵԿՏՐԱՖՈՐԵԶԻ ՏԵՍԱԿԱՆ ՀԻՄՈՒՆՔՆԵՐԸ, ԿԱՏԱՐՄԱՆ

ԿԱՐԳԸ ԵՎ ՕԳՏԱԳՈՐԾՎՈՂ ՍԱՐՔԱՎՈՐՈՒՄՆԵՐԸ

2.2.1. Էլեկտրաֆորեզի տեսական հիմունքները Հետազոտման ենթակա նմուշը ներմուծվում է բուֆերի մեջ, նույն բուֆերի մեջ է գտնվում և էլեկտրաֆորեզի կատարման համար օգտագործվող դոնդողը: Էլեկտրական հոսանքն առաջանում է լիցքավորված էլեկտրոդների վրա կատարվող էլեկտրոլիզի արդյունքում: Էլեկտրոնների շարժի տեսակետից էլեկտրաֆորեզը ընթանում է հետևյալ կարգով: Կատոդը բացասակ լիցքավորված է և քաշում է էլեկտրոնները՝ առաջացնելով բացասական լիցքով ОН- խմբեր, արդյունքում ակտիվանում է թույլ թթվի դիսոցիացիան և անիոնների քանակը ավելանում է: Առաջացած անիոնները կուտակվում են դրական անոդի շուրջ, կլանում էլեկտրոններ, թույլ թթուն վերականգնվում է, և էլեկտրոնները վերադառնում են էլեկտրական շղթա: Կատոդի վրա առաջանում են հիդրօքսիդ իոններ և մոլեկուլային ջրածին, իսկ անոդի վրա՝ մոլեկուլային թթվածին և ջրածնի իոններ. К+: 2 Н2О + 2ē→Н2↑ + 2 ОН– А–: 2 Н2О – 2ē→О2↑ + 4 Н+ Էլեկտրական դաշտում մոլեկուլների շարժունակությունը պայմանավորված է սեփական լիցքի չափով, միջավայրի խոչընդոտող ազդեցությամբ և լուծույթի լիցքով: Այս պայմաններում մոլեկուլների շուրջ առաջանում է իոնային մթնոլորտ, և մոլեկուլը շրջապատվում է հակաիոնային դիֆուզ ամպով: Իոնային մթնոլորտի առկայությունը նվազեցնում է մոլեկուլների շարժունակությունը: Դրա պատճառներից մեկն այն է, որ իոնային ամպը իր հակառակ լիցքով իջեցնում է շարժվող համալիրի ընդհանուր լիցքը և դրանով իսկ ազդում էլեկտրոդ/շարժվող միավոր լիցքերի հարաբերության վրա: Երկրորդ պատճառն այն է, որ հակառակ լիցք ունեցող իոնային ամպը հակված է շարժվել դեպի հակառակ էլեկտրոդ և նվազեցնել թիրախ մելեկուլի շուրջ ձևավորված համալիրի նպատակային շարժը: Այս երևույթը կոչվում է էլեկտրաֆորետիկ շփում: Երրորդ պատճառն այն է, որ դիֆուզ ամպի

առանձին իոնները, գտնվելով մշտական շարժման մեջ, դուրս են գալիս ամպից կամ ներառվում դրա մեջ և շեղում համալիրի հավասարակշռությունն ու գնդաձև կազմությունը, դանդաղեցնում դրա միասնական շարժը: Այս երևույթը կոչվում է ռելաքսային էֆեկտ: Հաշվի չառնելով բարդ ռելաքսային էֆեկտի ազդեցությունը՝ կարող ենք ասել, որ գնդաձև համալիրի շարժունակությունը պայմանավորված է դրա կազմում գտնվող մոլեկուլների լիցքով և զանգվածով, էլեկտրական դաշտի լարվածությամբ, դոնդողի խտությամբ, դրա ցանցային խորշերի չափսերով և էլեկտրոլիտի pH-ով: Նշենք, որ լուծույթի իոնային ուժի բարձրացումը իջեցնում է մոլեկուլների շարժի արագությունը: 2.2.2. Էլեկտրաֆորեզի պրոցեսի բնութագիրը, օգտագործվող սարքավորումները և փորձի նախապատրաստման կարգը ԴՆԹ-ի թորամասերի բաժանումը էլեկտրաֆորեզի եղանակով կատարվում է ինչպես ՊԱԱԴ-ի, այնպես էլ ագարոզային դոնդողի վրա, բայց ավելի հաճախ օգտագործվում է ագարոզային դոնդողը: Ագարոզային դոնդողն ավելի ամուր է և ունի համեմատաբար մեծ, կարգավորվող չափսի խորշեր, որոնք անհրաժեշտ են ԴՆԹ-ի մեծ մոլեկուլների բաժանման համար: ՊԱԱԴ-ն օգտագործվում է միայն 100 զ.ն-ով տարբերվող մոլեկուլների բաժանման համար: Ագարոզային դոնդողը բնութագրվում է բավարար թափանցիկությամբ և բարձր ճկունությամբ, որի շնորհիվ հարմար է կտրտելու, ներկելու և դոնդողի կազմում ֆերմենտային ու այլ ակտիվությունների որոշման համար: Այն շատ հեշտ է պատրաստվում: Թերություններից պետք է նշել, որ բացասական լիցք կրող СООН- և սուլֆատային խմբերի առկայությունը կարող է ստեղծել էլեկտրական դաշտի անհավասար բաշխում և հիդրոստատիկ ճնշում: Ագարոզան բնական գծային բազմաշաքար ագարի գերմաքրված նյութն է, որը ստանում են ծովային ջրիմուռներից: 84-96 0C պայմաններում (որոշ տեսակների մոտ 70 0C) ագարոզան անցնում է դոնդողային վիճակի: Դոնդողային ցանցի ձևավորումը պայմանավոր59

ված է գծային մոլեկուլների միջև ջրածնային կապերի ձևավորմամբ, որոնք և առաջացնում են խորշերը: Ագարոզի լուծույթներին բնորոշ է վառ արտահայտված հիստերեզիս՝ դրանք պնդանում են բավականին ցածր ջերմաստիճանի պայմաններում (36-420C): Ստացված պինդ դոնդողը թափանցիկ չէ, բայց սովորաբար շատ մաքուր է և գրեթե չի պարունակում որևէ խառնուրդ: Թափանցիկության նվազումը պայմանավորված է ագարոզի «բյուրեղացմամբ»: Հորիզոնական էլեկտրաֆորեզի սարք: Վերջին տարիներին ԴՆԹ-ն թորամասերի է բաժանվում հորիզոնական էլեկտրաֆորեզի եղանակով՝ հատուկ սարքի օգնությամբ (նկ. 2.1): Աշխատանքի կատարման համար ֆորեզի խցիկ է լցվում ֆորեզի համար օգտագործվող բուֆերը, և ծայրերի էլեկտրոդները միացվում են էլեկտրական հոսանքի սարքին: Դոնդողը տեղադրվում է խցիկի մեջ: Սարքի կազմությունը թույլ է տալիս ձևավորել դոնդողը անմիջապես դրա համար նախատեսված տեղում կամ սարքի հետ տրվող հավելյալ հիմքի վրա (նկ. 2.2):

t լՇljlilԾաl.jաu լալlՇլl

Նկ. 2.1. Ժամանակակից էլեկտրաֆորեզի սարքի կազմային տարրերը (Н.А. Кутлунина, А.А. Ермошин, 2017):

Սկզբում դոնդողի համար նախատեսված ՈՒՄ ճառագայթների նկատմամբ թափանցիկ թասիկը տեղադրվում է հատուկ հիմքի վրա

(նկ. 2.2) կամ էլեկտրաֆորեզի խցիկում դոնդողի թասիկի համար նախատեսված տեղում (նկ. 2.1) և կարգավորիչ մեխիկների օգնությամբ բերվում ճշգրիտ հորիզոնական դրության: էլեկտրաֆորեզի սարքում թասիկի երկու բաց ծայրերը փակվում են դոնդողը սահմանող մետաղե վահանիկներով: Uան~ lր[ո~~~ենցեQն, կարգաl!ոոti1 ~եlնt,կQեր- - - . _ , ե tնցաQt,/

U iթ~աQցt,կ

~

ll

Ql)ոl'[ր'I հt,~11 րթանt,կ11 հt,~11

'lոCյոոզo uաMաCյոզ ljսliասfi~

Նկ. 2.2. Դոնդողի պատրաստման համար նախատեսված լրացուցիչ հիմքը և դրա օգտագործման սխեման (Н.А. Кутлунина, А.А. Ермошин, 2017):

Սանրը տեղավորվում է ստարտի գծից մի փոքր առաջ՝ այնպես, որ թասիկի հատակից 1-1.5 մմ-ով բարձր լինի: Եթե դոնդողը պատրաստվում է անմիջապես էլեկտրաֆորեզի սարքում, սանրը պետք է ամրացնել կատոդի կողմից, քանի որ ԴՆԹ-ների շղթաները ունեն բացասական լիցք և էլեկտրական դաշտում շարժվում են բացասական բևեռից դեպի դրականը: 1. Փորձի կատարման կարգը: Դոնդողի պատրաստում: Նախապես պատրաստված դոնդողը կարելի է հալեցնել միկրոալիքային վառարանի մեջ, ջրային բաղնիքի վրա կամ նորովի պատրաստել (դոնդողը լուծելով էլեկտրոդային բուֆերում՝ բարձր ջերմաստիճանի պայմաններում) և սպասել, որ ջերմաստիճանը իջնի մինչև 50

C:

Այսուհետև դոնդողը զգուշորեն լցնում են էլեկտրոլիզի սարքի՝ հատուկ տեղում դրված դոնդողային թասիկի մեջ, թողնում սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում 30-40 րոպե: Պնդացած դոնդողից զգու61

շորեն անջատում են սանրը և սահմանող վահանիկները: Եթե դոնդողը պատրաստվել է հատուկ հիմքի վրա, ապա այն պետք է դոնդողային թասիկի հետ միասին տեղափոխվի էլեկտրաֆորեզի սարքի մեջ և դրվի համապատասխան տեղում: Դոնդողը չվնասելու նպատակով սանրի անջատումը կարող է կատարվել էլեկտրոդային բուֆերը ավելացնելուց հետո: Բուֆերի շերտը պետք է ծածկի դոնդողի մակերեսը 35 մմ-ով: Եթե նախատեսվում է երկարատև էլեկտրաֆորեզ կամ բարձր լարվածության կիրառում, բուֆերի շերտը կարող է լինել ավելի բարձր: 2. Նմուշի պատրաստման և ներմուծման կարգը: Նմուշները դոնդողի մեջ ներմուծելուց առաջ պետք է լուծել համապատասխան նմուշային բուֆերում: Նմուշի խտությունը պետք է լինի ավելի բարձր, քան էլեկտրոդային բուֆերի խտությունը: Այս նպատակով նմուշի մեջ կարող են ավելացվել գլիցերին կամ սախարոզ: Շնորհիվ բարձր խտության նմուշը կմնա կոմպակտ ագարոզային դոնդողում սանրով առաջացվող խորշի մեջ և չի տարածվի փորձից առաջ: Խորշի պատերը չվնասելու և նմուշը խորշի միջին մասում տեղադրելու համար նմուշի ներմուծումը կատարվում է զգույշ՝ միկրոպիպետով: Նմուշի ներմուծումից առաջ պետք է ապահովել նաև անգույն ԴՆԹ-ի մոլեկուլները տեսանելի դարձնելու հնարավորությունը: Այս նպատակով օգտագործվում են ներկանյութեր, որոնք չեն փոխազդում նմուշի հետ և, ունենալով որոշակի էլեկտրաֆորեզային շարժունակություն ու նույն՝ բացասական լիցքը էլեկտրական դաշտում շարժվում են ԴՆԹ-ի մոլեկուլներից մի փոքր արագ և առաջինն են հասնում դոնդողի հակառակ ծայրին: Ներկանյութի առկայության շնորհիվ էլեկտրաֆորեզի ամբողջ ընթացքը դառնում է տեսանելի. ներկանյութը, շարժվելով դոնդողում, ներկում է այն, և փորձն ավարտվում է այն պահին, երբ ներկանյութը հասնում է դոնդողի ծայրին: Սովորաբար օգտագործվում են բրոմֆենոլային կապույտը կամ քսիլեմցիանոլը: Նմուշի պատրաստման համար անհրաժեշտ է նաև հաշվի առնել ԴՆԹ-ի խտության ցուցանիշները՝ շատ ցածր խտության դեպքում թորամասերը չեն բացահայտվում ֆորեգրամի վրա: Բրոմէտիդիում

ներկանյութի կիրառման դեպքում բծերը պայծառ են արտահայտվում, եթե ԴՆԹ-ի խտությունը դրանցում գտնվում է 0.01-ից մինչև 0.30 մգ սահմաններում: Շատ բարձր խտության դեպքում բարձրանում է թորամասի շարժման արագությունը և առաջացող բիծը դառնում է տձև՝ տարբեր հատվածներ տեղափոխվում են տարբեր արագությամբ: Այսպիսով՝ ԴՆԹ-ի մոլեկուլների քանակը պատրաստված նմուշում պետք է լինի խտության որոշակի սահմաններում: Նշենք, որ ֆորեգրամի վրա ավելի պայծառ բծեր են առաջացնում մեծ մոլեկուլները և թորամասի կազմի մոլեկուլների չափսի նվազմանը զուգահեռ նվազում է նաև առաջացող բծի պայծառությունը (նկ. 2.3):

_ 21կ0 1986 -1159 1093 կկ8 216 211

Նկ. 2.3. ԴՆԹ-ի նմուշների ֆորեգրամներ. 1 - ռեստրիկտազ ֆերմենտով կտրտված ԴՆԹ-ի բազմաֆրագմենտ խառնուրդի ֆորեգրամ, 2 - թեստային կամ նշադրային նմուշի ֆորեգրամ, որում բոլոր թորամասերի խտությունները նույնն են (Н.А. Кутлунина, А.А. Ермошин, 2017):

Սովորաբար դոնդողի խցիկներից մեկի մեջ ներմուծում են ԴՆԹ-ի ստուգիչ նմուշներ, որոնց կազմի մոլեկուլների չափսերը նախապես հայտնի են: Փորձի ավարտից հետո դոնդողի վրա տարբեր տեսակի նմուշները առաջացնում են բծերի տարբեր պատկերներ՝ թորամասեր: Ստացված պատկերը կոչվում է ֆորեգրամ: Նկար 2.3.1-ում ներկայացված ֆորեգրամի համար օգտագործվել են մի քանի ռեստրիկտազ ֆերմենտներով նախապես մասնատված ԴՆԹ-ի մոլեկուլի հատվածները: Դրանց քանակը շատ մեծ է, բայց հատվածների երկարությունը գտնվում է 2140-ից մինչև 72 զ.ն. սահմաններում: Ինչպես տեսնում ենք, ֆորեգրամի վրա փոքր և ցածր խտությամբ հատվածներով առաջացած թորամասերի բծերի պայծառությունը ցածր է: Նկար 2.3.2-ում ներկայացված ֆորեգրամում փորձի համար ընտրվել են նշադրային, նույն խտությամբ, բայց տարբեր, հայտնի երկարությամբ հատվածներ: Այստեղ բացահայտվում է բծերի պայծառության և դրանց կազմի մեջ մտնող մոլեկուլների երկարության անմիջական գծային կախվածությունը:

10000 6000 ~ կ000 3000 . . . .

կ

ծ

- .. -

Նկ. 2.4. Համարակալված նմուշները էլեկտրաֆորեզի արդյունքում ինքնուրույն առաջացնում են լավ տեսանելի թորամասերի հավաքածուներ. 1-ին նմուշը թեստային է, պարունակում է հայտնի երկարությամբ ԴՆԹ-ի մոլեկուլներ, իսկ 2, 3, 4, 5, 6 և 7 նմուշները՝ փորձնական (https://gigabaza.ru/doc/28886.html):

Դոնոդողի բարակ շերտի վրա միաժամանակ կարող են հետազոտվել մի քանի նմուշներ: Նմուշները ներդրվում են դոնդողի ծայրերում ստարտի գծի հարևանությամբ՝ սանրով ձևավորված խցիկների մեջ: Էլեկտրական դաշտի միացումից հետո ամեն մի նմուշի բաղկացուցիչ տարրերը առանձին, լրիվ ինքնուրույն շարժվում են էլեկտրական դաշտում սեփական ուղիով և առաջացնում դրան բնորոշ թորամասեր (նկ. 2.4):

2.3. ԷԼԵԿՏՐԱՖՈՐԵԶԻ ԸՆԹԱՑՔԻ ՎՐԱ ԱԶԴՈՂ ԳՈՐԾՈՆՆԵՐԸ

Այսպիսով էլեկտրաֆորեզը բուֆերում լուծված մակրոմոլեկուլների շարժն է էլեկտրական դաշտում: Մակրոմոլեկուլների շարժի փաստացի արագությունը էլեկտրաֆորեզի պրոցեսում ձևավորվում է ինչպես սեփական չափսերի և կառուցվածքի, այնպես էլ մի շարք միջավայրային մասնակից գործոնների ազդեցությամբ: Միջավայրային գործոններից են էլեկտրական դաշտի լարվածությունը, դոնդողի խտությունը, ԴՆԹ-ի մոլեկուլների չափսերը և կոմպակտավորման եղանակը, բուֆերի рН-ը, էլեկտրական դաշտի տեսակը: Ֆիզիկական գործոններից առաջինը էլեկտրական դաշտի լարվածության չափն է. պարզվել է, որ ինչքան ավելի բարձր է հոսանքի ուժը, այնքան ավելի արագ են շարժվում բուֆերի իոններն ու հետազոտվող նմուշի մոլեկուլները (աղ. 2.1): Աղյուսակ 2.1 ԴՆԹ-ի տարբեր երկարության շղթաների ճշգրիտ բաժանման նախապայմանները Երկշղթա ԴՆԹ-ի երկարությունը, հ.զ.ն. 150—1 000 300—2 500 500—4 000 700—6 000 1 000—9 000

Ագարոզի խտությունը, % 1,8 1,4 1,0 0,7 0,5

Դաշտի լարվածության գրադիենտը, վ/սմ 2—3 2—3 1—2 0,5—1 0,5—1

Էլեկտրական դաշտի լարվածության ցածր ցուցանիշների դեպքում ԴՆԹ-ի մոլեկուլների շարժի արագությունն աճում է էլեկտրական դաշտի լարվածության աճին զուգահեռ՝ համամասնական սկզբունքով: Այս պայմաններում ԴՆԹ-ի մոլեկուլների բաժանումը թորամասերի արդյունավետ է: Սակայն դաշտի լարվածության շատ բարձր ցուցանիշների դեպքում ԴՆԹ-ի մեծ մոլեկուլների արագությունն աճում է երկրաչափական օրինաչափությամբ, և թորամասերի հստակ բաժանում չի ստացվում: Մեծ մոլեկուլների (70 հ.զ.ն.) հստակ բաժանումը կատարվում է 0,5-1 վ/սմ պայմաններում: Փոքր մոլեկուլների (2 հ.զ.ն.) հստակ բաժանման համար անհրաժեշտ է բարձրացնել էլեկտրական դաշտի լարվածության մակարդակը և դրանով իսկ՝ մոլեկուլների շարժման արագությունը (աղ. 2.1): Ջերմաստիճանի փոփոխությունները 4-30 оС սահմաններում էլեկտրաֆորեզի ընթացքի վրա զգալի ազդեցություն չեն առաջացնում: Սովորաբար էլեկտրաֆորեզը կատարում են սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում, բայց մեծ մոլեկուլների բաժանման համար օգտագործվող 0,5 % խտությամբ դոնդողը փափուկ է այս ջերմաստիճանի պայմաններում, և դրա ամրացման համար էլեկտրաֆորեզը կատարում են ավելի ցածր՝ 4 оС պայմաններում: Շարժի արագությունը պայմանավորված է նաև ԴՆԹ-ի մոլեկուլի չափսերով և կառուցվածքով առաջացվող շփման գործոնի չափով: Հետազոտություններում օգտագործվող դոնդողների կազմությունը ցանցային է, և շարժվող մակրոմոլեկուլները դիպչում են դոնդողի ցանցի թելիկներին, մեծացնում ցանցի խորշերը և դանդաղում: Եթե մակրոմոլեկուլների միջին չափսերը և դոնդողի խորշերի չափսերը մոտ են, մակրոմոլեկուլների շարժի արագության վրա ազդում է միայն դրանց երկարությունը: Որոշ տվյալների համաձայն՝ ԴՆԹ-ի մոլեկուլները շարժվում են դոնդողում ձգված լարի ձևով՝ մեկ ծայրով առաջ: Այն դեպքերում, երբ ԴՆԹ-ների մոլեկուլները մեծ են դոնդողի խորշերից, դրանց շարժը կարող է արգելակվել: Շատ մեծ մոլեկուլների շարժի արագությունը և մոլեկուլային զանգվածի հարաբերակցությունը հակադարձ համամասնային է. ինչքան ավելի բարձր է մոլեկուլային զանգվածը, այնքան ավելի դանդաղ է մոլեկուլների շարժը (նկ. 2.5.1):

գ.~.

'ՊՊ

,ooo

'Պ' ""

"" 7 ,00

.եեե,

o' Ծ

~

'Պ'

.c..

(Q

նՊՊ

,. .,

..

"' Lili-ո.[ Uliցաo որttili ,0

"' Պ

Նկ. 2.5. 1 - ԴՆԹ-ի հատվածի անցած ճանապարհի և մոլեկուլային զանգվածի կապվածության գրաֆիկը: 2 - Դոնդողի խտության ազդեցությունը թորամասերի շարժի արագության վրա բնութագրվում է որպես բացասական կապ: Դոնդողի խտության բարձրացումը նվազեցնում է մոլեկուլների արագությունը և անցած ճանապարհը (Н.А. Колтовая, 2010):

Ագարոզի խտության փոփոխման միջոցով փոփոխվում են դոնդողի խորշերի չափսերը: Կատարված հետազոտություններում բացահայտվել է, որ նույն նմուշի թորամասերը տարբեր խտություն ունեցող դոնդողներում շարժվում են տարբեր արագությամբ և անցնում են տարբեր ուղի (նկ. 2.5.2): Տարբեր չափսերի թորամասերը հստակ բաժանելու նպատակով օգտագործում են տարբեր խտությամբ դոնդողներ (աղ. 2.2): Էլեկտրաֆորեզի պրոցեսում ԴՆԹ-ի մոլեկուլի շարժման արագության վրա ազդում է նաև դրանց տարածական կառուցվածքը: Նույն մոլեկուլային զանգված ունեցող, բայց կառուցվածքով տարբերվող մոլեկուլների արագությունը էլեկտրաֆորեզի ժամանակ տարբեր է (նկ. 2.6): Ամենաբարձր արագությունը բնորոշ է անթերի գերոլորված օղակաձև մոլեկուլներին՝ տարբերակ 1(ա), օղակաձև բայց կտրվածքներով մոլեկուլները՝ տարբերակ 2(գ), շարժվում են շատ դանդաղ,

միջին արագությունը բնորոշ է գծային մոլեկուլներին՝ տարբերակ 3(բ): Տարբեր ձևով կոմպակտավորված ԴՆԹ-ի մոլեկուլների արագությունը դոնդողում պայմանավորված է առաջին հերթին ագարոզի խտությամբ, բայց նշանակություն ունեն նաև հոսանքի ուժը, բուֆերի լիցքը և գերոլորված բացասական հանգույցների խտությունը (Johnson et al., 1980): Աղյուսակ 2.2 Տարբեր չափսերի ԴՆԹ-ի շղթաների բաժանման համար անհրաժեշտ ագարոզային դոնդողի խտությունները Ագարոզի խտությունը դոնդողում, % 0,3 0,6 0,7 0,9 1,2 1,3 2,0

Արդյունավետ բաժանվող հատվածների չափսերը, հ.զ.ն. 60-50 20-10 10-0,8 7-0,5 6-0,4 4-0,2 3-0,1

Էլեկտրաֆորեզի արագությունը պայմանավորված է նաև կրող միջավայրի և բուֆերային լուծույթի դիմադրողականության ազդեցությամբ: Եթե դոնդողի շերտը հաստ է, դիմադրողականությունը բարձր է, իսկ եթե լայն է՝ ցածր: Էլեկտրաֆորեզի ընթացքում ջերմաստիճանը բարձրանում է, և դրա շնորհիվ պրոցեսն արագանում է, բայց բուֆերային հեղուկն այս դեպքում գոլորշիանում է: Անհրաժեշտ է դոնդողի ջերմաստիճանը և բուֆերի քանակը պահպանել անփոփոխ: Մոլեկուլների շարժի արագությունը էլեկտրաֆորեզի պրոցեսում պայմանավորված է նաև էլեկտրաֆորեզի բուֆերի առանձնահատկություններով: Նշենք, որ լուծույթը սովորաբար էլեկտրոլիտ է՝ լիցքավորված հեղուկ, որի կազմում գտնվում են թթուներ և հիմքեր: Թթուների և հիմքերի կազմը այնպես է ընտրվում, որ աննշան քանակների ավելացումը էլեկտրաֆորեզի ժամանակ չփոփոխի լուծույթի pH-ը: Բուֆերային լուծույթը պետք է լինի կայուն, ոչ տոքսիկ և ջրում լուծվող:

ա

I

.,.. I 65,$7

.

:

~

- ,..... 8

ո

;a-,ս2

I

Նկ. 2.6. ԴՆԹ-ի մոլեկուլների կոմպակտավորման աստիճանի և էլեկտրական դաշտում շարժման արագության փոխկապվածության պատկերը https://infopedia.su/17xaaab.html

Բուֆերի рН-ի փոփոխությունը առաջացնում է հետազոտվող մակրոմոլեկուլների լիցքի փոփոխություն, իսկ մոլեկուլների տարածական կազմության փոփոխությունը առաջացվում է բուֆերին ավելացվող բնափոխող ագենտներով և դետերգենտներով: Թվարկված հնարավորությունները բարձրացնում են էլեկտրաֆորեզի ճկունությունը, ընդլայնում դրա հետազոտական հնարավորությունները: Անցյալ դարի 80-ական թվականներին առաջարկվեց ագարոզային էլեկտրաֆորեզի նոր տարբերակ՝ էլեկտրաֆորեզ զարկերակող էլեկտրական դաշտում կամ զարկ-էլեկտրաֆորեզ, որը թույլ է տալիս բաժանել թորամասերի ԴՆԹ-ի շատ մեծ մոլեկուլները: Սովորաբար կայուն էլեկտրական դաշտում շատ մեծ մոլեկուլները ձգվում են, ստանում օձաձև կազմություն և դրա շնորհիվ անկախ դրանց չափսերից տեղափոխվում են նույն արագությամբ: Փոփոխական էլեկտրական դաշտում այդպիսի մոլեկուլների շարժման արագությունը պայմանավորված է դրանց ունակությամբ վերակողմնորոշվել պայմաններին համաձայն: Ավելի մեծ մոլեկուլները ավելի դանդաղ են վերակողմնորոշվում և հետ են մնում ավելի կարճ մոլեկուլներից: Այս եղանակով կատարվող էլեկտրաֆորեզի արդյունքում հաջողվում է բաժանել խմորասնկերի առանձին քրոմոսոմների ԴՆԹ-ի մոլեկուլները և հետազոտել դրանց միջև կատարվող վերակառուցումները:

2.4. ԷԼԵԿՏՐԱՖՈՐԵԶԻ ԴԵՏԵԿՑԻԱՅԻ ԵՎ ՎԵՐԱՀՍԿՄԱՆ

ԳՈՐԾՈՆՆԵՐԸ

2.4.1. ԴՆԹ-ի նշադիրներ ԴՆԹ-ի տարբեր թորամասերի չափսերի որոշման համար օգտագործվում են նշադրային՝ ԴՆԹ-ի հայտնի երկարությամբ հատվածներ պարունակող հավաքածուներ, որոնց երկարությունը տարբեր խմբերում կարող է տարբերվել 50, 100 կամ 500 զ.ն-ով (նկ. 2.7):

ծ00

GOO

5oo

2$0

2 500

կ50 կ00

if

Նկ. 2.7. ԴՆԹ-ի նուկլեոտիդային զույգերի քանակի ստանդարտ նշադիրների ֆորեգրամային պատկերները: Հարևան թորամասերը տարբերվում են՝ 1-ին սանդղակում 50, 2-ում՝ 100, 3-ում՝ 500 զ.ն-ով (А.Р. Каюмов, 2016):

Նշադիրների այդպիսի հավաքածուները նմուշների հետ միասին ենթարկում են էլեկտրաֆորեզի և, նմուշի թորամասերի ուղին համեմատելով նշադրային հայտնի երկարությամբ հատվածների ուղիների հետ, որոշում հետազոտվող թորամասի նուկլեոտիդների քանակը (նկ. 2.8): Եթե հետազոտվող նմուշները հետազոտված չեն, և դրանց թորամասերի չափսերը բացարձակ անհայտ են, նույն փորձում զուգահեռաբար կարող են օգտագործել մի քանի նշադրային հավաքածուներ, որոնց օգնությամբ և կգնահատվի հետազոտվող նմուշի հատվածների երկարությունը:

23կ5ծ7

Նկ. 2.8. Էլեկտրաֆորեգրամի 1-ին ուղու վրա գտնվում են նշադրային հավաքածուի թորամասերը: Մնացած ուղիները հետազոտվող նմուշներինն են: Համեմատելով թորամասերի դասավորությունը նշադրային և փորձնական ուղիների վրա՝ որոշում են հետազոտվող թորամասի նուկլեոտիդների քանակը (www.dic.academic.ru):

2.4.2. Էլեկտրաֆորեզի ընթացքի վերահսկման միջոցները Ինչպես արդեն նշվել է, էլեկտրաֆորեզի ընթացքում թորամասերի շարժը տեսանելի դարձնելու և պրոցեսը վերահսկելու նպատակով օգտագործվում են հատուկ ներկանյութեր, որոնք չպետք է փոխազդեն հետազոտվող նմուշի հետ և ունենան նույն լիցքը: Ավելին՝ ներկանյութի շարժման արագությունը դոնդողում պետք է լինի ավելի բարձր, քան հետազոտվող մակրոմոլեկուլների ամենաարագ թորամասի արագությունը: Այս դեպքում ներկանյութը դոնդողի հակառակ ծայրին կհասնի ավելի արագ, քան հետազոտվող նյութի որևէ բաղադրիչ: Այսպիսով՝ երբ ներկանյութը հասնում է դոնդողի ծայրին, էլեկտրաֆորեզը ավարտվում է: Դոնդողի վրա առաջացած մակրոմոլեկուլային գոտիների պահպանման և հնարավոր դիֆուզ շարժի արգելակման նպատակով կատարվում է ստացված ֆորեգրամի ֆիքսում: Դոնդողը տեղափոխվում է ֆիքսատոր լուծույթի մեջ, որտեղ ՆԹ-ները իջեցվում են նստվածք դոնդողի այն հատվածում, որտեղ հասել էին համապատասխան թորամասերը պրոցեսի ավարտի պահին:

2.5. ՀՈՐԻԶՈՆԱԿԱՆ ԷԼԵԿՏՐԱՖՈՐԵԶ

Հետազոտվող տարբեր նմուշների առանձնահատկություններին և հետազոտության խնդիրներին համապատասխան կատարվում է էլեկտրաֆորեզի տեսակի ընտրությունը: Վերջին տարիներին մշակվել են էլեկտրաֆորեզի մի շարք մեթոդներ՝ հորիզոնական, ուղղահայաց, մազանոթային կամ կապիլյարային, երկչափ էլեկտրաֆորեզ, դիսկէլեկտրաֆորեզ, պուլս-էլեկտրաֆորեզ, խաչաձև իմունաէլեկտրաֆորեզ և այլն, որոնք բնութագրվում են դրանց բնորոշ առանձնահատկու71

թյուններով և օգտագործվում նպատակային ձևով՝ որոշակի հետազոտություններում: 2.5.1. Հորիզոնական էլեկտրաֆորեզ ագարոզային դոնդողի վրա Ագարոզային էլեկտրաֆորեզի կատարումը պահանջում է մի շարք նախապատրաստական քայլեր՝ դոնդողի, լուծույթների և ներկանյութի պատրաստում, նմուշի մշակում: Դոնդողը պատրաստվում է կարմիր ջրիմուռներից անջատված գծային բազմաշաքար ագարի մաքուր թորամաս ագարոզից (C12H18O9)n: Ագարոզի մոլեկուլային զանգվածը 104-105 գ/մոլ է: Դոնդողի ձևավորումը կատարվում է ագարի թելիկների միջև ջրածնային կապերի առաջացման միջոցով: Ագարոզի որոշ տեսակներ առաջացնում են պինդ դոնդող արդեն 0,3 % խտության դեպքում: 84 -96 oC պայմաններում ագարոզը հալվում է՝ առաջացնելով անգույն հեղուկ, որոշ տեսակներ բնափոխվում են արդեն 70 օC պայմաններում: Ագարոզի լուծույթին բնորոշ է արտահայտված հիստերեզիս՝ բնափոխումը կատարվում է ուշացումով: Այդ պատճառով ագարոզի լուծույթը անցնում է դոնդողային վիճակի ցածր ջերմաստիճանի պայմաններում՝ 36-42 oC: Որոշ տեսակների անցումը կատարվում է նույնիսկ 30 oC աստիճանում: Էլեկտրաֆորեզի համար արտադրվում է ագարոզի ալուրը: Անհրաժեշտ խտության դոնդողի ձևավորման համար ագարոզի ալյուրի անհրաժեշտ քանակությունը լուծվում է համապատասխան տեսակի բուֆերում և պահվում ջրային բաղնիքի վրա 2 ժամ: Էլեկտրաֆորեզի համար օգտագործվող դոնդողի շերտերի ձևավորման համար ագարոզան տաքացվում է և հալեցվում մինչև 50 oC և այդպես պահվում 30 րոպե: Ագարոզային լուծույթը տեղափոխվում է դոնդողի պատրաստման համար օգտագործվող կաղապարի մեջ` 50-55 օC պայմանում: Բյուրեղացումով ձևավորվող ագարոզային դոնդողը լիովին թափանցիկ չէ: Ագարոզում առկա իետօքսիլ խմբերի 3-4 %-ը դանդաղեցնում են դոնդողացման պրոցեսը: Բնական ագարոզի կազմում առկա են նաև սուլֆոխմբեր, որոնց ազդեցությամբ առաջանում է էնդոօսմոս:

Էնդոօսմոսը ազդում է բացասական լիցք ունեցող մասնիկների շարժման արագության վրա` դանդաղեցնելով շարժը: Այդ պատճառով ագարոզի դոնդողային տեսակները նախապես մաքրվում են սուլֆոխմբերից: Առաջացող դոնդողը, հետզհետե անջատելով ջուրը, պնդանում է և լիովին միատարր չէ: Էլեկտրաֆորեզի պրոցեսում դոնդողի խորշերը պետք է շփման պատճառով միայն մի փոքր դանդաղեցնեն մակրոմոլեկուլների շարժը, բայց չարգելակեն: Դոնդողի ծակոտիների չափսերը կարգավորվում են ագարոզի խտության մակարդակի փոփոխմամբ: 2 %-անոց խտության դեպքում խորշերի չափսերը համապատասխանում են 50 մլն դալտոն չափսի գնդաձև մոլեկուլին: Այսպիսով՝ էլեկտրաֆորեզի համար օգտագործվող ագարոզային դոնդողի խտությունը չի գերազանցում 0,4 -2,0 % սահմանը (աղ. 2.1): 2.5.1.1. Էլեկտրաֆորեզի ընթացքում օգտագործվող բուֆերները և այլ լուծույթները Բուֆերների օգտագործումը էլեկտրաֆորեզի ժամանակ նպատակային է: Առաջին հերթին բուֆերը էլեկտրոլիտ է, որը պահպանում է լուծույթի անփոփոխ կազմը միջէլեկտրոդային գոտիներում, երկրորդը՝ կայունացնում է նմուշները էլեկտրաֆորեզի պրոցեսում: Ագարոզային էլեկտրաֆորեզի համար օգտագործվող բուֆերները պարունակում են 50 մՄ ՏՐԻՍ-ացետատ, ՏՐԻՍ-բորատ, ՏՐԻՍֆոսֆատ, рН-ը հավասար է 7,5-7,8, որը մոտ է ֆիզիոլոգիական լուծույթների ցուցանիշին և շատ հարմար է մակրոմոլեկուլների բաժանման համար: Սովորաբար բուֆերները պատրաստում են բարձր խտությամբ և պահում սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում: Բուֆերային լուծույթի իոնային ուժը պայմանավորված է ազատ իոնների խտությամբ: Իոնային ուժի բարձր մակարդակը խոչընդոտում է բաժանվող մոլեկուլների շարժը, իսկ ցածր խտությունը չի ապահովում թորամասերի հստակ բաժանումը: Այդ պատճառով բուֆերային լուծույթի խտությունն ընտրվում է ըստ նպատակային նյութի առանձնահատկությունների՝

այնպես, որ ստացվեն հստակ բաժանվող թորամասեր: Հաճախ օգտագործվող բուֆերների խտությունը գտնվում է 0,05-0,10 М սահմաններում: Հորիզոնական ագարոզային էլեկտրաֆորեզի համար օգտագործվող բուֆերների և այլ լուծույթների կազմը Հորիզոնական ագարոզային էլեկտրաֆորեզի կատարման համար օգտագործվում են հատուկ բուֆերներ և լուծույթներ: Դրանց կազմը և պատրաստման եղանակը ներկայացվում է ստորև: 1. Բուֆեր 1. 10x TBE բուֆեր (Tris-Borate-EDTA): Կազմված է 108 գ հիմնային Tris-ից, 55 գ բորաթթվից, 9,3 գ EDTA նատրիումից և 1 լ ապաիոնիզացված թորած ջրից: рН-ի վերջնական ցուցանիշը՝ 8,3: 2. Բուֆեր 2. 50x TAE (Tris-Acetate-EDTA): 242 գ հիմնային Tris, 57,1 գ սառցային քացախաթթու, 100 մլ 0,5 M EDTA, 1 լ ապաիոնիզացված թորած ջուր, рН-ը՝ 8,5: TAE բուֆերը անկայուն է, այդ պատճառով ագարոզը պետք է լուծել ջրի մեջ, այնուհետև ավելացնել բուֆերը: 3. 6х բուֆերը օգտագործվում է նմուշները դոնդողի մեջ ներմուծելու համար: Կազմված է 0,25 % բրոմֆենիլային կապույտից, 0,25 % քսիլենցիանոլից, 40 % սախարոզից, 40 % գլիցերինից և մեկ մաս 1хТВЕ-ից: 4. Ագարոզ: 1 %-անոց դոնդողի պատրաստման համար 100 մլ ջրի մեջ լուծում են 1 գ ագարոզ: Միկրոալիքային սարքում բարձր էլեկտրական լարման պայմաններում լուծույթը եռացնում են, հանում օջախից և նստվածքում գտնվող ագարոզը լուծելու համար խառնում: Լուծույթը սառեցնում են և լրացնում մինչև 100 մլ նիշը: Դոնդող պատրաստելու համար օգտագործվող թասիկի մեջ տեղադրում են ագարոզի մեջ խցիկներ առաջացնող սանրը և լցնում ագարոզը: 5. Բրոմի էտիդիում՝ EtBr: Նախապես պատրաստվում է 10 մգ/մլ խտությամբ լուծույթ: Ներկանյութի՝ նախապես պատրաստված լուծույթը պետք է պահել 4 оС պամաններում ոչ թափանցիկ անոթում: Օգտագործելուց առաջ ներկանյութը նոսրացվում է 100 անգամ՝ մինչև 0,1 մգ/մլ:

2.5.1.2. Ագարոզային հորիզոնական էլեկտրաֆորեզի կատարման կարգը 1.

Էլեկտրաֆորեզային բուֆերի որոշակի ծավալի մեջ լուծել 1 գ

ագարոզ: 2. Խառնուրդը տաքացնել ջրային բաղնիքի կամ միկրոալիքային սարքի մեջ, եռացնել և զգուշորեն հանել: 3. Լուծույթը սառեցնել, խառնել, որպեսզի ագարոզը լավ լուծվի, ապա 50-60 оС պայմաններում ավելացնել բրոմ էտիդիումի լուծույթ: 4. Դոնդողային թասիկի մեջ տեղադրել ագարոզի շերտում փոսիկներ առաջացնող սանր: Ավելացնել ագարոզի լուծույթը: 5. 35-40 րոպե անց, երբ դոնդողը ամրանա, տեղափոխել այն էլեկտրաֆորեզի սարքի համապատասխան տեղը: 6. Էլեկտրոդային խցիկների մեջ բուֆերը ավելացնել այնպես, որ դոնդողը ծածկվի 1 մլ չափով: Անհրաժեշտության դեպքում բուֆերի մեջ կարող է լինել էտիդիում բրոմիդ ներկանյութը: 7. Նմուշները խառնել 6х բուֆերի հետ և ներմուծել դոնդողի վրա առկա փոսիկների մեջ՝ էլեկտրաֆորեզային բուֆերի շերտի տակ: Բուֆերում առկա ներկանյութը անհրաժեշտ է նմուշի շարժը վերահսկելու համար: 8. Միացնել էլեկտրոդները և հոսանքի սարքը (սովորաբար կիրառվում է 0,5-ից մինչև 2-3 վ/սմ էլեկտրական լարում): 9. Պրոցեսը ավարտել այն ժամանակ, երբ ներկանյութը հասնում է դոնդողի ծայրին, և դոնդողը տեղափոխել 1 մկգ/մկլ խտությամբ էտիդիում բրոմիդ ներկանյութի մեջ, թողնել 15 րոպե, ապա դոնդողը հանել ներկանյութի միջից և 20 րոպե լվանալ ջրով: Հաճախ ներկանյութի հետ համատեղ օգտագործվում են ֆիքսող նյութեր: 10. Կատարել ստացված ֆորեգրամի դետեկցիա, օրինակ՝ լվացումից հետո դոնդողը չորացնել և դնել ուլտրամանուշակագույն ճառագայթների համար թափանցիկ տրանսիլյումինատորի ապակու վրա,

ապա կատարել նկարահանում և հետազոտել ստացված պատկերը (նկ. 2.9): Պետք է հիշել, որ ուլտրամանուշակագույն ճառագայթները վտանգավոր են և դրանք կիրառելիս պահանջվում է զգուշություն՝ ակնոցների, ձեռնոցների և այլ միջոցների օգտագործում: 11. Կատարել ստացված պատկերի համեմատում նշադրային ցանքի հետ:

Նկ. 2.9. Տրանսիլյումինատոր. վերևի մակերեսին՝ ուլտրամանուշակագույն ճառագայթների համար նախատեսված թափանցիկ ապակի (http://bglab.bg/catalog/2elektroforeza/gel-electroforeza/8transilluminators/):

2.5.2. Վերլուծական էլեկտրաֆորեզի արդյունքների դետեկցիա Էլեկտրաֆորեզի ավարտից հետո կատարվում է արդյունքների վերլուծություն՝ դետեկցիա: Այս տեսակետից էլեկտրաֆորեզը լինում է երկու տիպի՝ վերլուծական, որի խնդիրն է դոնդողում թորամասերի դասավորման պատկերի հետազոտումը, և պատրաստուկային, որի ժամանակ հետազոտվում են թորամասերի ճշգրիտ քանակները և դրանց կազմության մեջ մտնող ԴՆԹ-ների նուկլեոտիդային կազմը: Վերլուծական դետեկցիան կատարվում է երկու եղանակով: Առաջին եղանակ՝ մշակում ՈՒՄ ճառագայթներով: ԴՆԹ-ի մոլեկուլները ընկալում են ուլտրամանուշակագույն ճառագայթման էներգիան: ԴՆԹ-ի թորամասերի դասավորությունը ֆորեգրամի վրա բացահայտվում է ՈՒՄ ճառագայթներով մշակման միջոցով: Ստաց76

ված պատկերը համեմատվում է նշադրային ստանդարտ թեստի հետ: Այժմ ստեղծվել են ավտոմատացված սարքեր, որոնք գրանցում են թորամասերի շարժը դոնդողում էլեկտրաֆորեզի ընթացքում և տալիս արդյունքների թվայնացված պատկերը (նկ. 2.10): գ.ն . ..

րր(յաl.ո նգ. % 10000 20.0 800) 2կ.0 6000 30.0

կ.0 կ.8 6.0

ոl 1.!:Ց R:Ց

=~ ID l~l

- 2000 92.0 18.կ 1500 2կ.0 կ.8 1000 10.0 21.5

2.0

1կ.5

կ.3 2.9

21.5

կ.3

Նկ. 2.10. Ըստ նշադրային նմուշի ցուցանիշների՝ կատարվում է հետազոտվող նմուշի թորամասերի ն.զ-ների, դրանց մոտավոր խտության և մոլեկուլային զանգվածի հաշվարկ (https://lektsii.org/16-70668.html):

Երկրորդ եղանակը՝ ԴՆԹ-ի ներկում: Ներկանյութերի օգտագործման մեթոդը բավականին արդյունավետ է և կիրառվում է միա- և երկշղթա ԴՆԹ-ների բացահայտման համար: Մեթոդը զգայուն է հետազոտվող նյութերի յուրահատկությունների նկատմամբ, բայց երկարատև է, կարող է փոփոխել ԴՆԹ-ի կառուցվածքը և կապված է վտանգավոր նյութերի օգտագործման հետ: Էլեկտրաֆորեզի արդյունքների դետեկցիայի համար օգտագործվում են երկու տեսակի ներկանյութեր՝ առաջնորդող և ֆլուորեսցենտ: Որպես առաջնորդող ներկանյութեր օգտագործում են բրոմֆենոլային կապույտը, նարնջագույն G-ն, կրեզոլային կարմիրը և քսիլենցիանոլ: Այս ներկանյութերն ունեն բացասական լիցք և շարժվում են դոնդողում ԴՆԹ-ի հետ միևնույն ուղղությամբ: Դրանք օգտագործվում են որպես նշադիրներ, քանի որ ամեն մեկը անցնում է դոնդողի վրա որոշակի ճանապարհ և նշում է այդ կետում առկա ԴՆԹ-ն: Ներկանյութերի դասավորությամբ կարելի է որոշել դոնդողի համապատասխան տեղում գտնվող ԴՆԹ-ի թորամասի կազմի շղթաների նուկլեոտիդային զույգերի քանակը (նկ. 2.11):

?,ooo -e.oooզ.u.

- Xyleոe Ըyթոol ՒՒ

900 -?00զ.u. 300 -5oo զ.u.

- ՇրesԸi րeժ - 8րoոoրհeոol եlնe

5o-1ooզ.u.

- Oրթոցe G

Նկ. 2.11. Ագարոզային 1,2 % դոնդողի համար օգտագործվող առաջնորդող ներկանյութերի դասավորությունը ֆորեգրամի վրա (www.biotangusa.com):

Ֆլուորեսցենտ ներկանյութերը նույնպես օգտագործվում են ԴՆԹ-ի թորամասերի դետեկցիայի համար: Դրանք, կապվելով ԴՆԹի մոլեկուլներին, ուլտրամանուշակագույն ճառագայթների ազդեցությամբ լույս են արձակում: Այսօր արդեն ստեղծվել են դոնդողի կազմ ավելացվող բազմաթիվ ֆլուորեսցենտ ներկանյութեր: Այս դեպքում ԴՆԹ-ի դետեկցիան կատարվում է տրանսիլյումինատոր սարքի միջոցով: Դոնդողը կարող է ներկվել նաև էլեկտրաֆորեզի ավարտից հետո: Գրեթե բոլոր ներկանյութերը թունավոր են և պահանջում են պաշտպանական միջոցների օգտագործում: Ամենահաճախ օգտագործվողներից է բրոմէտիդիումը: Բրոմէտիդիումը ներմուծվում է ԴՆԹ-ի շղթաների նուկլեոտիդային զույգերի միջև և, առաջացնելով դրանց հետ ամուր կապ, ներկում է ԴՆԹ-ի մոլեկուլները: Թորամասերում ԴՆԹ-ի շղթաների կուտակումը հանգեցնում է ներկանյութի խտության բարձրացման: 290-330 նմ երկարությամբ ուլտրամանուշակագույն ճառագայթման ազդեցությամբ ներկանյութը ինտենսիվ լույս է արձակում 590 ալիքային լայնույթում: Լուսային ազդակի ինտենսիվությունը աճում է ներկանյութի խտության բարձրացմանը զուգահեռ (նկ. 2.12): Մեթոդը շատ

զգայուն է, և 5 մմ լայնությամբ դոնդողի շերտի վրա բացահայտվում է ԴՆԹ-ի նույնիսկ 0,01 մկգ: Ֆորեգրամի ներկման համար օգտագործվող ներկանյութի խտությունը հավասար է 0,5-1 մկգ/մկլ: Ներկման տևողությունը 30-40 րոպե է: Երբեմն հարկ է լինում ֆորեգրամը մաքրել ներկանյութի մնացորդային ֆլուորեսցենցիայից: Այս նպատակով ֆորեգրամը լվանում են ջրով կամ 1 մՄ MgSՕ4-ի լուծույթով 20 րոպե: Ներկանյութը կարող է ավելացվել նաև անմիջապես ագարոզին: Բայց դրա ազդեցությունը ԴՆԹ-ի կոմպակտավորման մակարդակի վրա (բրոմէտիդիումը ապաոլորում է գերոլորված հատվածները և փոխում ԴՆԹ-ի մոլեկուլի տարածական կազմությունը), փոխում է թորամասերի շարժման արագությունը: Սակայն ներկման այս եղանակը թույլ է տալիս հետևել թորամասերի շարժին ֆորեզի պրոցեսում: Բրոմէտիդիումը օգտագործվում է միայն ագարոզային ֆորեզի դեպքում, քանի որ խոչընդոտում է ՊԱԱԴ-ի պոլիմերիզացման պրոցեսը: Ներկելուց հետո չորացած դոնդողը տեղադրում են տրանսիլյումինատորի ապակու վրա և ՈՒՄ ճառագայթների ազդեցությամբ առաջանում է ներկանյութին բնորոշ նարնջի գունավորումը: Ժամանակակից սարքերը աշխատում են ճառագայթման 302 նմ ալիքի երկարության կիրառմամբ, որը բավականին ճշգրիտ է և չի առաջացնում ԴՆԹ-ի շղթայի կտրվածքներ: Դոնդողը նկարահանվում է նարնջագույն ֆիլտրի օգտագործմամբ: Դոնդողը խոնավ պահելու համար կարելի է փաթաթել պոլիէթիլենային թաղանթով և պահել սառնարանում: Իսկ երկարատև պահման համար այն պետք է չորացնել: Նկար 2.11-ում ներկայացվող ֆորեգրամի վրա առաջին նմուշը ստանդարտ ստուգիչ նշադիրն է, որի կազմում առկա են հայտնի չափսերի, մեկը մյուսից որոշակի քանակի ն.զ.-ներով տարբերվող ԴՆԹ հատվածներ: Դրանք ֆորեզի արդյունքում բաժանվում են թորամասերի, որոնց կազմում կուտակվում են նույն երկարությամբ հատվածները: Նույն եղանակով թորամասերի են բաժանվում նաև փորձնական նմուշները:

Նկ. 2.12. Թորամասերում ԴՆԹ-ի հատվածների երկարության որոշում. 1 - ստուգող ստանդարտ հատվածներ պարունակող նմուշ, 2, 3, 4, 5, 6 - հետազոտվող նմուշներ: Ֆորեգրամի վրա ԴՆԹ-ների թորամասերի գոտիներում առաջանում են ներկանյութի կուտակումներ և լուսային ազդակի ինտենսիվությունը ՈՒՄ ճառագայթման ազդեցությամբ ինտենսիվանում է, ձևավորվում են լուսային բծեր (https://id.wikipedia.org/wiki/Berkas:Gel_electrophoresis_2.jpg):

Համեմատելով նմուշների շարքում առաջացած թորամասերի դիրքը ստանդարտ՝ 1-ին շարքի թորամասերի դիրքի հետ՝ որոշվում է նմուշների թորամասեր կազմող ԴՆԹ-հատվածների ն.զ.-ի քանակը: Թորամասերի լուսային ճառագայթման ինտենսիվության հարաբերությամբ որոշվում է ԴՆԹ-ների հարաբերական խտությունը թորամասերում: Եթե ստանդարտ նմուշի կազմում առկա ԴՆԹ-ի բոլոր չափերի հատվածների խտությունները հայտնի են, ապա համեմատելով դրանց ազդակի ինտենսիվությունը հետազոտվող նմուշների համապատասխան թորամասերի ազդակների ինտենսիվության հետ՝ կարելի է որոշել նպատակային նմուշում նույն չափսի ԴՆԹ-հատվածների մոտավոր քանակը: Ստացված պատկերի վերլուծությունը կատարվում է որևէ, օրինակ, Image ծրագրի օգնությամբ: Դոնդողների ներկման համար օգտագործվում են նաև այլ ներկանյութեր՝ ակրիդինային նարնջագույն և DAPI (4,6-դիամիդինո-2ֆենիլիմդոլ·2HCl), Stains-All (ստեյնզոլ): DAPI-ն թույլ է տալիս ներկել միայն ԴՆԹ-ն և ԴՆԹ-ի ներկայությամբ չի կապվում ՌՆԹ-ի հետ: Այս ներկանյութի զգայունության աստիճանը հավասար է բրոմէտիդիումի զգայունության աստիճանին:

Ակրիդինային նարնջագույնը ավելի քիչ զգայուն է, բայց թույլ է տալիս տարատեսակել ԴՆԹ-ի միա- և երկշղթա մոլեկուլները: Ներմուծվելով ԴՆԹ-ի երկշղթա մոլեկուլների նուկլեոտիդների միջև՝ այս ներկանյութը առաջացնում է կանաչ ֆլուորեսցենցիա, իսկ միաշղթա մոլեկուլի հետ միանալով՝ էլեկտրոստատիկ կապով արձակում է կամիր լույս: Stains-All ներկանյութը, միանալով տարբեր նյութերի հետ, առաջացնում է տարբեր գունավորում. գլիկոպրոտեիդների հետ՝ կապույտ, սպիտակուցների հետ՝ կարմիր, լիպիդների հետ՝ դեղնանարնջագույն, ԴՆԹ-ների նետ՝ կապույտ, ՌՆԹ-ների հետ՝ կարմրամանուշակագույն: Այս ներկանյութի զգայունությունն ավելի ցածր է, քան մասնագիտացված ներկանյութերինը, և այն գունաթափվում է նատրիումի դոդեսուլֆատի միջավայրում: Վերջերս նույն նպատակով օգտագործման համար առաջարկվեց նոր ներկանյութ՝ SYBRGold (MolecularProbes), որի ազդեցության մեխանիզմը նման է բրոմէտիդիումի ազդեցության մեխանիզմին, բայց զգայունության մակարդակը 1000 անգամ բարձր է: Դրա օգտագործմամբ հնարավորություն է ստեղծվում բացահայտել դոնդողի կազմում երկշղթա ԴՆԹ-ի նույնիսկ 20 պկգ և միաշղթա ԴՆԹ-ի 100 պկգ: Մեկ այլ նոր առաջարկված ներկանյութ է MidoriGreen-ը, որը օգտագործվում է միա- և երկշղթա ԴՆԹ-ների և ՌՆԹ-ների ներկման համար: Ներկանյութի գրգռման շրջաններ են 290 և 490 նմ ալիքները իսկ արձագանքի առավելագույն մակարդակը գտնվում է 530 նմ սահմաններում: MidoriGreen ներկանյութը թույլ մուտագեն է և ավելի անվտանգ, քան բոլոր այլ ներկանյութերը: Դետեկցիայի ներկայացվող եղանակը վերլուծական է՝ ուղղված է ֆորեգրամի կազմում ԴՆԹ-ի տարբեր չափսերի հատվածների բացահայտմանը: Այս եղանակով կատարվում է նմուշում առկա ԴՆԹի հատվածների չափսերի որոշում և որակական ախտորոշում: Սակայն հատվածների նուկլեոտիդային կազմը, ինչպես նաև դրանց ճշգրիտ քանակը յուրաքանչյուր թորամասում այս եղանակով չի որոշվում:

2.5.3. Պատրաստուկային էլեկտրաֆորեզ ԴՆԹ-ների նուկլեոտիդային կազմի և ճշգրիտ քանակի որոշման համար կիրառվում է պատրաստուկային էլեկտրաֆորեզ, արդյունքում ստացված պատրաստի ֆորեգրամից անջատվում են դոնդողի առանձին թորամասեր պարունակող կտորները, ապա լուծվում դրանց կազմում առկա ԴՆԹ-ի մաքուր նմուշը ստանալու համար: Ստացված նմուշները պատրաստ են հետագա որակական և քանակական հետազոտման համար: Հայտնի է, որ ՊԱԱԴ-ը, լինելով բարդ կազմակերպված դոնդող, շատ դժվար է քայքայվում, այդ պատճառով պատրաստուկային էլեկտրաֆորեզի դեպքում չի օգտագործվում: Օգտագործվում է հեշտ քայքայվող ագարոզային դոնդողը: Պատրաստուկային էլեկտրաֆորեզը կատարվում է ավելի ցածր լարվածության՝ 5-6 վ/սմ պայմանում, որը չի առաջացնում գերտաքացում և, նպաստելով թորամասերի ճշգրիտ բաժանմանը, արգելակում է դիֆուզիան: ԴՆԹ-ն անջատվում է ագարոզային դոնդողից մի շարք մեթոդներով. դոնդողը ենթարկում են էլյուցիայի բուֆերային լուծույթներով, ցենտրիֆուգում են, սառեցնում/տաքացնում, օգտագործվում են ադսորբենտներ: ԴՆԹ-ի թորամասերի բաժանումը պատրաստուկային էլեկտրաֆորեզի եղանակով շատ տարածված և հաճախ կիրառվող մեթոդ է, այդ պատճառով շատ ընկերություններ արտադրում են ԴՆԹ-ի անջատման ռեագենտների պատրաստի հավաքածուներ: Ներկայացնենք ԴՆԹ-ի անջատման ամենահարմար եղանակները:

2.5.3.1. ԴՆԹ-ի անջատումը ագարոզային դոնդողից PEG/TAE կիրառմամբ՝ էլեկտրաէլյուացիայի եղանակով Ներկայացվող մեթոդը մատչելի է և ճշգրիտ, թույլ է տալիս յուրաքանչյուր թորամասից շատ արագ անջատել ԴՆԹ-ի 90 %: Ավելին, բազմաթիվ թորամասերի ԴՆԹ-ները անջատվում են միաժամանակ, զուգահեռ: Դոնդողում ձևավորված թորամասերից ԴՆԹ-ի մոլեկուլների անջատման համար թորամասերից յուրաքանչյուրի առջևի դոնդողից կտրում են փոքր կտոր և հեռացնում: Առաջանում է փոսիկ: Աշխատանքը կատարում են տրանսիլյումինատորի օգնությամբ (նկ. 2.13): Ապա, հանելով պատրույգները, փոսիկից հեռացնում են ավելորդ բուֆերը և չորացնում փոսիկը:

ոնրl.j

Նկ. 2.13. Թորամասի անջատման սխեման. 1 - ագարոզային դոնդողից PEG/TAE-ի կիրառմամբ ԴՆԹ-ի անջատման սխեման (http://www.dmaks2007.narod.ru/protocol/08_01.html), 2 - մեմբրանային ֆիլտրացիայի համար օգտագործվող փորձանոթ (И.В. Стручкова, Е.А. Кальясова, 2012):

Հաջորդ փուլում չոր փոսիկի մեջ լցնում են PEG/TAE բուֆեր, որի խտությունը շատ բարձր է և արգելակում է ԴՆԹ-ի հատվածների արագ շարժը: Ապա էլեկտրական դաշտի ազդեցությամբ թորամասի ամբողջ ԴՆԹ-ն տեղափոխում են փոսիկի մեջ և լուծում բուֆերում: Աշխատանքը հսկվում է տրանսիլյումինատորի միջոցով: Փոսիկում գտնվող ԴՆԹ-ի լուծույթը պիպետի օգնությամբ տեղափոխվում է փորձանոթի մեջ և պահվում -20 օC պայմաններում: Առանձին փորձանոթներում գտնվող ԴՆԹ-ի մաքուր թորամասերն արդեն պատրաստ են հետագա հետազոտությունների համար: Բացարձակ մաքուր նմուշի ստացման համար անհրաժեշտ է նմուշը ցենտրիֆուգել 2-3 անգամ, ապա լվանալ:

2.5.3.2. ԴՆԹ-ի անջատման մեթոդը ագարոզային դոնդողից ապակե ֆիլտրերի օգտագործմամբ 1. Տրիս ացետատային կամ տրիս ֆոսֆատային բուֆերի օգտագործմամբ կատարվող էլեկտրաֆորեզի ավարտից հետո դոնդողը տեղադրել տրամսիլյումինատորի վրա և զգուշությամբ կտրել դոնդողից ԴՆԹ-ի թորամասը պարունակող հատվածը: 2. Տեղադրել դոնդողի հատվածը էպենդորֆի փորձանոթի մեջ

РРЕ բուֆերային լուծույթ (6 МNaC1O4, 50 мМ Na1,5H1,5PO4 (pH 7) այնպես, որ NaC1O4 ≥ 5 М և 10 мМNa3-ԷԴՏԱ ):

ավելացնել

3. Ապա անոթը տեղափոխել ջերմային պահարան 37 ºС պայմաններ և ժամանակ առ ժամանակ շրջել, որ թեթև դոնդողը չբարձրանա մակերես և լիովին լուծվի: Ինկուբացիան տևում է 30-ից 60 րոպե: 4. 8 մմ-անոց GFC ֆիլտրային թուղթը դնել ապակյա ֆիլտրային սարքի մեջ և թռչել РРЕ բուֆերով: Միացնել վակուումային սարքը ֆիլտրցիայի 0,5 մլ/վ արագության ռեժիմով: Պահպանելով ֆիլտրացիայի 0,5 մլ/վ արագությունը անփոփոխ ԴՆԹ պարունակող լուծույթը տեղափոխել ֆիլտրաթղթի վրա: ԴՆԹ պարունակող անոթը լվանալ բուֆերով և լցնել բուֆերը ֆիլտրային սարքի մեջ: Ֆիլտրացիայի ժամանակ ԴՆԹ-ի հատվածները չեն անցնում թղթի փոքր ծակոտիներով և կուտակվում են ֆիլտրի վրա: Ֆիլտրացիայի ավարտից հետո ֆիլտրաթղթի վրա ավելացնել մի քանի մլ բուֆեր ապա 2-3 մլ 100 %անոց էթանոլ: Այս եղանակով բոլոր մնացորդային մոլեկուլները կլուծվեն և ֆիլտրաթղթի վրա կմնան միայն ԴՆԹ-ի հատվածները: Էլյուատը կարող է հեռացվել (նկ. 2.13.2): 5. Ֆիլտրացիայի ավարտից հետո խոնավ ֆիլտրային թուղթը ծալել չորս անգամ և դնել միկրոֆուգի ասեղով ծակած 0,5 մլ փորձանոթի հատակին հնարավորին չափ խորը, ապա փորձանոթը տեղադրել 1,5 մլ փորձանոթի մեջ: 6. ТЕ (10 мМ триси 1 мМN a2-ԷԴՏԱ, рН-ը՝ 7,5) բուֆերի 10-ից 20 մկլ ավելացնել ֆիլտրաթղթի վրա, թողնել 1 րոպե: Ապա 15 վրկ ցենտ84

րիֆուգել. այդ ընթացքում կկատարվի ԴՆԹ-ի էլյուացիա, և ԴՆԹ-ի հատվածները լուծույթի կազմում կանցնեն 1,5 մլ փորձանոթի մեջ: 7. Ցենտրիֆուգումը կրկնվում է երկու անգամ, դրանց սկզբում փորձանոթ ավելացվում են ТЕ բուֆերի փոքր քանակներ՝ 10-ից 20 մկլ: Արդյունքում ամբողջ ԴՆԹ-ն հավաքվում է մեծ փորձանոթի լուծույթում: ԴՆԹ-ի ստացված մաքուր նմուշը կարող է օգտագործվել տարբեր հետազոտություններում և հեշտությամբ կտրտվում է ռեստրիկցիայի ֆերմենտներով: 2.5.3.3. ԴՆԹ-ի անջատումը ագարոզային դոնդողից սպին ֆիլտրի օգտագործմամբ ԴՆԹ-ի անջատումը դոնդողից սպին ֆիլտրի օգտագործմամբ կատարվում է ստորև բերվող սխեմայի յոթ փուլերով: 1ա. Ագարոզային ֆիլտրից ԴՆԹ-ի անջատման համար դոնդողի ԴՆԹ-ի թորամասը պարունակող հատվածը զգուշորեն կտրվում է, անջատվում և տեղափոխվում 1,5-2,0 մլ տարողությամբ փորձանոթի մեջ: Ապա դոնդողը կշռվում է, փորձանոթ է ավելացվում աբսորբցիա առաջացնող բուֆերի համապատասխան ծավալ՝ դոնդողի 100 մ կգ-ին 100 մկլ բուֆեր: Եթե ագարոզի խտությունը դոնդողում բարձր է՝ 1,5 %, բուֆերի քանակը պետք է կրկնապատկվի: Դոնդողով փորձանոթը տեղադրվում է ջրային բաղնիք (50-65 ºC) 10 րոպեով և ժամանակ առ ժամանակ շրջվում դոնդողի լիարժեք քայքայումը ապահովելու համար (նկ. 2.14): 1բ. Այն դեպքերում, երբ ԴՆԹ-ն գտնվում է ՊՇՌ-ի կամ ռեստրիկցիոն վերլուծության համար օգտագործվող ռեակցիոն խառնուրդում, պետք է ավելացնել նույն ծավալի սորբցիոն բուֆեր, խառնել վորտեքսի օգնությամբ կամ այլ կերպ, և ինկուբացնել սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում 1 րոպե: 2. Ստացված խառնուրդը տեղափոխել սպին-սյունակի ֆիլտրի վրա և թողնել 1-2 րոպե ջերմաստիճանների հավասարեցման համար: 3. Ցենտրիֆուգել 1 րոպե 10000 ց արագությամբ:

'.)ո17աguեt LL(աgոfl....յ, ո'.րե17 1~\

oo aկt

G

" ,1 - t uոg'7այ'1 ~ րո'.րե17

կUե[

վ

uզաa lհtո1,g~t.1

0000g 15 Lն.

10000 g

Շյ 30 Lն.

Նկ. 2.14. Ագարոզային դոնդողից և ռեակցիոն լուծույթներից ԴՆԹ-ի անջատման փուլերի սխեման (http://www.almabion.ru/alma-cleanup-nabor-):

4. Ավելացնել 500 մկլ լվացող լուծույթ և ցենտրիֆուգել 15 վրկ նույն արագությամբ: Էլյուատը հեռացնել: 5. Կրկնել չորրորդ կետը: 6. Լվացող լուծույթի մնացորդը հեռացնելու համար ցենտրիֆուգել ևս 1 րոպե: 7. Տեղափոխել սպին-սյունակը ԴՆԹ-ի էլյուցիայի համար օգտագործվող փորձանոթի մեջ: Սպին-սյունակի մեմբրանի կենտրոն ավելացնել 10-ից 50 մկլ էլյուցիայի լուծույթ և ինկուբացնել 2 րոպե, ապա ցենտրիֆուգել 1 րոպե: Սպին-սյունակում գտնվող ԴՆԹ-ի լուծույթը տեղափոխել այլ փորձանոթ և պահել –20 ºС պայմաններում: ԴՆԹ-ի փոքր հատվածնների ավելի արդյունավետ անջատման համար կարելի է օգտագործել բուֆերների ավելի մեծ քանակներ, և երկարաձգել ինկուբացիայի շրջանը: Դոնդողից ԴՆԹ-ի անջատման այս եղանակն ապահովում է ստացված նմուշների մաքրության բարձր աստիճան:

2.5.3.4. ԴՆԹ-ի անջատումը դոնդողից մագնիսային մասնիկների կիրառմամբ Sileks ընկերությունն արտադրում է ԴՆԹ-ի անջատման լրակազմ հավաքածու, որն ապահովում է բոլոր տիպի հետազոտությունների համար օգտագործվող բացարձակ մաքուր ԴՆԹ-ի ստացում: Հավաքածուն ներառում է՝ - մագնիսային մասնիկներ 500 մկլ, -

բուֆեր GL 15 մլ,

-

բուֆեր Wash 20 մլ,

-

բուֆեր WashEnd 10 մլ,

-

բուֆեր EL 2 մլ:

1. ԴՆԹ-ի անջատման համար կտրել դոնդողից ԴՆԹ-ի նպատակային թորամասը պարունակող հատված և տեղափոխել փորձանոթի մեջ: 2. Ավելացնել բուֆեր GL-ի 3/1 հարաբերակցությամբ ծավալ և խառնել վորտեքսի վրա՝ մինչև դոնդողի հալեցումը: 3. Դոնդողի հալեցումից հետո ավելացնել 10 մկգ լավ խառնված մագնիսային մասնիկների սուսպենզիա 2/1 ԴՆԹ-ի քանակին՝ 5 մկգ հարաբերակցությամբ: 4. Ինկուբացնել խառնուրդը 10 րոպե 50 ºС պայմաններում, ժամանակ առ ժամանակ խառնել մասնիկների սուսպենզիոն վիճակը պահպանելու համար: 5. Տեղադրել փորձանոթը մագնիսային բռնիչի մեջ 1 րոպե՝ ԴՆԹ կլանած մասնիկները կապելու նպատակով, և հեռացել սուպերնատանտը՝ վերնստվածքային հեղուկը: Տեղափոխել փորձանոթը հասարակ բռնիչի մեջ և ավելացնել 400 մկլ բուֆեր Wash, լավ խառնել: 6. Տեղափոխել փորձանոթը մագնիսային բռնիչի մեջ և հեռացնել սուպերնատանտը:

7. Տեղափոխել փորձանոթը հասարակ բռնիչի մեջ և ավելացնել 200 մկլ բուֆեր WashEnd, լավ խառնել սուսպենզիան և տեղափոխել մագնիսային բռնիչի մեջ: 8. Հեռացնել սուպերնատանտը: 9. Չորացնել մնացորդը 60 ºС պայմաններում 10 րոպե: 10. Ավելացնել 40 մկլ բուֆեր EL, ինկուբացնել 60 ºС պայմաններում 10 րոպե: 11. Հավաքել մագնիսային մասնիկները՝ փորձանոթը տեղափոխելով մագնիսային բռնակի մեջ 3 րոպե: Շատ զգույշ հավաքել սուպերնատանտ, որի մեջ գտնվում է էլյուացված ԴՆԹ-ն, և տեղափոխել այլ փորձանոթ: ԴՆԹ-ի անջատված նմուշը լիովին մաքրված է և կարող է օգտագործվել տարբեր հետազոտություններում: Եթե նմուշում մնացել են մագնիսային մասնիկներ, կրկնել 11-րդ կետը (http://www.sileks.com/ru/shortlink/Kits_Isol_DNA_Gel): 2.5.3.5. Ագարոզային դոնդողից ԴՆԹ-ի անջատման այլ մեթոդներ Դոնդողի կազմից ԴՆԹ-ի անջատման համար օգտագործվող մեթոդներից է թորամասի տեղափոխումը դիէթիլենամինէթիլցելյուլոզի վրա: ԴՆԹ-ի թորամասերի բաժանված հատվածները ենթարկել բնափոխման դոնդողի կազմում հիմնային նյութի ազդեցությամբ: Ապա միաշղթա ԴՆԹ-ի նպատակային թորամաս պարունակող ագարոզի հատվածը անջատել դոնդողից և ծածկել նիտրոցելյուլոզային թաղանթով ու ֆիլտրաթղթի շերտերով: Այնուհետև դնել ամբողջ փաթեթը էլեկտրաֆորեզի սարքի մեջ (նկ. 2.15): Էլեկտրական դաշտի լարվածության 40 վ/սմ ազդեցությամբ եռաբրոմային բուֆերի ներկայությամբ ԴՆԹ-ն տեղափոխել նիտրոցելյուլոզային թաղանթի վրա՝ բլոտինգի եղանակով (տես 4.1.1 բաժին): Էլյուցիան ցելյուլոզային թաղանթից կատարվում է ինկուբացման միջոցով 70 ºС պայմաններում 2 мМ NaCl, 1 мМ Na2 ЭДТА, 40 мМ տրիս рН=8,0 բուֆերում և տևում է 30 րոպե (Маниатис и др., 1984): Անջատված ԴՆԹ-ի նպատակային թորամասը կարող է օգտագործվել:

+ րաաljաu

րltե17

Նկ. 2.15. Նիտրոցելյուլոզային թաղանթի վրա ԴՆԹ-ի թորամասի տեղափոխման համար օգտագործվող փաթեթի կազմը (http://www.bialexa.ru/technical-support/methods/western-blot/):

ԴՆԹ-ի անջատում սիլիցիումի փոշու օգտագործմամբ ԴՆԹ-ի թորամասը պարունակող դոնդողի հատվածը կտրվում է և հալեցվում 6 М-ոց KI լուծույթում 55 ºС պայմաններում 10 րոպե: Հետո ավելացվում է սիլիցիումի փոշու սուսպենզիա 3 М-ոց KI լուծույթում 300 մկգ սիլիցիում 1 մկգ ԴՆԹ-ի հաշվարկով և 2 րոպե ինկուբացվում 55 ºС պայմաններում.: Հետո ցենտրիֆուգվում 2 րոպե 2000 g արագությամբ: Ապա 2 անգամ լվացվում 50 мМ NaCl, 10 мМ տրիս -HCl, рН 8,0, 2,5 мМ Na2 ԷԴՏԱ и 50 % էթիլային սպիրտ պարունակող լուծույթով սիլիցիումի հեռացման համար: Էլյուցիայից հետո ԴՆԹ-ն առաջացնում է ջրային սուսպենզիա (Boyle, Lew, 1995): ԴՆԹ-ի անջատում սառեցման հալեցման միջոցով ԴՆԹ պարունակող դոնդողը 10 րոպե ինկուբացվում է հեղուկ ազոտում, ապա ցենտրիֆուգվում 15 րոպե 12000 g արագությամբ: Ապա ավելացվում է 2 ծավալ սուպերնատանտ՝ 3 МNaAc և 1/10 ծավալով էթանոլ: Լուծույթ անցած ԴՆԹ-ի թորամասը անջատելու և նստվածք իջեցնելու համար կատարվում է ցենտրիֆուգում 10 րոպե 12000 g արագությամբ:

2.6. ՊԱԱԴ ԴՈՆԴՈՂԻ ՕԳՏԱԳՈՐԾՄԱՄԲ ԿԱՏԱՐՎՈՂ

ԷԼԵԿՏՐԱՖՈՐԵԶԻ ԱՌԱՆՁՆԱՀԱՏԿՈՒԹՅՈՒՆՆԵՐԸ

ՊԱԱԴ դոնդողը էլեկտրաֆորեզի համար առաջարկվել է Լ. Յստեյնի և Դ. Դեվիսի կողմից: Պոլիակրիլամիդը իներտ նյութ է, որը կարելի է եռացնել, պատրաստել դրա լուծույթի տարբեր խտությունները և դրանով իսկ ապահովել առաջացվող դոնդողի խորշերի տարբեր չափսեր և մոլեկուլային ցանցի լավագույն կազմություն: Ստացվող դոնդողը թափանցիկ է, պինդ և ճկուն: Օգտագործվող դոնդողներից ամենաճշգրիտ բաժանումը ապահովում է ՊԱԱԴ-ը, բայց դրա պատրաստման համար օգտագործվող ակրիլամիդը թունավոր է:

СН2=СН–СО–NН2СН2=СН–СО–NН–СН2–NН–СО–СН=СН2

Ակրիլամիդ N, N՝-մեթիլենբիսակրիլամիդ Ակրիլամիդի պոլիմերացումը առաջացնում է երկար ձողեր, որոնք կապվում են իրար իսկ N, N՝-մեթիլենբիսակրիլամիդի միացումը կարում է ձողերը՝ առաջացնելով ցանցային կազմություն: Եռամեր ցանցը ստացվում է համատեղ պոլիմերացման արդյունքում: Պոլիմերացումը կատարվում է ինիցիատոր և կատալիզատոր նյութերի ներկայությամբ: Որպես ինիցիատոր օգտագործվում է ամոնիումի պերսուլֆատը՝ (NH4)2S2O8, իսկ որպես կատալիզատոր՝ տետրամեթիլենդիամինը՝ (CH3)2N–CH2–CH2–N(CH3)N, N, N’, N’: Փոփոխելով ՊԱԱԴ-ի խտությունը դոնդողում՝ կարելի է փոխել դոնդողի խորշերի չափսերը և հարմարեցնել դրանք բաժանվող նյութերի մոլեկուլների չափսերին: Այսպես՝ 7,5 % խտությամբ դոնդողի խորշերի միջին չափը 5 նմ է, իսկ 30 % դոնդողինը՝ 2 նմ: Դոնդողի խտության ընտրության ժամանակ հաշվի են առնում բաժանվող նյութերի մոլեկուլային զանգվածը և չափսերը:

2.7. ՈՒՂՂԱՀԱՅԱՑ ԴՈՆԴՈՂԱՅԻՆ ԷԼԵԿՏՐԱՖՈՐԵԶ

Դոնդողային էլեկտրաֆորեզը կատարվում է ինչպես արդեն ներկայացված հորիզոնական, այնպես էլ ուղղահայաց տարբերակով: Օգտագործվում են ուղղահայց էլեկտրաֆորեզի խողովակային և թիթեղային եղանակները: Ուղղահայաց էլեկտրաֆորեզի դեպքում մասնիկները հավասար բաշխվում են խոռոչիկներում՝ առաջացնելով միատարր մակերես: Դժվարությունն այն է, որ դոնդողը կարող է սահել և դուրս գալ խողովակից կամ թիթեղների ճեղքից: Ուղղահայաց էլեկտրաֆորեզի սարքերի կազմությունը բարդ է. բուֆեր պարունակող անոթները գտնվում են տարբեր բարձրության վրա, քանի որ վերևի էլեկտրոդը պարունակող անոթը պետք է բարձրացվի դոնդողից վերև: 2.7.1. Ուղղահայաց դոնդողային խողովակային էլեկտրաֆորեզ Ուղղահայաց խողովակային էլեկտրաֆորեզի կատարման համար օգտագործվում են սարքեր, որոնց կառուցվածքային սխեման ներկայացվում է նկար 2.16-ում: Սարքը կազմված է թափանցիկ պլեքսիգլասից պատրաստված երկու էլեկտրոդային անոթներից, որոնցից ներքևինը մեծ է, իսկ երկրորդը՝ փոքր և վերևից հագնվում է առաջինի վրա: Վերևի անոթում գտնվում են խողովակները պահող բռնակները, որոնց անցքերը պարունակում են ռետինե միջադիրներ և ամուր պահում են դոնդող պարունակող խողովակները: Ամեն մի սարքում կա խողովակների համար նախատեսված 12-18 անցք: Եթե նմուշների քանակը սակավ է, օգտագործվում են դրանց թվին համապատասխան թվով խողովակներ, իսկ մյուս անցքերը խցանվում են: Խողովակները ամրացվում են վերևի անոթում այնպես, որ վերևի ծայրը գտնվի վերևի անոթի հատակից բարձր, իսկ ներքևինը չկպչի ներքևի անոթի հատակին: Պետք է նշել, որ ուղղահայաց էլեկտրաֆորեզի դեպքում նմուշների շարժը պայմանավորված է նաև դրանց մոլեկուլային զանգվածով և ավելի արագ է: Միակ կարևոր խնդիրն այն է, որ դոնդողը կարող է ամուր չփոխազդել ապակե պատերի հետ և խողովակից դուրս սահել:

Ներքևի անոթում բուֆերի քանակի ավելցուկը անհրաժեշտ է ջերմային ռեժիմի կայունության պահպանման համար: Որոշ սարքերում լինում են ներդրված տարրեր, որոնք, խառնելով բուֆերը, խոչընդոտում են ջերմաստիճանի բարձրացմանը խողովակներում: Պլատինե էլեկտրոդները ամրացվում են վերևի և ներքևի անոթներում: Ներքևի անոթում էլեկտրոդը ամրացվում է այնպես, որ դրանից բարձրացող պղպջակները չհասնեն ապակե խողովակների ստորին ծայրին և չխանգարեն էլեկտրաֆորեզի բնական ընթացքին:

.)

Iկ

u::,

/

'-:5

Ց ,,,,- •••••,.,.,,..~

I ա

բ

Նկ. 2.16. Խողովակային ուղղահայաց էլեկտրաֆորեզի սարքի տեսքը (ա) և կառուցվածքային սխեման (բ). 1 - վերևի բուֆերային անոթ, 2 - միջին խողովակ, 3 - վերևի էլեկտրոդ, 4 - ռետինե բռնակ, 5 - խողովակներ, 6 - բուֆերի ներքևի անոթ, 7 - ներքևի էլեկտրոդ, 8 - շտատիվ (https://infopedia.su/16x7e3b.html, https://yandex.ru/images/search?p):

Անոթների թափանցիկ պատերը թույլ են տալիս վերահսկել և էլեկտրաֆորեզի ընթացքը, և ներկանյութի շարժը դոնդողում: Ապակե խողովակների պատերը բարակ են, իսկ կտրվածքի տրամագիծը սովորաբար տատանվում է 5-6 մմ սահմաններում: Տարբեր նմուշների և հետազոտությունների համար օգտագործվում են տարբեր տրամագիծ ունեցող խողովակներ: «Bio-Rad» կազմակերպությունն արտադրում է տարբեր տրամագծով խողովակների և դրանց համապատասխանող վերևի անոթների հարուստ տեսականի: Դոնդողը պատրաստում են անմիջապես խողովակի մեջ՝ նախապես ներքևի անցքը փակելով պարաֆինով կամ այլ եղանակով: Խողո92

վակները ամրացվում են ուղղահայաց: Մոնոմերների լուծույթը խառնում են ամոնիումի պերսուլֆատի հետ, ապա լավ խառնելուց հետո օգնական խողովակով լցնում դոնդողային խողովակների մեջ՝ այնպես, որ դրանց վերևի ծայրը մնա չոր և դոնդողից ազատ: Դոնդողի ձևավորումից հետո ներքևի ծայրը բացում են և խողովակը ամրացնում բռնակի մեջ: Հաջորդ քայլով վերևի անոթի մեջ լցվում է բուֆեր, ապա մաքրված և սախարոզի 5-10 % լուծույթ պարունակող նմուշները ներմուծվում են խողովակի վերևի ծայրում՝ բուֆերի շերտի տակ, անմիջապես դոնդողի մակերեսին: Էլեկտրաֆորեզի ավարտից հետո դոնդողը հանում են մեխանիկական եղանակով՝ ճնշման տակ կամ ապակուց անջատելու եղանակով: Հնարավոր է օգտագործել նաև 0,5-1,0 %-անոց դետերգենտներ: Էլեկտրաֆորեզի այս եղանակի հիմնական դժվարությունը խողովակում ջերմաստիճանային գոտիների առաջացումն է, որի արդյունքում թորամասերը խողովակի կենտրոնում ավելի արագ են շարժվում, քան ապակու հարևանությամբ: Արդյունքում ԴՆԹ-ի հատվածները բարձր ջերմաստիճանի գոտում շարժվելով ավելի արագ առաջացնում են թորամասի կորաձևություն նույնիսկ շատ բարակ խողովակների դեպքում: Ուղղահայաց խողովակային էլեկտրաֆորեզի մեթոդի բարելավմանը կնպաստի ջերմաստիճանի կարգավորման մեթոդների կատարելագործումը: 2.7.2. Շերտային ուղղահայաց դոնդողային էլեկտրաֆորեզ Ուղղահայաց շերտային էլեկտրաֆորեզը խողովակային էլեկտրաֆորեզից տարբերվում է նրանով, որ այս դեպքում դոնդողի մեկ լայն շերտի վրա առանձին գծերով բաժանվում են բազմակի նմուշներ: Դոնդողի վրա ստացվող թորամասերի պատկերը նման է հորիզոնական դոնդողային էլեկտրաֆորեզից ստացված պատկերին: Փորձերում օգտագործվում են նույն դոնդողները՝ ագարոզային կամ ՊԱԱԴ-ային: Ուղղահայաց շերտային էլեկտրաֆորեզը կատարում են 5-6 մմ հայելային ապակիների երկու շերտերի միջև գտնվող դոնդողի շեր93

տում: Դոնդողային շերտի լայնությունը կարգավորվում է ապակիների միջև դրվող տեֆլոնային կամ պլեքսիգլասային ներդիրներով (նկ. 2.17, 2.18): Ներդիրները կարելի է դնել նաև ապակիների ներքևի ծայրերին և սեղմելով ապահովել ձևավորվող դոնդողի անհրաժեշտ չափսերը:

Նկ. 2.17. Ուղղահայաց շերտային էլեկտրաֆորեզի համար կիրառվող սարքերի սխեման. 1 - բուֆերային անոթ, որի մեջ դրվում են ապակիները և դրանք պահող բռնակները, 2 - էլեկտրոդներ, 3 - հայելային ապակիներ, 4 - պլեքսիգլասային ներդիրներ և դրանք ֆիքսող բռնակներ, 5 - ներքևի ներդիր՝ հիմք (https://yandex.ru/images/search?img3A%2F%):

Ձևավորված ծավալի մեջ լցվում է ՊԱԱԴ-ի կամ ագարոզի հալեցված զանգվածը: Նմուշների համար խցիկներ առաջացնելու նպատակով դեռ պնդացող դոնդողի վերին կողմում ապակիների միջև նեդրվում է ատամնավոր պլեքսիգլասային սանր: Սանրի ատամները ձևավորում են խցիկներ պնդացող դոնդողի մեջ (նկ. 2.18): Էլեկտրաֆորեզի ժամանակ նույն դոնդողի տարբեր խցիկների մեջ ներմուծվում են տարբեր նմուշներ, որոնց կազմի ԴՆԹ-ի հատվածները, շարժվելով էլեկտրական դաշտում, առաջացնում են յուրաքանչյուր նմուշի համար շարժման առանձին ուղիներ՝ տրեկներ: Վերևի անոթում բուֆերի մակերեսը պետք է լինի ավելի բարձր, քան դոնդողը սահմանող ապակե պատերի բարձրությունը, որի շնորհիվ բուֆերը լցվում է երկու ապակիների միջև առաջացող ճեղքի մեջ, ծածկում ամբողջ մակերեսը: Ինչպես և էլեկտրաֆորեզի այլ դեպքերում, այս դեպքում ևս օգտագործում են պլատինե էլեկտրոդներ:

ն~ոշնtրti նtրրiր~ան tնցt,կնtր Բո:jրtրր tjtրl,ր անոր,

~ աl/lորl

Բո:Բtր Li'-կակո 2tրոtրր ~ti2t. գոնtյո'l րiոնրiո'l

UCորi

ր-.,,..,,~~ Uոtեl!ոգներ,~,-------~

աllUոlf11\ նllո2ոնl

~

ttեl!lոր,ա

J

E Ըե.

~որiեգ

ո1եկո1~եր~ շարժ~

Պ

t րկuoրlllP,1l~

"lո~զոզ~ 6ակոոր~tրo

C: E

.g

Նկ. 2.18. 1 - Ուղղահայաց էլեկտրաֆորեզի սարքի կազմության սխեման, 2 - էլեկտրաֆորեզի պրոցեսում նմուշում գտնվող մոլեկուլների բաժանման սխեման (https://yandex.ru/images/search?img3A%2F%):

Էլեկտրաֆորեզի ավարտից հետո դոնդողը անջատում են ապակիներից և տեղափոխում ներկ պարունակող անոթի մեջ: Աշխատանքը անհրաժեշտ է կատարել ձեռնոցներով՝ դոնդողի վրա առկա թորամասերի պահպանման համար: 2.8. ԴԻՍԿ-ԷԼԵԿՏՐԱՖՈՐԵԶ (discontinuity) Սովորական էլեկտրաֆորեզը կատարվում է անփոփոխ պայմաններում, այսինքն՝ էլեկտրական դաշտի լարվածությունը, միջավայրի և բուֆերների pH-ը, դոնդողի կազմը և խտությունը պահպանվում են անփոփոխ փորձի ամբողջ ընթացքում: Դրա կատարելագործված տարատեսակը՝ դիսկ-էլեկտրաֆորեզը, կատարվում է բուֆերի ու դոնդողի pH-ի և այլ գործոնների ցուցանիշների փոփոխականության պայմաններում: Էլեկտրաֆորեզի այս եղանակի անվանումը ձևավորվել է

անգլերեն երկու բառերի հիման վրա՝ discontinuity (ոչ միատարր, փոփոխվող), որը բնութագրում է էլեկտրական դաշտի փոփոխական բնույթը, և discoid (սկավառակ): Դիսկ-էլեկտրաֆորեզի դեպքում դոնդողի խտությունը և դրա ցանցի խցիկների չափսերը, բուֆերի pH-ը և էլեկտրական դաշտի լարվածությունը փուլից փուլ կտրուկ փոխվում են: Դիսկ-էլեկտրաֆորեզը ՊԱԱԴ-ի վրա կիրառում են սպիտակուցների մոլեկուլների բաժանման համար և փորձի ընթացքում օգտագործվում են երկու կամ երեք տիպի դոնդողներ: 1. Առաջին դոնդողը՝ ստարտայինն է, գտնվում է ամենավերևում, միշտ չէ որ օգտագործվում է, պարունակում է նմուշը և էլեկտրաֆորեզի ընթացքը ու թորամասերի շարժը տեսանելի դարձնող նշադրային ներկանյութ: Դոնդողի pH-ը հավասար է 8,3, խորշերը մանր են: -

ttեl!t.որորiաiոն րո~երi

ՏրրUգնրցրրյայրրյ րո:j)եր րH- Ց.3

lնU1ացնորi_ 11ոu 11որ1

Տրt,ն-HՇL րH- ծ,Ց

Բաժանո11 րiոնրiորt

Տ11t,ն-HՇL րH-Ց.Ց

tt եկt.որiո11-այհLI րո~երi

ՏոհնՀ11t,ցt,նա1t,ն րո:j)եր րH-Ց.3

+ Նկ. 2.19. Բուֆերների և դոնդողի փոփոխվող կազմը դիսկ-էլեկտրաֆորեզի սարքի տարբեր գոտիներում (И.В. Стручкова, Е.А. Кальясова, 2012):

2. Երկրորդ՝ խտացնող դոնդողի պատրաստման համար օգտագործվող բուֆերի pH-ը հավասար է 6,5 իսկ ՊԱԱԴ-ի խտությունը դոնդողում՝ 4 %: Դոնդողի ցանցի խորշերը խոշոր են: 3. Երրորդ՝ բաժանող դոնդողը պատրաստվում է բուֆերով, որի pH-ը հավասար է 8,5-9,0 իսկ ՊԱԱԴ-ի խտությունը դոնդողում՝ 10-20 %-ի: Բարձր խտության դոնդողային ցանցի խորշերը փոքր են: Սովորաբար փորձերում օգտագործվում են միայն խտացնող և բաժանող դոնդողները: Դոնդողների դասավորությունը ուղղահայաց

էլեկտրաֆորեզի սարքում ներկայացվում են նկարներ 2.19-ում և 2.20ում: Դիսկ-էլեկտրաֆորեզի առանձնահատկություններից են նաև էլեկտրոդային բուֆերի կազմում շարժունակ իոնների առկայությունը, որոնք, ունենալով սպիտակուցների լիցքի նշանը, շարժվում են էլեկտրական դաշտում նույն ուղղությամբ, օրինակ՝ թթվային բուֆերներում դրական լիցքավորված K+, իսկ հիմնային բուֆերներում՝ բացասական լիցքավորված Cl-: Այս միջավայրում սպիտակուցի հետ նույն ուղղությամբ շարժվող իոնների արագությունը ուղղակիորեն պայմանավորված է բուֆերի pH-ով: Որպես լրացուցիչ իոններ նպատակահարմար է օգտագործել նաև հասարակ ամինաթթուները՝ գլիցին կամ p-ալանին, որոնց իզոէլեկտրական կետը գտնվում է չեզոք դաշտում, գլիցինինի դեպքում՝ p=5,97: Էլեկտրական դաշտի ազդեցությամբ բուֆերի կազմի գլիցինի իոնները շարժվում են սպիտակուցից հետո՝ նույն էլեկտրոդի ուղղությամբ, և հասնում խտացնող դոնդողին: Թորամասերի շարժվող սահմանները ձևավորվում են առջևում արագ շարժվող Cl- իոնների և սպիտակուցներից հետո շարժվող գլիցինի իոնների ազդեցությամբ: Նմուշի pH-ը ընտրվում է այնպես, որ մոտավորապես երեք միավորով զիջի գլիցինի ցուցանիշին: Այդ պատճառով սպիտակուցների սահմանի վրա գլիցինի իոնների միայն 0,1 %-ն ունի բացասական լիցք: Նույն պատճառով բուֆերի Cl- իոնները փոխարինվում են գլիցինի իոններով, որոնք, խտացնող դոնդողում pH-ի 6,8 պայմաններում չեզոքացվում են և դադարում են մասնակցել էլեկտրական հոսանքի փոխանցման պրոցեսին: Խտացնող դոնդողի վերևի հատվածի դիմադրության աստիճանը բարձրանում է և առաջացնում էլեկտրական դաշտի լարվածության բարձրացում: Երկու՝ առջևի և ավարտող թորամասերի սահմաններին առաջացող մեկուսացված բարձրավոլտային գրադիենտների ազդեցությամբ սպիտակուցների շարժի արագությունը խտացնող դոնդողում մեծանում է: Դրան նպաստում է նաև խտացնող դոնդողի ցանցի խորշերի մեծությունը:

Հասնելով խտացնող դոնդողի սահմանին՝ սպիտակուցային մոլեկուլները անցնում են բաժանող դոնդողի մեջ, որի խորշերը մանր են, և դանդաղեցնում են շարժման արագությունը: նliոշti tնցtilյներi կաlilո'l -

ULl.lաlյե Ljաli Lll[աUUltյLj ~ · շե17U1

Նկ. 2.20. Դիսկ-էլեկտրաֆորեզի համար օգտագործվող սարքի և դոնդողների դասավորման սխեման (https://yandex.ru/images/search?img3A%2F%):

Էլեկտրոդային բուֆերը, հասնելով բաժանող դոնդողի բարձր pH-ի գոտուն, արագացնում է գլիցինի իոնների շարժը և համապատասխանորեն էլեկտրական դաշտի լարվածությունը նվազում է: Այս գործոնը ավելի է դանդաղեցնում սպիտակուցային մոլեկուլների շարժման արագությունը: Որպես արդյունք նմուշի մոլեկուլները խտանում են և երկու դոնդողների սահմանին առաջացնում բարակ, խիտ շերտ: Այնուհետև մանրախորշային բաժանող դոնդողի կազմում սպիտակուցային մոլեկուլների շարժման արագությունը պայմանավորված է միայն դրանց մոլեկուլների զանգվածով, ուստի տարբեր զանգված ունեցող դանդաղ շարժվող մոլեկուլները բաժանվում են թորամասերի: Դիսկ-էլեկտրաֆորեզի համար օգտագործվող սարքի սխեման ներկայացվում է նկար 2.20-ում, դիսկ-էլեկտրաֆորեզի ընթացքը մեկնաբանող սխեմաները՝ նկար 2.21-ում: Ինչպես արդեն նշվել է, ուղղահայաց դիսկ-էլեկտրաֆորեզը սովորաբար օգտագործվում է սպիտակուցների խառնուրդների բաժանման համար, իսկ հորիզոնական դիսկ-էլեկտրաֆորեզը՝ ԴՆԹ-ների տարբեր հատվածների բաժանման համար:

..=-'0-'

G

րe _.,,

}]l5

-a~ .,:. C:

=Շl

րo

-

-Ը.t.

N

C1

C: Cl.

րe 3..,

_.,, ,A-

=.Ը. Շl C:

!'.յ.

~

.:Ո

N

Շ:

=

,.:l

Ը...::ր

-

,A-

G]

_.,,

C: C:

_.,,

cir= }

-]

.t::..

}յԷ ,::_A-

C.

-6;~

Շl C:

.Ը. - C:

-Պ'C1

Ը.t.

Նկ. 2.21. Դիսկ-էլեկտրաֆորեզի ընթացքի սխեման.

1 - բաժանող դոնդող, 2 - խտացնող դոնդող, 3 - նմուշ պարունակող դոնդող: ա - փորձի սկզբում նմուշը գտնվում է համապատասխան դոնդողում, բ - նմուշը էլեկտրական դաշտի և դոնդողի ազդեցությամբ առաջացրել է խիտ գծային շերտ խտացնող դոնդողում և շարժվում է դեպի դոնդողների սահման, գ - բաժանվող դոնդողում սպիտակուցային մոլեկուլները զանգվածների տարբերության համաձայն շարժվում են տարբեր արագությամբ և առաջացնում թորամասեր (https://present5.com/metody-

razdeleniya-belkovyx-smesej-elektroforez-lekciya-5/):

Դիսկ-էլեկտրաֆորեզի մեթոդը կիրառվում է գիտական և բժշկագիտական հետազոտություններում: Օրինակ՝ բժշկագիտության մեջ օգտագործվում է առողջ և հիվանդ մարդկանց օրգաններում սպիտակուցային կազմի համեմատական հետազոտություններ կատարելու համար: Գենետիկական հետազոտություններում մեթոդը կիրառվում է մուտացիաների ախտորոշման և սպիտակուցների ամինաթթվային կազմի ուսումնասիրման համար, մանրէաբանությունում` հարուցիչների ախտորոշման համար և այլն:

2.9. ՊՈՒԼՍ-ԷԼԵԿՏՐԱՖՈՐԵԶ

(PULSED-FIELDGELELECTROPHORESIS, PFGE)

Սովորական էլեկտրաֆորեզի եղանակով ԴՆԹ-ի մեծ մոլեկուլների բաժանմանը խանգարում է երկու հանգամանք: Առաջին՝ էուկարիոտների քրոմոսոմների ԴՆԹ-ի մոլեկուլների երկարությունը կարող է հասնել մինչև մի քանի տասնյակ մմ, իսկ դրանց տրամագիծը հավասար է 20 նմ, առանցքային հարաբերությունը՝ 106: Այսպիսի հարաբերությամբ մոլեկուլները գերզգայուն են շարժող ուժերի նկատմամբ և հեշտությամբ մասնատվում են ԴՆԹ-ի մոլեկուլների բաժանման սովորական մեթոդների կիրառման դեպքում: Երկրորդ՝ 40-50 և ավելի հ.զ.ն-ից կազմված ԴՆԹ-ի հատվածները կայուն էլեկտրական դաշտում շարժվում են նույն արագությամբ և չեն բաժանվում թորամասերի: Այսպիսով՝ պուլս-էլեկտրաֆորեզի մեթոդը կիրառվում է բարձրամոլեկուլային՝ 10 հ.զ.ն-ից մինչև 10 մլն.զ.ն-ից կազմված ԴՆԹ-ի շղթաների բաժանման համար: Բաժանումը կատարվում է ագարոզի դոնդողում ուղղությունը փոխող՝ զարկերակող էլեկտրական դաշտում (Orbach et al., 1988, Kuspa, et al., 1989, Cooney, 1992): Մեթոդը լայնորեն կիրառվում է գենոմիկայի բնագավառում կատարվող հետազոտություններում, քանի որ հնարավորություն է տալիս բաժանել պրոկարիոտների և ցածրագույն էուկարիոտների ամբողջական ԴՆԹ-ները և բարձրագույն էուկարիոտների ԴՆԹ-ների մեծ հատվածները: Անգլերենում ԴՆԹ-ների բաժանման մեթոդը երկու բութ անկյան տակ հերթականությամբ ազդող էլեկտրական դաշտերում անվանում են pulsed-field gel electrophoresis, PFGE, այլ երկրներում՝ պուլսէլեկտրաֆորեզ: Առաջին անգամ ԴՆԹ-ի մեծ մոլեկուլները պուլս-էլեկտրաֆորեզի եղանակով բաժանել են անցյալ դարի 80-ական թվականներին Շվարցը և իր համահեղինակները: Վերը նշված դժվարությունները հաղթահարելու համար նրանք մշակել են քրոմոսոմների ամբողջական ԴՆԹ-ի անջատման յուրահատուկ մեթոդ, ապա ստացված մոլեկուլները բաժանել տարբեր ուղղություններով և հերթականությամբ ազդող

էլեկտրական դաշտերի օգտագործմամբ: Հետազոտությունների համար ընտրվել էր Saccharomyces cerevisiae-ի քրոմոսոմների ԴՆԹ-ն: Հեղինակները ենթադրեցին, որ ուղղությունը փոխող էլեկտրական դաշտում տարբեր չափսերի մոլեկուլների ապակողմնորոշումը կկատարվի տարբեր արագությամբ և համապատասխանաբար դրանք կշարժվեն տարբեր արագությամբ և, բաժանվելով, կառաջացնեն առանձին թորամասեր (Schwartz, et al., 1989): Ավելի ուշ Սոթերնը և համահեղինակները առաջարկեցին փորձնական արդյունքներն ավելի հստակ բացահայտող մոդել (Southern, et al., 1987): Նրանց վարկածի համաձայն՝ մակրոմոլեկուլները էլեկտրական դաշտում ձգվում են դաշտի ազդեցությանը զուգահեռ, և ծայրերից մեկը դառնում է առաջնորդային, իսկ երկարությունը համամասնական է մոլեկուլի բացարձակ երկարությանը: Դաշտի անջատումից հետո ԴՆԹ-ի մակրոմոլեկուլները մնում են նույն տեղում և պահպանում ձգված ձևը, քանի որ դրանց շարժման արագությունն աննշան է: Այլ ուղղությամբ ազդող դաշտի ազդեցությամբ շարժվելու համար պետք է ձևավորվի առաջնորդ ծայր: Առաջնորդ կարող է լինել կամ մոլեկուլի ծայրերից մեկը, կամ մոլեկուլի շղթայի միջին հատվածում առաջացող ծալքի կետը: Սակայն երկրորդ դեպքը քիչ հավանական է: Երկրորդ էլեկտրական դաշտի ուղղությունները կարող են լինել 90º, այս դեպքում ծայրերից յուրաքանչյուրը կարող է դառնալ առաջնորդող: Եթե անկյունը փոքր է 90 աստիճանից, առաջնորդ է դառնում առաջին ծայրը, եթե մեծ է 90 աստիճանից՝ հետ ընկած ծայրը: Այսպիսով՝ բաժանումը կատարվում է այն դեպքում, երբ դաշտերի ուղղությունների միջև առկա անկյունը մեծ է 90 աստիճանից: Մոլեկուլների բաժանման աստիճանը կլինի համամասնային դրանց երկարությանը և դաշտերի ուղղության փոփոխման փուլերի քանակին (նկ. 2.22): Նկարում ներկայացված է բութ անկյան տակ ազդող երկու էլեկտրական դաշտերի ազդեցությամբ առաջացող մակրոմոլեկուլների բանժանման փուլայնությունը. Ա-ն 1-ին դաշտի ազդեցության ուղղությունն է, Բ-ն՝ 2-րդ դաշտի ազդեցության ուղղությունը, Գ-ն՝ փոքր մոլեկուլների ավելի արագ շարժի պատկերը, Դ, Ե, Զ - դաշտի ուղղության

փոփոխման ամեն փուլում երկարությամբ տարբերվող մոլեկուլների միջև հեռավորությունը մեծանում է:

~

:.·0

1/

լill

~

-~

~ Թ]

/"'-1/

~ Թ]

..

..

/.

Պ--.

~ 8յ

/~

լ§]

..

/ 1/

[ցյ

Նկ. 2.22. Դաշտի ուղղության փոփոխմամբ առաջացող մակրոմոլեկուլների շարժման փոփոխման սխեման: E1 և E2 - էլեկտրական դաշտի լարվածության վեկտորներ (Е.С. Насонова, 2008):

Այժմ ստեղծվել են ներկայացվող մեթոդի մի շարք մոդիֆիկացիաներ, որոնցից առավել հաճախ օգտագործվողներն են FIGE և CHEF մեթոդները (նկ. 2.23): FIG£

c:=Jc::::ic::::::::,c:::1c::::i

Նկ. 2.23. Շրջվող դաշտով դոնդողային էլեկտրաֆորեզի սխեման: Էլեկտրական դաշտի ուղղությունը ամեն փուլում շրջվում է 180º, ինչի շնորհիվ թորամասերը շարժվում են դոնդողում ուղիղ զուգահեռ գծերով

(Е.С. Насонова, 2008): Կերլը և համահեղինակները առաջարկեցին օգտագործել երկու նույն երկարությամբ էլեկտրոդներով սովորական հորիզոնական էլեկ102

տրաֆորեզի սարք (Carle, et al., 1986): Այդ սարքում էլեկտրական դաշտի ուղղությունը փոփոխվում է 180 աստիճանով: Այս մեթոդը կոչվեց շրջվող դաշտով դոնդողային էլեկտրաֆորեզ (Field-Inversion Gel Electrophoresis, FIGE): Մոլեկուլների շարժման ուղղության կայունությունը ապահովվում է տարբեր ուղղված դաշտերի օգտագործման ռեժիմի առանձնահատկություններով. դաշտերից մեկն ավելի երկար է ազդում, քան երկրորդը: Թորամասերի ուղղությունը կարող է պահպանվել անփոփոխ այն դեպքում, երբ ազդող դաշտերից մեկի լարվածությունն ավելի բարձր է, քան երկրորդինը: Մեթոդի առավելություններից են սարքավորումների հասանելիությունը և էլեկտրական դաշտի հոմոգենությունը: Սակայն մեթոդը ունի նաև բացասական կողմ. թորամասերի բաժանումը հստակ չէ, դրանք կարող են խառնվել՝ առաջացնելով ստացված արդյունքների սխալներ: Չուն և համահեղինակները (Chu, et al., 1986) ստեղծեցին պուլսէլեկտրաֆորեզի հոմոգեն, վերահսկվող էլեկտրական դաշտով սարք (Contour-Clamped Homogeneous Electric Field, CHEF): Այս սարքում կատարվող էլեկտրաֆորեզի ընթացքում ԴՆԹ-ի մոլեկուլների շարժի արագությունը կախված չէ դրանց դիրքից դոնդողի վրա, շարժման ուղղությունները չեն հատվում, մնում են ուղիղ և զուգահեռ: CHEF սարքի կետային էլեկտրոդները դասավորված են հեկսագոնալ շրջանակի կողմերի վրա և էլեկտրաֆորեզի ընթացքում դաշտի լարվածությունը այնպես է կարգավորվում, որ դաշտը մնա հոմոգեն (նկ. 2.24): CHEF - - համակարգի օգտագործման շնորհիվ հաջողվում է ստանալ ԴՆԹ մոլեկուլների հստակ բաժանում ուղիղ, չհատվող գծերի վրա: Ֆորեգրամն ունի սովորական տրեկների տեսք: Ներկայացվող սարքի օգտագործմամբ հեղինակները կարողացան բացահայտել 16 քրոմոսոմներից 14-ը (Chu, et al., 1986): Նույն մեթոդի օգնությամբ 1987 թ. հաջողվեց ստանալ E. coli-ի К12 շտամի գենոմային քարտեզը, իսկ 1989 թ. էուկարիոտ Saccharomyces pombeի 15 մբ ծավալով գենոմի քարտեզը:

+

Նկ. 2.24. CHEF սարքում ստեղծվող պուլսային հոմոգեն դաշտի սխեման (Е.С. Насонова, 2008):

Մեթոդը վերջին տարիներին ամենուրեք օգտագործվում է գենոմային հետազոտություններում: Օրինակ՝ 1992 թ. ամերիկյան և ճապոնական գիտնականների մի մեծ խումբ հայտնեց մարդու 21-րդ քրոմոսոմի մեծ հատվածների ռեստրիկցիայի քարտեզ կազմելու մասին (Ichikawa, et al., 1992 , Wang, et al., 1992): Այժմ արդեն պուլս-էլեկտրաֆորեզի կատարման համար մշակվել և արտադրվում են սարքեր, որոնցում էլեկտրական դաշտի ուղղության փոփոխությունը կատարվում է դոնդողի հիմքի շարժման միջոցով: Այս սկզբունքով աշխատող սարքերը կոչվում են պտտվող դոնդող անշարժ էլեկտրական դաշտում (Rotating gel in a consant field, RGCF): Այլ սարքերում էլեկտրական դաշտի ուղղության փոփոխումը կատարում են շրջվող էլեկտրոդների օգտագործման մեթոդով (ROFE): Տարբեր ֆիրմաներ մշակել և արտադրում են այս սկզբունքներով աշխատող պուլս-էլեկտրաֆորեզի ավտոմատացված սարքեր (նկ. 2.25): Պուլս-էլեկտրաֆորեզի արդյունավետ կատարման վրա ազդում են ինչպես ԴՆԹ-ի մաքրման մեթոդները և փոխարինվող էլեկտրական դաշտերի միջև ընկած անկյան մեծությունը, այնպես էլ Էլեկտրական դաշտի ուղղության փոփոխման հաճախականությունը՝ դաշտի ազդեցության տևողությունը յուրաքանչյուր ուղղությամբ, էլեկտրական

դաշտի լարումը, էլեկտրոդային բուֆերի խտությունը և ջերմաստիճանը, դոնդողում ագարոզի խտությունը և այլն:

----Rotaphor 6.0 ծրագրվող (ROFE) համակարգ FEMTO Pulse համալիր Նկ. 2.25. Պուլս-էլեկտրաֆորեզի ավտոմատացված սարքեր (https://yandex.ru/images/search?text, https://www.google.ru/search?q):

Հետազոտությունների արդյունքում պարզվել է, որ մեծ մոլեկուլները դանդաղ են վերակողմնորոշվում էլեկտրական դաշտի ուղղության փոփոխման ազդեցությամբ և դրանց հստակ բաժանման համար պետք է որոշել էլեկտրական դաշտի ազդեցության լավագույն տևողությունը՝ հաշվի առնելով մոլեկուլների չափսերը: Շատ մեծ մոլեկուլների բաժանման համար ընտրվում են ավելի երկարատև ժամկետներ, ավելի փոքր մոլեկուլների համար՝ ավելի կարճ ժամկետներ: Եթե հետազոտվող խառնուրդում առկա են տարբեր երկարությամբ մոլեկուլներ, պուլսացիայի ամեն փուլի տևողությունը կարող է հետզհետե երկարել, կամ գծային եղանակով՝ ամեն հաջորդ փուլը ավելի երկարատև է, քան նախորդը, կամ մի քանի փուլ կատարել նույն պայմաններում, ապա հաջորդ նույն թվով փուլերը ավելի երկարատև: Թորամասերի հստակ բաժանման համար մեծ նշանակություն ունի նաև ամբողջ պրոցեսի երկարատևությունը՝ պուլսերի քանակը: Ավելի երկարատև պրոցեսը կարող է նպաստել հստակ բաժանմանը:

Էլեկտրական դաշտի լարվածությունը նույնպես ազդեցիկ գործոն է: Ընդհանուր առմամբ, ինչքան ավելի բարձր է դաշտի լարվածությունը, այնքան ավելի արագ են շարժվում մոլեկուլները, բայց շատ մեծ մոլեկուլների դեպքում կապը գծային չէ: Մինչև 1 մլն զ.ն. երկարությամբ մոլեկուլների բաժանման համար օգտագործվում է 6-10 վ/սմ լարվածության դաշտ: Ավելի բարձր լարվածությունը կարող է առաջացնել չբաժանված մոլեկուլների կուտակումներ՝ շմերներ, որոնցում առանձին թորամասերը չեն բացահայտվում: Մինչև 1 մլն զ.ն. երկարություն ունեցող մոլեկուլների բաժանման համար օգտագործվում են դաշտի լարվածության ավելի ցածր ցուցանիշներ, քանի որ բարձր լարվածության դեպքում մեծ մոլեկուլները բռնվում են դոնդողի ծակոտիներում և անշարժանում: Պուլսի երկարատևությունը և էլեկտրական դաշտի լարվածությունը փոխկապված գործոններ են, և լավագույն պայմանների ընտրությունը կատարվում է հաշվի առնելով այս հանգամանքը: W=E·1,4·Tp բանաձևը նկարագրում է այս փոխկապվածության թվային պատկերը: Բանաձևում W-ն պուլս-էլեկտրաֆորեզի արդյունավետության թույլատրելի չափանիշն է, E-ն՝ էլեկտրական դաշտի լարվածությունը, Tp-ն՝ պուլսի երկարատևությունը: Ինչքան ավելի բարձր է այս կապվածության նշանակությունը, այնքան ավելի մեծ մոլեկուլներ կարող են բաժանվել: Բացահայտվել է նաև, որ մոլեկուլների բաժանման լավագույն պատկերները ստացվում են էլեկտրոդների միջև 110º-ից բարձր անկյան պայմաններում, սովորաբար կիրառվում է 120º անկյուն (նկ. 2.26): Ագարոզի խտությունը ընտրվում է 1 %-ից բարձր, քանի որ հետազոտությունները ցույց են տալիս, որ ավելի ցածր խտության պայմաններում մոլեկուլների բաժանումը հստակ չէ: 3 մլն զ.ն-ից բարձր երկարությամբ մոլեկուլների բաժանման համար ընտրվում է ագարոզի 1,0-ից 1,5 % խտություն: Պուլս-էլեկտրաֆորեզի համար օգտագործվում են բարձր իոնային ուժով բուֆերներ՝ ՏՐԻՍ ացետատային ՝ 1 %-անոց և ՏՐԻՍ բորատային՝ 0,5 %-անոց: Ջերմաստիճանի բարձրացումը արագացնում է մոլեկուլների շարժը դոնդողում, բայց իջեցնում բաժանման հստակու106

թյան աստիճանը, նպաստում շմերների առաջացմանը, այդ պատճառով էլեկտրաֆորեզի կատարման ամենաարդյունավետ ջերմաստիճանը գտնվում է 12-16º սահմաններում:

Eյ Նկ. 2.26. Էլեկտրոդների միջև հարմար 120º անկյան առաջացման սխեման (https://studfile.net/preview/2656053/, փոփոխված):

2.9.1. ԴՆԹ-ի նմուշների պատրաստում պուլս-էլեկտրաֆորեզի համար Ինչպես արդեն նշվել է, ԴՆԹ-ի մեծ մոլեկուլները հնարավոր չէ անջատել գենոմից սովորական եղանակով, քանի որ այդ մոլեկուլները գերզգայուն են շարժող ուժերի նկատմամբ և հեշտությամբ կտրտվում են մշակման պահին: Այդպիսի շեղումներից խուսափելու նպատակով մեծ ԴՆԹ-ների անջատումը կատարում են ագարոզային դոնդողի վրա: Ցածր ջերմաստիճանի պայմաններում հալվող ագարոզի լուծույթի մեջ ստանում են հետազոտվող բջիջների սուսպենզիա: Ապա ագարոզային սուսպենզիան լցնում են պլաստիկ շերտի վրա առկա խցիկների մեջ, որտեղ ագարոզը սառում է: Այսպիսի պլաստիկ ցանցային շերտերը կոչվում են ներդիր: Ներդիրները կարելի է պատրաստել ինքնուրույն կամ գնել տարբեր ֆիրմաների արտադրության ներդիրներ, օրինակ՝ Pharma-cia-LKB: Յուրաքանչյուր խցիկի ծավալը հավասար է 100 մկլ (նկ. 2.27):

... ,..,. - ,... ,,.. .-,r, r- r ,- ր- ր ,.... - .... ,...

,_,... ............ րրր-

ր,-..ր-,-- - ,_,_,_ ,ր ,... ր; ո ,.,. ,... ,- ,_ ,... -,... ,... ր ր ր .- ,.. - ,... ,...

ր. .... lՊՊՊ.,...,... ր:- :-ր- -

Նկ. 2.27. 100 խցիկներից կազմված պլաստիկ ներդիր (http://humbio.ru/humbio/01122001/ kartirovan/00015fce.htm):

Նուկլեազներից մաքրման համար աշխատանքից առաջ ներդիրները պետք է լվացվեն և չորացվեն: Ապա պլաստիկ շերտի մի կողմից հատակի ձևավորման համար ամրացվում է կպչուն թուղթ: Խցիկները պատրաստ են օգտագործման համար: Երբեմն բջջային սուսպենզիան առանձին մասնիկների բաժանելու համար կիրառում են ագարոզային հատիկների ձևավորման մեթոդը: Ագարոզային սուսպենզիան կաթիլ-կաթիլ ավելացնում են յուղային զանգվածի մեջ՝ միաժամանակ ակտիվ խառնելով լուծույթը: Առաջացող ագարոզային հատիկների չափսերը կարգավորվում են խառնելու արագության փոփոխմամբ: Այսպիսի հատիկներում գտնվող ԴՆԹ-ն հետազոտվում է լուծույթում գտնվող մոլեկուլի եղանակով: Դոնդողում անշարժացված բջիջներից ԴՆԹ-ն անջատելու համար դոնդողային մասնիկները դրվում են 2 օրով ESP լուծույթի մեջ 50 ºC պայմաններում, ապա կատարվում է բջիջների քայքայում և ԴՆԹ-ի հետ կապված սպիտակուցների ու այլ նյութերի անջատում: Մշակված ԴՆԹ-ի նմուշները կարող են պահպանվել +4 ºC պայմաններում երկար ժամանակ: Նշենք, որ ԴՆԹ-ի անջատումն այս եղանակով պահանջում է բջջաթաղանթների քայքայում, իսկ տարբեր տեսակների բջջաթաղանթները տարբեր կազմ ունեն: Այսպիսով՝ բջջաթաղանթի քայքայումը տարբեր տեսակների հետ աշխատանքի դեպքում կատարվում է տարբեր նյութերի օգտագործմամբ և տարբեր ժամկետներում: Օրինակ՝ բարդ գլիկոպրոտեիդների և բազմաշաքարների քայքայման համար օգտագործում են հատուկ ֆերմենտներ, որոնք պահպանում են

ակտիվությունը կատիոններ չպարունակող միջավայրում և կարող են ակտիվ գործել ԴՆԹ-ի ամբողջությունը պահպանող ԷԴՏՔ-ի (էթիլենդիամինտետրաքացախաթթու) լուծույթում: Սովորաբար բջիջների քայքայման համար օգտագործում են պրոտեինկինազ K ֆերմենտը և դետերգենտները: Քայքայումից հետո անհրաժեշտ է հեռացնել դոնդողից ու նմուշից օգտագործված նյութերի՝ ԷԴՏՔ-ի, պրոտեինկինազ K-ի և բջջային տարրերի մնացորդները: Մաքրված դոնդողային հատիկները կամ ներդիրի խոռոչիկներից անջատված դոնդողային մասնիկները տեղափոխվում են էլեկտրաֆորեզի համար պատրաստված դոնդողի խցիկների մեջ, և կատարում պուլս-էլեկտրաֆորեզ: Էլեկտրաֆորեզի արդյունավետությունը պայմանավորված է ԴՆԹ-ի խտությամբ նմուշում: ԴՆԹ-ի բավարար խտություն ստանալու համար անհրաժեշտ է փորձնական եղանակով կամ այն դեպքերում, երբ տեսակի գենոմի չափերը հայտնի են, բջիջների բավարար քանակի ընտրության միջոցով ապահովել դոնդողային հատիկներում գտնվող ԴՆԹ-ի անհրաժեշտ քանակ: Էուկարիոտների բջիջներից ԴՆԹ-ի անջատման համար կատարում են բջջային կուլտուրայի կամ արյան բջիջների ցենտրիֆուգում, հետազոտվող նմուշի քանակը որոշում են ելնելով այն փաստից, որ, օրինակ, մարդու ամեն բջիջ պարունակում է 6,6 պգ ԴՆԹ: Նշենք, որ ԴՆԹ-ի կառուցվածքային ամբողջության պահպանման համար բոլոր աշխատանքները պետք է կատարել մետաղ չպարունակող սարքերով, ստերիլ, նուկլեազներից մաքրված պայմաններում: Ազատ ապրող մանրէների նմուշի ձևավորման համար դրանք պարունակող խառնուրդը պետք է ցենտրիֆուգել, իսկ ներբջջային մանրէների նմուշների ստացման համար պետք է քայքայել տերբջիջները, ապա ցենտրիֆուգման կամ իոնոփոխականող քրոմատոգրաֆիայի միջոցով անջատել մանրէները: Նկարագրված մեթոդը ունի որոշ թերություններ՝ թանկարժեք է և երկարատև: Ակտիվ նյութերի շարժը դոնդողում կատարվում է շատ դանդաղ: Երկարատև է նաև քայքայումից առաջացող նյութերի

հեռացման պրոցեսը՝ ինկուբացիան PMSF բուֆերում (ֆենիլմեթիլսուլֆոնիլֆտիրիդ՝ պրոտեինկինազ K-ի ինհիբիտոր) կարող է տևել մի քանի օր: Այդ պատճառով մի շարք հեղինակներ առաջարկել են մեթոդի կատարելագործման եղանակներ: Օրինակ՝ այս կամ այն եղանակով աճեցված մանրէների բջիջները ցենտրիֆուգման եղանակով անջատում են սննդարար միջավայրից, ապա լվանում ԷԴՏՔ (10-ից մինչև 50 mM) պարունակող չեզոք pH-ով լուծույթով: Պատրաստում բջջային սուսպենզիա՝ pH=8 էքստրակցիա կատարող բուֆերում: Էքստրակցիայի բուֆերի կազմում գտնվում են քաոտրոպ աղեր (6-8 М գուանիդինքլորիդ կամ 4 М գուանիդինտիոցիոնատ), դետերգենտ (0,5 % սարկոզիլ) և երկսուլֆիդային կապերի վերականգնիչ (10-100 mM մերկապտոէտանոլ): Ընդ որում՝ բուֆերի ծավալը պետք է գերազանցի նստվածքում գտնվող բջիջների ծավալը 5-ից մինչև 10-15 անգամ, կախված թե ինչ բջիջներ են քայքայվում: Խմորասնկերի դեպքում հարաբերությունը վերցվում է 5/1, իսկ բակտերիաների դեպքում՝ 20/1: ԴՆԹ-ի անջատման համար լուծույթը ինկուբացվում է ջերմապահարանում 4-5 ժամ ԴՆԹ-ի հալման ջերմաստիճանից 5-10 աստիճանով պակաս՝ 45 ºC պայմաններում կամ ամբողջ գիշեր՝ 37 ºC պայմաններում: Հաջորդ փուլում բջիջները նորից ցենտրիֆուգվում են, ապա լվացվում թորած ջրով: Արդյունքում ստացվում են պրոտեինների համար թափանցիկ բջջաթաղանթներ, որոնցում գտնվում են սպիտակուցներից ազատված ամբողջական ԴՆԹ-ներ և որոշ քանակությամբ ՌՆԹ-ներ: Այս եղանակով ստացված նմուշները կարող են օգտագործվել պուլս-էլեկտրաֆորեզի կամ այլ հետազոտությունների համար: Եթե հետազոտության խնդիրը պուլս-էլեկտրաֆորեզի կատարումն է ԴՆԹ պարունակող բջջաթաղանթները մշակում են հալեցված դոնդողով և առաջացնում դոնդողային հատիկներ: Դոնդողային հատիկների կազմում գտնվող բջիջների թաղանթները քայքայում են հիդրոլիտիկ ֆերմենտներով (զիմոլիազ, լիզոցիմ և այլն) և դետերգենտներով (սարկոզիլ կամ SDS): Դոնդողային հատիկներում գտնվող ԴՆԹ-ն լվանում են ԷԴՏՔ պարունակող լվացող բուֆերով:

Անշարժացված և անջատված ԴՆԹ մոլեկուլների ստացման այս եղանակը կարող է օգտագործվել մակրոռեստրիկտների առաջացման համար: Էուկարիոտների մեծ քրոմոսոմների ԴՆԹ-ի հետազոտումը կատարվում է մակրոռեստրիկտների ստացման միջոցով, քանի որ հսկայական մոլեկուլների ամբողջական նմուշների բաժանումը էլեկտրաֆորեզի եղանակով հնարավոր չէ: Պուլս-էլեկտրաֆորեզի արդյունքում ստացվող ֆորեգրամների դետեկցիան կատարվում է սովորական եղանակով, բրոմէտիդիումի կամ այլ ֆլուորեսցենտ ներկանյութի օգտագործմամբ: Նշենք, որ ինչպես և էլեկտրաֆերեզի այլ եղանակների դեպքում պուլս-էլեկտրաֆորեզի ժամանակ դոնդողի վրա հետազոտվող նմուշների հետ միասին դրվում են նշադիր նմուշները: Վիրուսների և ֆագերի ԴՆԹ-ի մոլեկուլների չափսերի որոշման համար օգտագործվում են λ բակտերիաֆագի գենոմային ԴՆԹ-ի 21 տարբեր չափսի հերթականություններից կազմված նշադիր (նկ. 2.28): Պուլս-էլեկտրաֆորեզի օգտագործման ամենալայն դաշտը մանր էուկարիոտների գենոմային քարտեզների կառուցումն է: Դրանց գենոմների չափսերը համապատասխանում են մեթոդի հնարավորություններին և շնորհիվ այս մեթոդի կիրառման ստեղծվում են այդ տեսակների գենոմային գրադարաններ, հետազոտվում են արհեստական քրոմոսոմները, կատարվում է քրոմոսոմների կազմում գեների դասավորման հերթականության հետազոտությունը: Հետազոտվում են նաև ռեպլիկացիայի ստարտի և տերմինացիայի կետերի լոկալիզացիան, ռեպլիկացիայի արագությունը և այլն: Պուլս-էլեկտրաֆորեզի կիրառմամբ հետազոտվում են էուկարիոտների մեծ քրոմոսոմների ԴՆԹ-ի երկար հատվածները, բացահայտվում մեծ գեների տարրերը, դրանց դասավորությունը գենում: Կառուցվում են էուկարիոտների գենային քարտեզներ:

կ11tորազ 727.5 679.0 630.5582.0 533.5 կ85.0 կ36.5 388.0 339.5 291.02կ2.5 19կ.0 1կ5.5 97.0 կ8.5 -

Նկ. 2.28. Պուլս-էլեկտրաֆորեզի եղանակով բաժանված վիրուսային գենոմի հատվածների երկարության որոշման համար օգտագործվող λ բակտերիաֆագի գենոմի տարբեր չափսերի 15 հատվածներից կազմված նշադիր ցանքը: Նշադիրը վաճառվում է GelSyringe™ տիպի դոզատոր պիպետների ձևով: Յուրաքանչյուր պիպետ պարունակում է նշադրի 25 դոզա: Նշադրի թորամասերի բաժանման ճշգրիտ պատկերը ստացվում է 1 % ագարոզային դոնդողում 0,5 ХՏրիս բորատային բուֆերի և 4,5 վ/սմ էլեկտրական դաշտի լարվածության և 15 ºС ջերմաստիճանի պայմաններում 24 ժամ տևող պուլս-էլեկտրաֆորեզի միջոցով (www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england _biolabs/markery):

Պուլս-էլեկտրաֆորեզի մեթոդը կիրառվում է ինչպես գենոմիկայի խնդիրների լուծման՝ գենոմային քարտեզների կառուցման գործում, այնպես էլ գործնական օգտագործման բնագավառներում: Մեթոդի օգնությամբ կատարվում է հարուցիչների տարբեր շտամների գենոմների համեմատում, սելեկցիոն և ախտորոշման աշխատանքների արդյունքների գնահատում (Л.В. Миронова и др., 2015):

2.10. ՄԱԶԱՆՈԹԱՅԻՆ ԿԱՄ ԿԱՊԻԼԱՐԱՅԻՆ ԷԼԵԿՏՐԱՖՈՐԵԶ

Լիցքավորված և չեզոք մասնիկների շարժը սիլիցիումային մազանոթում էլեկտրական դաշտի ազդեցությամբ կոչվում է մազանոթային էլեկտրաֆորեզ (ՄԷ): Մազանոթային էլեկտրաֆորեզը օգտագործվում է անալիտիկ գործընթացում սկսված 1990-ական թվականներից և, ըստ էության, մազանոթային հեղուկային քրոմատոգրաֆիայի և էլեկտրաֆորեզի փոխլրացնող հետազոտական եղանակ է:

Բաժանման գործընթացը պայմանավորված է էլեկտրոօսմոտիկ հոսքի առկայությամբ առաջացող իոնների էլեկտրոֆորետիկ շարժունակության տարբերությունով: Նշենք, որ այս եղանակով բաժանվում են ինչպես փոքր՝ պարզ հանքային, այնպես էլ մեծ մոլեկուլները՝ ամինաթթուները, կարբոհիդրատները, պրոտեինները, ՆԹ-ները, օլիգոնուկլեոտիդները և այլն: Մազանոթային էլեկտրաֆորեզի մեթոդի հիմնական առավելությունը այն է, որ այն արդյունավետ է և տնտեսվարական՝ պահանջում է նմուշի փոքրագույն ծավալներ, նմուշի նախապատրաստման պարզ գործընթաց, մատչելի սարքավորումներ, ապահովում է on-line դետեկտավորման հնարավորություն և հեշտ ավտոմատացվում է: Դետեկտավորման համար հաճախ օգտագործվող լազերգրգռված ֆլուորեսցենտ դետեկտավորումը նմուշի խտացման (stacking) տարբեր մեթոդների կիրառմամբ հնարավորություն է տալիս բացահայտել նյութերի փոքրագույն խտությունները (10–16–10–21 М): Մազանոթային էլեկտրաֆորեզի կատարման համար օգտագործվող սարքի մազանոթների տրամագիծը չի գերազանցում 100 մկմ, որի շնորհիվ հաղթահարվում է կոնվեկցիան, և արդյունավետ կարգավորվում է ջերմափոխանակումը: Այս պայմաններում բարելավվում են բարդ բազմատարր նմուշների առանձին լիցքավորված թորամասերի բաժանման արդյունավետությունը և ճշգրտությունը: Հայտնի է, որ ՄԷ համար օգտագործվող մազանոթների պատերի հալեցված կվարցի մակերեսի վրա գտնվող սիլոկսանային խմբերը՝ >Si=0 ջրի ազդեցությամբ հիդրոլիզվում են՝ առաջացնելով կրկնակի քանակությամբ սիլանոլային խմբեր. նH րՏi /

Պ

.

նH Հիդրոլիզի արագությունը և աստիճանը պայմանավորված են կապիլյարում գտնվող լուծույթի ջերմաստիճանով և pH-ով, իսկ լուծույթի աղային կազմի ազդեցությունն աննշան է: Եթե pH-ը 2,5-ից բարձր է, առաջանում է սիլիցիումի բացասական լիցքավորում, որի չափը բարձրանում է pH-ի աճին զուգահեռ: pH-ի 2,5-ից ցածր

ցուցանիշների դեպքում հիդրօքսիլ խմբերի դիսոցիացիան արգելակվում է և մազանոթի պատը դառնում է չեզոք: Սիլանոլային խմբերի դիսոցիացիան առաջացնում է մազանոթի պատի հարևանությամբ իոնային երկշերտ՝ կրկնակի էլեկտրական շերտ՝ ԿԷՇ (նկ. 2.29): C

Շ.

,5Ը :ե2Պ ..:ր -::ր E -::ր

E-

- ., 1 t

C Շ ' ~ §' :J ::, -:,- <O

~ a!.Է? Շ. -:,ն0

.E E "' ,.Ը:. E'Տ- Ը §_

s

:, ~

Շ.

Ը:, Շ. T.>

ՇT

J

ր-,

I

•i' \.~ 2I

\

.... ... .,

\_.. 1

~

\

•

~

·~Պ', , ., I •~

\

I: , -., \. ' ""., I ~ \ I: \

~

I

\' I

,'

.'.'I

I \

I \.' ~ I

\_' '

Ո.'

\_

I , ..,

,ՊI .,

\

,,.,,.,,. itՊՊ .Zաl'lct 2t-l'IՄ'I

Նկ. 2.29. Կրկնակի էլեկտրական շերտի՝ ԿԷՇ-ի կազմության սխեման (http://mylektsii.ru/3-2422.html):

ԿԷՇ-ի առաջին շերտը կազմված է բացասական լիցք ունեցող անշարժ սիլանոլային խմբերից, իսկ երկրորդ շերտը կազմում են ջրային միջավայրի կատիոնները: Այսպիսի բաժանումը շերտերի պայմանավորված է ջրի ունակությամբ առաջացնել անիոններ և կատիոններ: Կատիոնային շերտն իր հերթին կազմված է անշարժ և շարժուն ենթաշերտերից: ՄԷ սարքում մազանոթի ծայրերը դրվում են նույն էլեկտրոդային բուֆեր պարունակող անոթների մեջ: Էլեկտրոդների վրա բարձր լարվածության միացումը առաջացնում է արագ կարգավորվող էլեկտրաօսմոտիկ պրոցես՝ ԷՕՊ, որը զուգակցվում է կատիոնների և անիոնների հակառակ ուղղված միգրացիայի հետ: Եթե նմուշի փոքր ծավալ ներմուծվի մազանոթի մեջ անոդի հարևանությամբ, դրա տարրերը ԷՕՊ-ի ազդեցությամբ կշարժվեն դեպի կատոդ: Նմուշի կազմի տարրերի շարժման արագությունը համամասնային է դրանց լիցքի չափին: Կատիոնային տարրերի արագությունը կլինի հավասար մասնիկների լիցքի և ԷՕՊ-ի ազդեցության արդյունքում առաջացող գումարային արագությանը: Անիոնների սեփական հակառակ ուղղված շարժման արագությունը կնվազեցվի ԷՕՊ-ի ազդեցությամբ և վերջնական ձևավորվող արագությունը կնվազի մասնիկների լիցքին համապատասխանող չափով:

ա

-

l«նU'նiո&րՃ.ր

-

2~q11jոll'աՔ(tր

-

ննր1ոնր.!iր

'lեlllեկuոր

Նկ. 2.30. ա - Կապիլյարում իոնների էլեկտրաֆորետիկ միգրացիայի սխեման: բ - Տարբեր լիցք ունեցող մասնիկների դասավորությունը կատոդի գոտում պրոցեսի ավարտին (https://theslide.ru/uncategorized/kapillyarnyy-elektroforez-ielektrohromatografiyaanaliticheskiy-tsentr-himicheskogo-1):

Չեզոք տարրերը կշարժվեն ԷՕՊ-ի ազդեցությամբ դրանց զանգվածների ազդեցությանը համապատասխան: Սկզբում կատոդին կհասնեն դրական լիցքավորված փոքր չափսի մասնիկները, ապա չեզոք և վերջում բացասական լիցքով մասնիկները (նկ. 2.30): Եթե մազանոթում գտնվելու ժամկետները բավարար են, և մինչև կատոդին հասնելը նմուշի տարրերը հասցնում են հստակ բաժանվել առանձին թորամասերի, լուծույթում կատոդի հարևանությամբ կառաջանան տարբեր նյութերով կազմված գոտիներ: Պրոցեսի տևողությունը կարգավորվում է էլեկտրական դաշտի լարվածության, էլեկտրոլիտի pH-ի և խտության փոփոխման եղանակով: Եթե բացասական լիցքավորված մասնիկների էլեկտրոմիգրացիայի արագությունը ավելի բարձր է, քան ԷՕՊ-ի ազդեցությամբ առաջացող արագությունը, դրանք դուրս կգան կապիլյարի անոդի գոտում: 2.10.1. Գոտային մազանոթային էլեկտրաֆորեզի համալիրի կազմությունը Մազանոթային էլեկտրաֆորեզը հիմնականում կատարվում է երկու եղանակներով. 1. Գոտային մազանոթային էլեկտրաֆորեզ: 2. Միցելյարային էլեկտրակինետիկական քրոմատոգրաֆիա:

Գոտային մազանոթային էլեկտրաֆորեզ Մազանոթային էլեկտրաֆորեզի համար օգտագործվում են հիմնական և հավելյալ սարքերից կազմված հատուկ համալիրներ: Համալիրը կազմված է սիլիցիումի մազանոթից, էլեկտրոլիտ պարունակող անոթներից, էլեկտրոդներից, էլեկտրական լարվածության աղբյուրից, նմուշի ներմուծման սարքից, դետեկտորից, ինֆորմացիայի կուտակման և վերլուծման սարքերից: Համալիրի կազմ կարող են ավելացվել նմուշները ավտոմատ եղանակով ներմուծող և հեղուկների ջերմաստիճանը կարգավորող սարքեր (նկ. 2.31): Համալիրի մազանոթները պատրաստվում են բարձր մաքրության սիլիցիումից, թափանցիկ են ՈՒՄ ճառագայթների համար և պատված են պաշտպանիչ պոլիիմիդային շերտով: 9.t:.11uաtկահա11աu 5կյա1ut:.110 ~ tiEUորt Uարl E '1եU1եl.jU1ո րl /

աU1ո11ոկ րո ~ . 1ո6ոյրa

Նկ. 2.31. Մազանոթային էլեկտրաֆորեզի սարքի կազմության սխեման (Д.В. Зипаев, А.А. Тулина, А.Н. Кожухова):

Մազանոթի ներքին տրամագիծը տատանվում է 50-75 մկմ սահմաններում, արտաքինը՝ 365 մկմ, երկարությունը՝ 20-100 սմ: Հետազոտություններում սովորաբար օգտագործում են ներքին մակերեսի վրա պաշտպանիչ շերտ չունեցող մազանոթներ: Փորձից առաջ բոլոր հնա116

րավոր մնացորդային նյութերի հեռացման համար մազանոթը լվացվում է թթուներով, ջրով, հիմքերով, ապա նորից թորած ջրով: Էլեկտրական հոսանքի սարքը պետք է երկար ժամանակ պահպանի 20-25 կՎ լարվածություն և ապահովի մազանոթում էլեկտրական հոսանքի կայուն 200 մկА ուժը: Ներմուծվող նմուշի քանակը պետք է կազմի մազանոթի ծավալի մոտ 2 % և լինի 1-20 նլ: Մազանոթային էլեկտրաֆորեզի արդյունքների դետեկցիան կատարվում է տարբեր եղանակներով՝ ֆոտոմետրիկ, ֆլուորոմետրիկ, մաս-սպեկտրամետրիկ, ռադիոմետրիկ և այլն: Էլեկտրաֆորեզի արդյունավետությունը պայմանավորված է էլեկտրոլիտի խտությամբ, կազմով և pH-ով: pH-ի ցուցանիշները կարգավորում են ինչպես թորամասերի շարժի արագությունը, այնպես էլ դրանց տարածական կազմակերպվածությունը: Տարբեր դեպքերում օգտագործվող բուֆերների pH-ի ցուցանիշները տատանվում են 2-ից մինչև 12: Ամենահաճախ օգտագործվող բուֆերներն են ՏՐԻՍ-ը և Բորատայինը, որոնք բարձր խտությունների դեպքում չեն առաջացնում հոսանքի ուժի զգալի ավելացում և դրանով իսկ թույլ են տալիս փոփոխել դաշտի լարվածությունը լայն սահմաններում: Էլեկտրաֆորեզի արդյունավետության բարձրացումը կարգավորվում է բուֆերի պարամետրերի և էլեկտրական դաշտի լարվածության փոփոխություններով, բուֆերի կազմ որոշակի լրացուցիչ գործոններ ավելացնելով և մազանոթի երկարությունը կարգավորելու եղանակով: Այն դեպքերում, երբ թորամասերի բացասական լիցքը բարձր է, անհրաժեշտ է ավելացնել պրոցեսի տևողությունը, որպեսզի արագ շարժվող թորամասերի միջև հասցնի առաջանա բաժանող շերտ, և թորամասերի բաժանումը լինի հստակ:

2.10.2. Մազանոթային էլեկտրաֆորեզի դետեկցիայի եղանակները Մազանոթային էլեկտրաֆորեզի դետեկցիան կարող է կատարվել ինչպես մազանոթի ելքի ծայրում (on-capillary) ռեալ թայմ ռեժիմում, այնպես էլ անմիջապես ելքի կետում (end-capillary): Որոշ դեպքերում դետեկցիան կատարվում է մազանոթից դուրս (off-capillary), մասսսպեկտրոմետրի օգտագործմամբ: Դետեկցիայի համար կիրառվում է ֆոտոմետրիկ հետազոտություն ՈՒՄ կամ սովորական լուսավորման պայմաններում, ֆլուորոմետրիկ, մասս-սպեկտրոմետրիկ, կոնդուկտոմետրիկ, ռադիոմետրիկ և այլն: Արտադրվող դետեկտորների մեծ մասը ֆոտոմետրիկ են: ՆԹ-ների և սպիտակուցների դետեկցիայի համար սովորաբար օգտագործվում է կամ ուղղակի ֆոտոմետրիկ, կամ լազերային ֆլուորեսցենտ դետեկցիա: Դետեկցիայի արդյունքները համակարգչային մշակումից հետո ներկայացվում են գրաֆիկ պատկերի ձևով՝ որպես ամեն առանձին նյութի որակը և քանակը բնութագրող գագաթներ: Նյութի ինչ լինելը՝ որակը, որոշվում է թորամասի դետեկցիայի կետին հասնելու համար անհրաժեշտ ժամանակով: Այսպիսի վերլուծությունը կատարվում է նախապես՝ բոլոր հետազոտվող նյութերի համար կառուցված ստուգիչ գրաֆիկների օգտագործմամբ՝ հետազոտման թիրախ նյութերի հայտնի քանակներ պարունակող նմուշը ենթարկվում է էլեկտրաֆորեզի նույն պայմաններում և գրանցվում է դրանց ելքի ժամանակը: Նյութի քանակությունը նմուշում որոշվում է կառուցված գրաֆիկների վրա առկա գագաթների հիմքի լայնությամբ: Ապա ստուգիչ և հետազոտվող նմուշների գրաֆիկ պատկերների համեմատման եղանակով որոշվում է հետազոտվող նյութերի առկայությունը և խտությունը: Ստացված արդյունքներով գրաֆիկների կառուցումը և դետեկցիան կատարում են հատուկ համակարգչային ծրագրերով: Մազանոթային էլեկտրաֆորեզի օգտագործման կարևոր բնագավառը ջրի և հողի մաքրության որոշումն է, դրանց կազմում հանքային աղերի կազմի և քանակի հետազոտությունը (նկ. 2.32): Մազանոթային էլեկտրաֆորեզը լայնորեն կիրառվում է

սննդամթերքի և խմիչքի կազմում կատիոնների, անիոնների, կոնսերվանտների, վիտամինների, անտիօքսիդանտների, ներկանյութերի և այլ տարրերի բացահայտման համար:

ո Նկ. 2.32. Անիոնների առկայության և խտության որոշումը ծորակի ջրում՝ ՄԷ եղանակով.

մ

գոնն •

Ա - ստուգիչ գրաֆիկի կառուցման համար պատրաստված նմուշը պարունակում է 2 մգ/դմ3 հետազոտվող նյութեր՝ 1 - քլորիդ, 2 - նիտրիտ, 3 - սուլֆատ, 4 - նիտրատ, 5 - ֆտորիդ, 6 - հիդրոֆոսֆատ, 7 - հիդրոկարբոնատ: Բ - ծորակի ջրի աղերի գրաֆիկ. հետազոտվող ջուրը պարունակում է մեծ քանակությամբ նիտրիտ, քլորիդ և ֆտորիդ (http://www.chem.msu.su/ rus/teaching/analyt/chrom/part3.pdf):

Մազանոթային էլեկտրաֆորեզը կիրառվում է նաև բժշկաբանությունում՝ դեղամիջոցների կազմի և մաքրության աստիճանի, օրգանիզմների արյան և այլ հեղուկների կազմում իոնների, ամինաթթուների, ամինների և պեպտիդների ախտորոշման համար: Դատական պրակտիկայում մազանոթային էլեկտրաֆորեզը օգտագործվում է թմրանյութերի և պայթունավտանգ նյութերի բացահայտման համար: Քիմիական արդյունաբերությունում ՄԷ-ն օգտագործվում է արտադրվող նյութերի կազմի և մաքրության վերահսկման փուլում: Մազանոթային էլեկտրաֆորեզի համար այժմ արտադրվում են ավտոմատ սարքեր: Օրինակ՝ QIAxcelAdvanced համակարգը կատարում է մեկ քարտրիջի վրա միավորված 12 նմուշների թեստավորում 3 րոպեում: Նուկլեինաթթուների թեստավորումը կատարվում է սկսած 0,1 նգ/մկլ խտությունից նմուշում, բացահայտելով ԴՆԹ-ի հատված119

ների միջև 3-5 զ.ն. տարբերությունները: QIAxcelAdvanced համալիրը համալրված է հետազոտման համար անհրաժեշտ բոլոր գործիքներով և ծրագրերով:

Նկ. 2.33. Մազանոթային էլեկտրաֆորեզի կատարման ավտոմատ համալիրներ (www.interlabservice, http://medstom-nn.ru/sistema-kapillyarnogoelektroforeza-minicap/):

Sebia կազմակերպությունը արտադրում է մազանոթային էլեկտրաֆորեզի Minicap տիպի ավտոմատացված համալիրներ: Ինչպես և QIAxcel Advanced (նկ. 2.33.1), այնպես էլ Minicap համալիրի դեպքում (նկ. 2.33.2) ավտոմատացված են նմուշների նախապատրաստման, էլեկտրաֆորեզի կատարման, դետեկցիայի և արդյունքների վերլուծության պրոցեսները: Ներկայացվող սարքերն ապահովում են հետաքննությունների կատարման բարձրագույն հստակություն և ճշգրտություն, հարմար են օգտագործման համար: Վերջին տարիներին մշակվել են նաև մազանոթային էլեկտրաֆորեզի միկրոչիպային տեխնոլոգիաներ: 2.10.3. Մազանոթային էլեկտրաֆորեզի հիմնական տեսակները Էլեկտրաֆորեզի մազանոթային եղանակի հիմնական տարատեսակներն են մազանոթային գոտային էլեկտրաֆորեզը և միցելյարային էլեկտրոկինետիկական քրոմատոգրաֆիան: ՄԷ-ի ամենահաճախ կիրառվող եղանակը մազանոթային գոտային էլեկտրաֆորեզն է (ՄԳԷ): Սիլիցիումի մազանոթով սարքերի մեջ նմուշները ներմուծվում են սովորաբար դրական էլեկտրոդի ծայրից՝ անոդից, և ԷՕՊ-ի ազդեցությամբ շարժվում են դեպի կատոդ, որտեղ գտնվում է դետեկտորը:

Կատիոնները առաջին հերթին են հասնում կատոդ, առաջացնելով մի քանի գոտիներ, որոնք և գրանցում է դետեկտորը էլեկտրաֆորեգրամի վրա առանձին գագաթների ձևով: Չեզոք տարրերը կարող են չկլանել ֆլուորեսցենտ ազդակ, և այս դեպքում ֆորեգրամի վրա գագաթ չի ձևավորվում՝ մնում է ուղիղ գիծ, կամ նույնիսկ հակառակ գագաթ: Այդպիսի գագաթը կոչվում է համալիրային (նկ. 2.30բ): Երբեմն այս նյութերի դետեկցիայի համար բուֆերի կազմ ավելացվում են նշադրային նյութեր, օրինակ՝ բենզիլային սպիրտ: Մազանոթային էլեկտրաֆորեզի այս եղանակը օգտագործվում է հիմնականում նմուշների կատիոնային տարրերի և օրգանական թթուների բաժանման համար: Անիոնների սեփական հակառակ շարժը հաղթահարելու համար փոխարինում են էլեկտրոդների տեղերը և մազանոթի ներքին մակերեսը մշակում են ցետիլերեքմեթիլամոնիումի բրոմիդով՝ ՑԵԱԲ: ՑԵԱԲ-ը ազդեցությամբ սիլիցիումային մակերեսին կից ձևավորվող երկշերտի իոնների նշանը փոխվում է հակառակին՝ առաջացնելով խոզանակաձև, կատիոններով պատված մակերես: Արդյունքում դիֆուզ շերտը դառնում է բացասական և անիոնները շարժվում են մուտքից դեպի ելքի ծայրը և ենթարկվում դետեկցիայի: Թորամասերի բաժանման հստակության բարձրացման համար բուֆերի կազմ կարող են ներմուծվել օրգանական լուծույթներ և մակերեսը մշակող նյութեր: Մեթոդի հիմնական թերությունը այն է, որ այս տեսակի ՄԷ-ի դեպքում արդյունավետ բաժանվում են միայն լիցքավորված տարրերը, չեզոք նյութերը շարժվում են ԷՕՊ-ով ձևավորվող նույն արագությամբ և դուրս են գալիս մազանոթից նշադրի հետ միասին: Միցելային էլեկտրոկինետիկ քրոմատոգրաֆիան օգտագործվում է հիմնականում չեզոք տարրերի բաժանման համար: Այս դեպքում բուֆերի կազմ են ներմուծվում միցելիում առաջացնող նյութեր, օրինակ՝ նատրիումի դոդեսուլֆատ՝ ԴԴՍՆ (SDS): Նյութի 8 мМ-ից բարձր խտությունը ապահովում է միցելիումի ձևավորում, որը, միանալով մազանոթի մակերեսին, առաջացնում է բացասական լիցքավորում (նկ. 2.34): Միցելիումի մակերեսի վրա ձևավորվում է ջրային

կատիոնների շերտ, և միցելիումի ընդհանուր բացասական լիցքը թուլանում է: Միցելիումի մոնոմերները մնում են լուծույթում:

~

t1եljl11[1ոoննոlll~'-l հոնQ

նtoՀր ն±) Նկ 2.34. Միցելային էլեկտրոկինետիկ պատկերի ձևավորման սխեման: Բացատրությունը բերվում է տեքստում (http://mylektsii.ru/3-2422.html):

Էլեկտրական դաշտի ազդեցությամբ միցելիումի դրական կատիոններով պատված մազիկերի հետ չեզոք տարրերը շարժվում են դեպի կատոդ և ենթարկվում դետեկցիայի: Անիոնները շարժվում են նույն ուղղությամբ, բայց ավելի դանդաղ, և դետեկցիան կատարվում է չեզոք մասնիկներից հետո:

2.11. ԵՐԿՉԱՓ ԷԼԵԿՏՐԱՖՈՐԵԶ

Շատ հաճախ նույն մոլեկուլային զանգված կամ էլեկտրական լիցք, կամ երկրորդային կազմություն և կառուցվածք ունեցող ԴՆԹ-ի տարբեր հատվածները կամ տարբեր սպիտակուցների մոլեկուլները սովորական էլեկտրաֆորեզի եղանակով չեն բաժանվում թորամասերի՝ մնում են ֆորեգրամի վրա նույն թորամասի կազմում: Այդ երևույթի պատճառ կարող են լինել ինչպես դրանց կազմակառուցվածքային նմանությունները, այնպես էլ ԷՖ-ի համար ընտրված պայմանները՝ բուֆերների pH-ի ցուցանիշը, էլեկտրական դաշտի ուժը կամ դոնդողի խտությունը: Այդպիսի չբաժանման վրիպումները հաղթահարելու նպատակով էլեկտրաֆորեզի առաջին պրոցեսի ավարտից հետո ստացված թորամասերը առանց ներկման և ֆիքսացիայի փուլերի անմիջապես ենթարկվում են երկրորդ էլեկտրաֆորետիկ բաժանման, բայց այլ պայմաններում: Հատուկ դեպքերում այս գործողությունը կատարվում է բոլոր ստացված թորամասերի միատարրության ստուգման համար:

Բաժանումները համարակալվում եմ և անվանվում՝ բաժանում 1-ին և բաժանում 2-րդ ուղղությամբ: Առաջին բաժանումը կարող է կատարվել կամ խողովակում, կամ դոնդողային շերտի վրա: Խողովակից անջատված կամ շերտային դոնդողից կտրված և թորամասեր պարունակող դոնդողային ժապավենը ուղիղ անկյան տակ դրվում է երկրորդ բաժանման համար պատրաստ դոնդողի մեկնարկի գծի վրա: Երկրորդ բաժանման հաջող ընթացքը ապահովելու նպատակով ներդրված դոնդողային ժապավենը միացվում է նոր դոնդողի շերտին հալեցված դոնդողով և թրջվում բուֆերով (նկ. 2.35): Նշենք, որ, հաշվի առնելով նմուշների առանձնահատկությունները, երկրորդ բաժանման համար ընտրվում են այլ pH-ով բուֆեր, այլ խտության դոնդող կամ էլեկտրական դաշտի լարվածության այլ ցուցանիշներ: Պայմանների փոփոխությունը կատարվում է բաժանվող թորամասերում առկա նյութերի առանձնահատկություններին համապատասխան: Էլեկտրաֆորեզի առաջին փուլում բաժանումը սովորաբար կատարվում է մոլեկուլների էլեկտրական լիցքի, իսկ երկրորդ փուլում՝ մոլեկուլների չափսերի և կազմակերպման տարբերությունների համաձայն: 1-ին բաժանման գործոնին համապատասխան օգտագործվում է մեծ խորշերով դոնդող, որում մոլեկուլների չափսերը չեն ազդում շարժի արագության վրա, բաժանումը կատարվում է մոլեկուլների լիցքի տարբերությունների համաձայն, օգտագործելով իզոէլեկտրական ֆոկուսավորման մեթոդը՝ ԻԷՖ, իսկ երկրորդ փուլում բաժանումը կատարվում է շարժի արագության վրա մոլեկուլների զանգվածի և կազմության տարբերությունների ազդեցությամբ՝ փոքր խորշերով դոնդողում: Եթե նույն թորամասում գտնվող մոլեկուլները նոր պայմաններում շարժվում են տարբեր արագությամբ, կատարվում է 1-ին բաժանումից ստացված թորամասի տարրերի բաժանում (նկ. 2.35): Երկրորդ բաժանման համար օգտագործվող առաջին ֆորեզի դոնդողը չեն մշակում՝ չեն ներկում և ֆիքսում: Ինչպես ցույց տվեց Ռայմոնդը (S. Raymond, L. Weintraub), բաժանման երկրորդ փուլում լավագույն արդյունքների ստացման համար անհրաժեշտ է փոփոխել

ինչպես դոնդողի խտությունը, այնպես էլ օգտագործվող բուֆերի pH-ը: Երկրորդ բաժանումից ստացված ֆորեգրամի ներկելուց հետո դրա ամբողջ մակերեսի վրա դիտվում են առանձին կետեր: Կետերի քանակը որոշ դեպքերում, օրինակ՝ բջջի կամ արյան շիճուկի սպիտակուցների կազմի հետազոտման փորձում, կարող է հասնել մի քանի հազարի:

I ])յ ] յ ] յյ I

.__. t,զոր1tկtորական ~ոկո,uաljորո,~

1'1tl> ti11tuորu~ հաflրոLրյո~

5Ծ5

ՊlUU զոնզոզայ~~ հtljlllրա~որtզ

·Բաժա~ո~--. l~gոոlf

Նկ. 2.35. Երկչափ էլեկտրաֆորեզի սխեման (https://present5.com/elektroforezperemeshhenie-zaryazhennyx-molekul-pod-dejstviem-elektricheskogo/):

Երկչափ էլեկտրաֆորեզի բարելավման համար իզոէլեկտրական ֆոկուսավորումը համադրվում է ՊԱԱԴ-ի մեջ էլեկտրաֆորեզի տարբեր տեսակների հետ: Լաբորատոր հետազոտություններում հաճախ կիրառում են երկչափ էլեկտրաֆորեզի մի քանի տարբերակ. 1. Երկչափ էլեկտրաֆորեզ՝ առանց pH-ի փոփոխման: 2. Երկչափ էլեկտրաֆորեզ՝ pH-ի փոփոխմամբ: 3. Դիսկ-էլեկտրաֆորեզ՝ հաջորդվող ՊԱԱԴ էլեկտրաֆորեզով: 4. Բաժանում իզոէլեկտրական ֆոկուսավորումով, որին հաջորդում է ՊԱԱԴ-էլեկտրաֆորեզը: 5. Բաժանում իզոէլեկտրական ֆոկուսավորումով, որին հաջորդում է SDS-էլեկտրաֆորեզը:

2.11.1. Երկչափ էլեկտրաֆորեզի տարատեսակները Առանց pH-ի փոփոխման երկչափ էլեկտրաֆորեզ կատարել են Ի. Մարգոլիսը և Կ. Կենրիկը (https://ya.ru/images/search?from= tabbar&text): Առաջին բաժանման համար, հիմնվելով մոլեկուլային ցանցի էֆեկտի վրա, օգտագործվել է 2,7 %-անոց դոնդող, երկրորդ փուլի բաժանումը կատարվել է խտության 4 %-անոցից մինչև 20 %անոց խտությամբ գրադիենտների վրա բաժանված դոնդողում: Առաջին ֆորեզի պայմանները բարելավել են խիտ դոնդողներում դժվար բաժանվող մեծ մոլեկուլային զանգվածով տարրերի բաժանումը: Երկրորդ՝ խտության գրադիենտների հետզհետե աճով պատրաստված դոնդողում կատարվող էլեկտրաֆորեզի պայմանները բարելավել են մոլեկուլային զանգվածի փոքր տարբերություններով տարրերի բաժանումը: Այս եղանակով հաջողվել է արյան շիճուկում անջատել սպիտակուցների 100-ից ավելի թորամասեր: Նշենք, որ երկչափ էլեկտրաֆորեզի այս տարբերակում առաջին փուլը կատարվում է խողովակային էլեկտրաֆորեզի եղանակով, իսկ երկրորդը շերտային դոնդողի վրա (նկ. 2.35): Առաջին դոնդողի բաժանված թորամասերը պահպանելու համար դոնդողների միջև առաջացած ճեղքի մեջ ավելացվում է հեղուկ դոնդող: Այս եղանակով դոնդողները միանում են, և թորամասերը չեն լուծվում ճեղքի բուֆերում: Դոնդողների միջև ճեղքի առաջացումից խուսափելու նպատակով կարելի է 1-ին բաժանումից ստացված դոնդողը տեղադրել երկրորդ բաժանման համար պատրաստվող դոնդողի ամանի մեջ, ապա ավելացնել հեղուկ դոնդող, որի արագ սառեցման համար օգտագործվում է ֆոտոպոլիմերացման եղանակը: Եթե 2-րդ բաժանման համար օգտագործվի ագարոզային դոնդող, դրա արագ պոլիմերիզացման շնորհիվ թորամասերի դիֆուզիայի հնարավորությունը խիստ կսահմանափակվի, և կստացվի ավելի ճշգրիտ բաժանում: Վեյլը առաջարկեց մեկ այլ մեթոդ, որի դեպքում երկմեր էլեկտրաֆորեզը կատարվում է նույն դոնդողի վրա, բայց օգտագործվող

դոնդողը պատրաստվում է սիգմոիդաձև բաշխված գրադիենտներով: Այս նպատակով օգտագործվում է քառակուսի խցիկ, որի անկյուններից մեկում ներմուծվում է դոնդողը, իսկ մյուսում՝ նմուշը: Ապա կատարվում է էլեկտրաֆորեզի երկու փուլ՝ սկզբում 1-ին և ապա 2-րդ ուղղություններով (նկ. 2.36): pH-ի փոփոխման եղանակով երկչափ էլեկտրաֆորեզը կատարում են էլեկտրաֆորեզի երկու հետևյալ տեսակների օգտագործմամբ՝ նախ խողովակային էլեկտրաֆորեզ, ապա դոնդողը անջատում են խողովակից և pH-ի փոփոխման նպատակով մի քանի ժամով դնում նոր բուֆերի մեջ: Սակայն այս եղանակով բուֆերի pH-ի փոփոխումը երկարատև է և կարող է առաջացնել հետազոտվող նմուշների արտահանում դոնդողից:

ր

Նկ. 2.36. Երկու՝ Ա հորիզոնական և Բ ուղղահայաց ուղղություններով էլեկտրաֆորեզի կատարման համար օգտագործվող սարքերի կառուցվածքի սխեման (http://www.ibmc.msk.ru/content/Education/w-o_pass/MMoB/4.pdf):

Նշված թերությունները հաղթահարում են հիմնային բուֆերով հագեցած դոնդողը աղաթթվի գոլորշու մեջ տեղափոխելու միջոցով. մի քանի րոպեում pH-ը փոփոխվում է, և կարելի է անցնել էլեկտրաֆորեզի երկրորդ փուլին: Մեթոդի արդյունավետությունը կարող է բարելավվել դոնդողի խտության բարձրացման եղանակով: Այս մեթոդը կիրառվել է ռիբոսոմային սպիտակուցների բաժանման համար (Mets, Bogorad, 1974, http://mewo.ru/tumb/23/266/):

2.12. ԴԻՍԿ-ԷԼԵԿՏՐԱՖՈՐԵԶ ԵՎ ՀԱՋՈՐԴՈՂ SDS ՊԱՐՈՒՆԱԿՈՂ

ՊԱԱԴ ԷԼԵԿՏՐԱՖՈՐԵԶ

Այս եղանակը շատ արդյունավետ է, եթե առաջին փուլի բաժանումը կատարվում է խողովակում ցածր խտությամբ դոնդողում, օգտագործելով նմուշում առկա բոլոր մոլեկուլների համար հարմար բուֆերում: Բացի դրանից՝ այս եղանակով բաժանված մոլեկուլների զանգվածը կարող է անմիջապես որոշվել էլեկտրաֆորեզի արդյունքներով, քանի որ SDS պարունակող դոնդողում մոլեկուլների շարժման արագությունը պայմանավորված է միայն դրանց չափսերով (նկ. 2.37): Առաջին փուլից հետո անհրաժեշտ է հավասարակշռել երկրորդ բաժանման համար օգտագործվող բուֆերը դոնդողում գտնվող առաջին բուֆերի հետ և անմիջապես կատարել երկրորդ բաժանումը դոնդողի շերտում: Երկրորդ բաժանումը կարելի է կատարել խտության տարբեր գրադիենտներով դոնդողում: Մերցը և Բոգորադը առաջարկեցին երկրորդ բաժանման համար պահպանել նույն բուֆերը, որը այս դեպքում կարող է լինել խտացնող և երկրորդ ուղղությամբ կատարվող բաժանման փուլում: Այս դեպքում վերևի բուֆերային անոթ է ավելացվում SDS, որը էլեկտրական դաշտի ազդեցությամբ անցնում է դոնդողի մեջ և կապվում նմուշի բաժանված մոլեկուլների հետ: Երկրորդ բաժանումը կարող է կատարվել նաև ՊԱԱԴ-ի խտության փոփոխվող գրադիենտների վրա SDS-ի առկայությամբ: Դոնդողի խտության գրադիենտների օգտագործումը նպաստում է մոլեկուլային զանգվածի մեծ տարբերություններ ունեցող մոլեկուլների հստակ բաժանմանը: Այս մեթոդը կիրառվել է ռիբոսոմային սպիտակուցների բաժանման համար (Mets, Bogorad, 1974, http://mewo.ru/tumb/23/266/): Իզոէլեկտրական ֆոկուսավորում հաջորդող SDS պարունակող ՊԱԱԴ էլեկտրաֆորեզով: Այս մեթոդի կիրառման դեպքում երկրորդ բաժանումը կարող է կատարվել օսլայի դոնդողում: 1975 թ. Օ՛ Ֆարելը այս մեթոդով կատարեց E. сoli-ի ռադիոակտիվ նշված սպիտակուցների բաժանում: Բաժանման առաջին փուլում հեղինակը կիրառեց իզոէլեկտրական ֆոկուսավորում, երկրորդ փուլում՝ սանդղա127

կային էլեկտրաֆորեզ SDS առկայությամբ՝ օգտագործելով խտության աճող գրադիենտներով դոնդող: Բաժանման ավարտից հետո դոնդողի շերտի վրա բացահայտվեց 1100 ռադիոակտիվ նիշ: Շ:>Շ:> Շ:>Շ:> Շ:> Շ:> I

Uա~րո~ո1ե~ո1~երt,

,j, t Qնtորա կցt,ա pH

'

. +

Նկ. 2.37. Երկմեր էլեկտրաֆորեզ SDS պարունակող ՊԱԱԴ-ի օգտագործմամբ. 1 - իզոէլեկտրական ֆոկուսավորում հաջորդող SDS պարունակող ՊԱԱԴ էլեկտրաֆորեզի սխեման, 2 - E. сoli-ի ռադիոակտիվ նշված սպիտակուցների բաժանման ռադիոակտիվ նիշերի պատկերը (https://ya.ru/images/search?from=tabbar&text ):

Կենրիկը և Մարգոլիսը կատարեցին արյան շիճուկի սպիտակուցների բաժանում երկմեր էլեկտրաֆորեզի եղանակով՝ օգտագործելով առաջին փուլում իզոէլեկտրական ֆոկուսավորում իսկ երկրորդում՝ բաժանում դոնդողի խտությամբ փոփոխվող գրադիենտում: Առաջին բաժանման ժամանակ բուֆերի pH-ը գտնվում էր 3-10 սահմաններում, երկրորդ բաժանման ժամանակ՝ 4,5-26 % սահմաններում: Այսպիսի երկու հաջորդական պրոցեսների համադրումը թույլ տվեց բաժանել սպիտակուցները նախ դրանց էլեկտրական լիցքին, ապա մոլեկուլային զանգվածին համապատասխան: Արդյունքում էլեկտրաֆորեզի ավարտից հետո ամեն մի մոլեկուլի համար բացահայտվեց ինչպես դրա լիցքը, այնպես էլ մոլեկուլային զանգվածը:

2.13. ՄԱԿՐՈՄՈԼԵԿՈՒԼՆԵՐԻ ԲԱԺԱՆՈՒՄԸ ԹՈՐԱՄԱՍԵՐԻ

ԵՐԿՈՒ ՖԻԶԻԿԱՔԻՄԻԱԿԱՆ ՀԱՏԿԱՆԻՇՆԵՐՈՎ

ԵՐԿՄԵՐ ԷԼԵԿՏՐԱՖՈՐԵԶԻ ԵՂԱՆԱԿՈՎ

Այսօրինակ էլեկտրաֆորեզի առաջին փուլում կատարվում է մակրոմոլեկուլների իզոէլեկտրական ֆոկուսավորում: Իզոէլեկտրական ֆոկուսավորումը կատարվում է pH-ի գրադիենտներում: Այսինքն՝ իզոէլեկտրական ֆոկուսավորման ժամանակ ստեղծվում են պայմաններ, որոնցում յուրաքանչյուր մոլեկուլ տեղափոխվում է իրեն համապատասխանող pl՝ իզոէլեկտրական կետ, որտեղ մոլեկուլի լիցքը հավասարվում է 0-ի: Հասնելով pl կետին մոլեկուլները՝ դադարում են շարժվել և կուտակվում են այդ կետում: Այսպիսով կատարվում է մոլեկուլների բաժանումը առաջին հատկանիշի՝ լիցքի համաձայն (նկ. 2.38): Փորձի համար անհրաժեշտ է ձևավորել դոնդող, որի որոշակի հատվածներում ֆիքսվում են pH-ի գրադիենտները: pH-ի ֆիքսված գրադիենտները ստացվում են դոնդողի ակրիլամիդի մոնոմերների ու ամինային և կարբօքսիլ խմբեր կրող ածանցյալների համապոլիմերիզացման միջոցով: Հատուկ սարքում պատրաստվում է pH-ի ֆիքսված գրադիենտներով դոնդող, ապա այն կտրտվում է բարակ ժապավենների և դրանցում կատարվում է էլեկտրաֆորեզ (նկ. 2.39): U~titI1ակոgCյե11ti uո1եկոզCյե11ti tյզոt1եկllll1tiկակաCյ :Pոկոuակո11ոu

Ը:.. .i;,

Է8

.i;,

* յ• .i=_, կ

e3 Ը:..

ցwan րH

+_

er օ

+ I

Է8

j,

ՊT 10 I թ.

.. T

-2- l!աll~ո րH

e

e

,' _

* -T=

-•

.Ո2.. 0

.f't

Է8

յ)ոu ոf) րH 2

Պ

e

-

-

Ullj~U1ակոg

կ•• t •• ,.. t ' •• tt • րՀ t t • ttt 'I\, ft t 9 tttt tttt tttt

t,զոt10կորակաu :j>ոկոuաՀ1որոul

Նկ. 2.38. Մակրոմոլեկուլների բաժանումը ֆիզիկաքիմիական հատկանիշներով. 1 - սպիտակուցների շարժը դեպի pl, 2 - մոլեկուլների իզոէլեկտրական ֆոկուսավորում դոնդողի մեջ (А.В. Марахонов, https://studylib.ru/doc/2342706/ molekulyarnaya-biologiya-marahonov-andrej-vladimirovich-lekci):

pH-ի ֆիքսված գրադիենտը մնում է կայուն բարձր էլեկտրական լարումների պայմանններում: Վերջին տարիներին փորձերի ժամանակ օգտագործում են pH-ի ապամոբիլիզացված՝ ֆիքսված գրադիենտներով պատրաստի «ստրիպներ»: Ստրիպները պատրաստ են աշխատանքի համար վերահիդրատացիայից հետո և ավելի հստակ են բաժանում նմուշները: Վերահիդրատացիան կատարում են հատուկ սարքերում հատուկ լուծույթներով, որոնք կազմված են միզանյութից, CHAPS դետերգենտից, վերականգնող գործոն դիտիոտրեիտոլից, բուֆերային հատկություններով ամֆոլինից, գլիցերինից, բրոմֆենոլային կապույտից: Պատրաստի ստրիպները կարող են աշխատել նաև հիմնային pH-ի պայմաններում:

Նկ. 2.39. pH-ի ֆիքսված գրադիենտներով դոնդող պատրաստելու համար օգտագործվող սարքի սխեման (http://www.ibmc.msk.ru/content/Educ ation/w-o_pass/MMoB/4.pdf):

Նմուշները ներմուծվում են դոնդողի մեջ կամ անմիջապես վերահիդրատացնող լուծույթի կազմում, կամ պատրաստ ստրիպների մեջ արդեն էլեկտրաֆորեզի ժամանակ բուֆերի կազմում:

2.14. ԵՐԿՉԱՓ ԷԼԵԿՏՐԱՖՈՐԵԶԻ ՕԳՏԱԳՈՐԾՄԱՆ

ԲՆԱԳԱՎԱՌՆԵՐԸ

Պրոտեոմիկայի բնագավառում կատարվող հետազոտությունների հիմնական մեթոդը էլեկտրաֆորեզային մատնահետքերի ստացումն է, հաջորդ փուլը՝ երկչափ էլեկտրաֆորեզում ստացված պատկերի բիոինֆորմատիկական վերլուծությունը: Վերլուծության ընթացքում համեմատվում են օրգանիզմի զարգացման տարբեր փուլերում, նույն փուլի տարբեր ենթափուլերում կամ տարբեր հյուսվածքների՝ բայց զարգացման նույն փուլում գտնվող բջիջների հետազոտման արդյունքում ստացված պատկերները (նկ. 2.40.1):

t,,!MP,,1 ~00Հ2

"lաԸոկերC.հրfl հաljաuարեgոul, հաlltllաԸոոul

ilոt. զաuզկ ա6 ULկt)ԸոակոgC.tրiti t!,Iյlյ.lլlեUflայfl tlաljարրiակti ԸոարրհրոtրյոtCյCյեր" l!MակազոակաC. զC.ահԸոոul

Նկ. 2.40. E. coli-ի պրոտեոմային պատկերի հատված. 1 - սպիտակուցների էլեկտրաֆորեզային մատնահետքերի ֆորեգրամ, 2 - էլեկտրաֆորեգրամի պատկերի վերլուծություն (http://www.ibmc.msk.ru/content/ Education/w-o_pass/MMoB/4.pdf):

Վերլուծությունը կատարվում է մի քանի քայլերով. 1) հավասարեցում՝ նույն սպիտակուցների բացահայտում համեմատվող պատկերների վրա, 2) համեմատում, 3) վիճակագրական վերլուծություն՝ ստացված արդյունքների տարբերությունների բացահայտում և գնահատում: Հետազոտությունների ժամանակ գնահատվում են պատկերի վրա բծերի տեղը, մակերեսը, բծի գունավորման խտությունը և դրա ծավալը (նկ. 2.40.2): 2.14.1. Իմունաէլեկտրաֆորեզի տարբերակները՝ ԻԷՖ և կրոս կամ խաչաձև ԻԷՖ Իմունաէլեկտրաֆորեզի (immunis՝ որևէ բանից ազատված) մեթոդը կիրառվում է սպիտակուցների ախտորոշման համար: Առաջին հերթին խոսքը արյան շիճուկի սպիակուցների մասին է: Իմունոէլեկտրաֆորեզի մեթոդը հնարավորություն է տալիս ոչ միայն բնութագրել սպիտակուցները դոնդողում դրանց մոլեկուլների շարժման արագությամբ այլ և բացահայտել դրանց հակածնային բնույթը: Ֆորեզի այս տարբերակում միավորված են առաջին ուղղությամբ կատարվող հակածինների (ՀԾ) բաժանումն ըստ տեսակների դրանց մոլեկուլների լիցքի համաձայն և երկրորդ փուլում դրանց հակածնային բնույթի բացահայտումը պրեցիպիտացիայի եղանակով համապատասխան ՀՄ-ների կամ ՀԾ-ների հետ փոխազդեցության միջոցով: ԻԷՖ-ի եղանակը թույլ է տալիս բացահայտել նմուշի կազմում առկա բազմաթիվ ՀՄ-ների էլեկտրոստատիկ հատկությունները՝ էլեկտրական դաշտում շարժման արագությունը, կենսաքիմիական և էնզիմային ակտիվությունը: Բացի դրանից՝ այս մեթոդով բացահայտվում են բարդ խառնուրդներում առկա բազմաթիվ թիրախ ՀՄ-ները, որոշվում է դրանց քանակը նմուշում, հնարավորություն է ընձեռվում կատարել երկու կամ ավելի հակածնային համակարգերի համեմատություն:

Նշենք, որ ՀՄ-ների բաժանման հնարավորությունները ԷՖ-ի եղանակով սահմանափակ են՝ նույն տեսակի, բայց յուրահատուկ կազմություն ունեցող առանձին ՀՄ-ների էլեկտրոստատիկ հատկանիշները բավականին մոտ են և գործնականում չեն բաժանվում այս եղանակով: Լավագույն դեպքում կարող են բաժանվել նույն տեսակի, բայց տարբեր ծանր շղթաներ պարունակող ՀՄ-ները՝ գամմա 1-ը գամմա 2-ից: 1953 թ. P. Grabar, С. Williams (Аксельсен Н. и др., 1977) առաջարկեցին ԻԷՖ կատարման առաջին տարբերակը: Առաջարկված մեթոդը կազմված է երկու փուլերից. առաջին փուլում հակածինները բաժանվում են առանձին թորամասերի ագարոզային դոնդողում էլեկտրաֆորեզի եղանակով: Երկրորդ փուլում կատարվում է հանդիպակաց երկմեր իմունոդիֆուզիա: Առաջին փուլում բուֆերի որոշակի pH-ի պայմաններում տարբեր ՀԾ-ների տարբեր զանգվածի և լիցքի համապատասխան մոլեկուլները բաժանվում են թորամասերի: Սովորաբար ՀԾ-ների սպիտակուցային շղթաները ունեն բացասական լիցք և դրա ազդեցությամբ հակված են շարժվել դեպի անոդ (+), բայց էլեկտրական դաշտի ազդեցությամբ դոնդողում առաջանում է դեպի կատոդ շարժվող էլեկտրաէնդօսմատիկ հոսանք, և դրա ներքո առանձին ՀՄ-ների շարժը կատարվում է դրանց սեփական լիցքի և էլեկտրաէնդօսմատիկ հոսանքի գումարային ազդեցության արագությամբ և ուղղությամբ: Այն ՀՄ-ները, որոնց բացասական լիցքը փոքր է էլեկտրաէնդօսմատիկ հոսանքի ազդեցությամբ ուղղվում են դեպի կատոդ, իսկ նրանք, որոնց բացասական լիցքը մեծ է, դեպի անոդ (նկ. 2.41):

+

ա 1ր.թ գ 1ո ր.o

գ1որ ~ գ 1ո րy

Նկ. 2.41. ՀՄ-ների բաժանումը էլեկտրական դաշտում: ՀՄ-ների շարժը ագարոզային դոնդողում էլեկտրական դաշտի ազդեցությամբ կատարվում է դրանց լիցքի և էլեկտրաէնդօսմատիկ հոսքի գումարային ազդեցությամբ (Н. Аксельсен и др., 1977)

Էլեկտրաֆորեզի կատարման համար պատրաստվում է ագարային դոնդողի շերտ: Փորձի կատարման համար օգտագործվող միջավայրի pH-ը 8,6 է: Դոնդողի կենտրոնում՝ նկարի վրա սև խորշի մեջ ներմուծվում է նմուշը՝ արյան շիճուկի փոքր ծավալ: Պրոցեսի ավարտին β և γ գլոբուլինները մոլեկուլների փոքր բացասական լիցքի և էնդօսմոսի գումարային ազդեցությամբ տեղափոխվում են դեպի կատոդ՝ (-), իսկ ալբումին α և δ գլոբուլինը՝ դեպի անոդ՝ (+): Ստացված ֆորեգրամի պատկերից կարելի է եզրականացնել, որ սպիտակուցների բացասական ամենափոքր լիցքը γ-գլոբուլինն է և ամենամեծը՝ ալբումին α-նը: ԻԷՖ երկրորդ փուլում օգտագործվող հանդիպակաց իմունադիֆուզիան կատարվում է նույն դոնդողի վրա և նպատակաուղղված է բաժանված ՀՄ թորամասերի դետեկցիայի խնդրին: Խնդիրը լուծվում է իմունոպրեցիպիտացիայի եղանակով: Բաժանված թորամասերից մի փոքր հեռավորության վրա դոնդողից կտրվում է զուգահեռ ակոս, որի մեջ ներմուծվում է հետազոտվող ՀՄ-ներին համապատասխանող ՀԾ-ների լուծույթ (նկ. 2.42): Ապա դոնդողը մեկ օրով կամ ավելի երկար թողնվում է խոնավ պայմաններում: Այս ընթացքում թորամասերի ՀՄ-ները շարժվում են դեպի ակոս, իսկ ակոսի մեջ գտնվող ՀԾ-ները ներմուծվում դոնդողի մեջ և շարժվում ընդդեմ ՀՄ-ներին: Հանդիպման վայրում առաջանում են պրեցիպիտատի կամարներ, որոնց չափսերը, տեղը և ձևը պայմանավորված են ՀՄ-ների և ՀԾ-ների բնույթով և խտությամբ: Նշենք, որ պրեցիպիտացիայի արդյունքում ձևավորվող իմունային համալիրները ապաակտիվ են, անշարժ և անցնում են նստվածք: Արդյունքները դետեկտավորելու համար դոնդողը ներկվում է հատուկ ներկանյութերով, ապա ֆորեգրամը հետազոտվում է: Խաչաձև կամ կրոս ԻԵՖ-ի դեպքում ՀԾ-ների բացահայտումը նույնպես կատարվում է երկու փուլով: Առաջին փուլում կատարվում է սովորական ԻԷՖ, որի ժամանակ նմուշում առկա ՀՄ-ները բաժանվում են թորամասերի: Ֆորեզի համար ընտրվում են այնպիսի պայմաններ, որոնց շնորհիվ բոլոր սպիտակուցները շարժվում են անոդից դեպի կատոդ և առաջացնում առանձին թորամասեր:

Նկ. 2.42. Հանդիպակաց երկմեր իմունոդիֆուզիայի կատարման սխեման: 1 - ՀՄ-ների և ՀԾ-ների դասավորությունը ագարոզային դոնդողի վրա: Կամարների առաջացման սխեման. ա - բաժանված թորամասեր, բ - պրեցիպիտացիայի կամարներ, գ - ՀԾ-ներ պարունակող ակոս: 2 - Իմունոդիֆուզիայի արդյունքում ստացված ներկված ֆորեգրամը: (Аксельсен Н. и др.,1977)

Երկրորդ՝ պրեցիպիտացիայի փուլի համար պատրաստվում է կոմբինացված դոնդող: Առաջին փուլում օգտագործվող դոնդողից կտրվում է թորամասեր պարունակող շերտը, որը դրվում է երկրորդ դոնդողի պատրաստման համար օգտագործվող սարքի կատոդի կամ մեկնարկի գծի վրա: Նշենք, որ այս փուլում էլեկտրոդները 90º-ով շեղված են այնպես, որ թորամասեր պարունակող դոնդողի շերտը գտնվի մեկնարկի գծի վրա: Ապա դոնդող պատրաստելու համար սարքում մնացած ազատ ծավալի մեջ լցվում է իմունային շիճուկ պարունակող հալեցված ագարոզա, որը արագ սառեցվում է և դառնում դոնդող (նկ. 2.43): Թորամասերում գտնվող ՀՄ-ները, շարժվելով էլեկտրական դաշտում հակաշիճուկ պարունակող ագարոզի մեջ, առաջացնում են պրեցիպիտատների լայն հիմքեր ունեցող գագաթաձև կուտակումներ: Փորձի ավարտից հետո դոնդողը ներկվում է, և ապա կատարվում է ստացված ֆորեգրամի դետեկցիա: Ֆորեգրամի վրա առաջացած գագաթների հիմքերի լայնությունը պայմանավորված է առաջին բաժանումից հետո առաջացող բծերի մեծությամբ: Առանձին գագաթներ կազմող բլուրների հիմքերը որոշ դեպքերում համատեղվում են հարևան բլուրների հիմքերի հետ: Բայց գագաթները հստակ ընդգծված են, և դրանցով որոշվում են թորամասերի կազմի ՀՄ-ները և ՀՄ-ների քանակը:

+

+

Նկ. 2.43. Կրոս ԻԷՖ կատարման սխեման և ստացված ֆորեգրամը. 1 - երկու հատվածներից կազմված դոնդողը կատոդի կողմում գտնվում է 1-ին բաժանման արդյունքում ձևավորված ՀՄ-ների թորամասերի շարքը՝ 2-րդ բաժանման մեկնարկի գիծը: Անոդի կողմում գտնվող դոնդողը պարունակում է հակաշիճուկ (Н. Аксельсен и др., 1977), 2 - խաչաձև ԻԷՖ-ի ադյունքում ստացված մարդու արյան շիճուկի ֆորեգրամի գագաթները (http://www.ibmc.msk.ru/content/Education/ w-o_pass/MMoB/4.pdf):

Խաչաձև ԻԷՖ-ի մեթոդը բավականին ճշգրիտ է և թույլ է տալիս գնահատել ՀՄ-ների քանակը ամեն առանձին գագաթի կազմում: Քանակական գնահատումը կատարվում է ՀՄ-ի շարժման և այդ ընթացքում դոնդողում լուծված ՀԾ-ի հետ փոխազդեցությամբ առաջացվող գագաթի ամբողջ մակերեսի չափով: Խաչաձև ԻԷՖ-ի մեթոդը թույլ է տալիս նաև անջատել առանձին մաքուր ՀՄ-ն դոնդողից հետագա օգտագործման համար: Մեթոդի առավելություններից է նաև այն, որ այս եղանակով բաժանված ՀՄ-ները մնում են անփոփոխ, չեն ենթարկվում բնափոխման, որի շնորհիվ առանձնացված ՀՄ-ները կարող են օգտագործվել հետագա հետազոտություններում կամ այլ նպատակով: Մեթոդը լայնորեն կիրառվում է պարապրոտեինեմիայինների և իմունոդեֆիցիտային պրոտեինեմիայինների ախտորոշման համար: Կիրառման այլ բնագավառներ են օրգանիզմի այլ հեղուկների սպիտակուցների հետազոտությունը և սպիտակուցային դեղանյութերի մաքրության ախտորոշումը:

2.15. ԲՆԱՓՈԽՈՂ ԳՐԱԴԻԵՆՏԱՅԻՆ ԴՈՆԴՈՂԱՅԻՆ

ԷԼԵԿՏՐԱՖՈՐԵԶ՝ ԲԳԴԷ (Denaturation Gradient Gel Electrophoresis, DGGE) և դրա տեսակները Գենոմային ԴՆԹ-ի հատվածների նուկլեոտիդային հերթականությունների հետազոտություններում մեծ տարածում է ստացել Բնափոխող գրադիենտային էլեկտրաֆորեզի եղանակը՝ Denaturation Gradient Gel Electrophoresis (DGGE), որը հիմնվում է ԴՆԹ-ի շղթաների նուկլեոտիդային կազմում մեկ կամ մի քանի մոնոմերների փոխարինումներով պայմանավորված բնափոխման պայմանների տարբերությունների վրա: Այսինքն՝ շղթայի կազմում մեկ կամ ավելի նուկլեոտիդների փոփոխությունը հանգեցնում է շղթայի հալեցման կամ բնափոխման համար անհրաժեշտ պարագաների՝ բնափոխող նյութերի խտության ցուցանիշների զգալի փոփոխության: Լ. Լեհմանը և Ս. Ֆիշերը 1979 թ. մշակեցին ԴՆԹ-ի փոփոխված հատվածների բաժանման մեթոդ, որի հիմքում ընկած է տարբեր նուկլեոտիդային կազմ ունեցող շղթաների հալեցում առաջացնող բնափոխող նյութերի խտությունների տարբերությունը (С.Г. Фишер, Л.С. Лерман, 1979): Լ. Լեհմանը և Ս. Ֆիշերը ելնում էին նրանից, որ շղթայի նուկլեոտիդային կազմը ազդում է ինչպես մոլեկուլի ոլորվածության աստիճանի վրա, այնպես էլ դրա բնափոխման պայմանների և էլեկտրական դաշտում շարժման արագության վրա: Փորձի համար գիտնականները առաջարկեցին օգտագործել կայուն խտության ՊԱԱԴ, որի՝ դեպի կատոդ ուղղված ծայրում աստիճանաբար բարձրանում է բնափոխում առաջացնող նյութերի՝ միզանյութի և ֆորմամիդի խտությունը: Էլեկտրաֆորեզը կատարվում է 60 0С պայմաններում: Փորձի համար դոնդողի մեջ ներդրվում է ԴՆԹ-ի փոքրածավալ նմուշ: Փորձի ընթացքում ԴՆԹ-ի հատվածները էլեկտրական դաշտի ազդեցությամբ շարժվում են դեպի կատոդ, և դրանցից յուրաքանչյուրը փորձի ընթացքում հասնում է դոնդողի այն հատվածին որում բնափոխող նյութերի խտությունը առաջացնում է շղթայի որոշակի հատվածի բնափոխում: Եթե մուտացիայի կամ այլ պատճառով ԴՆԹ-ի նույն հատվածի պատճեններում առկա են տարբեր նուկլեոտիդներ,

շղթաների բնափոխումը կատարվում է դոնդողի տարբեր կետերում: Այսպիսով՝ DGGE մեթոդը հիմնվում է հետևյալ օրինաչափության վրա. տարբեր նուկլեոտիդային կազմ ունեցող շղթաների հալեցումը կամ բնափոխումը կատարվում է դոնդողի կազմում բնափոխող նյութերի տարբեր խտությունների շրջաններում (Fodde, Losekoot, 1994): Քանի որ ջերմաստիճանի և բնափոխող նյութի խտության աստիճանաբար բարձրացումը առաջացնում է որոշակի նուկլեոտիդային կազմով երկշղթա ԴՆԹ-ի հալեցում որոշակի, միայն դրան բնորոշ ցուցանիշների պայմաններում, ուսումնասիրությունների այս մեթոդը կարող է կիրառվել երկշղթա ԴՆԹ-ի կազմում առկա կետային մուտացիաների, փոքր դելեցիաների և նույնիսկ չզուգավորված նուկլեոտիդների բացահայտման համար: Վարտելը և Բենիգը ենթադրեցին, որ ԴՆԹ-ների շղթաների բնափոխում կամ հալեցում կարող է առաջացնել նաև էլեկտրաֆորեզի ընթացքում առաջացվող ջերմաստիճանի հետզհետե բարձրացումը: ԴՆԹ-ի կազմի նուկլեոտիդային տարբերություններով առաջացվող հալեցման ջերմաստիճանների տարբերության վրա հիմնվող շղթաների բաժանման մեթոդը կոչվել է Temperature gradient gel electrophoresis (TGGE)՝ ջերմաստիճանային գրադիենտներով դոնդողային էլեկտրաֆորեզ՝ ՋԳԴԷ (Wartell, Benight, 1985): DGGE մեթոդի տեսական հիմունքները ԴՆԹ-ի կրկնակի շղթայի կառուցվածքային կայունությունը հիմնականում պայմանավորված է նույն շղթայի երկու հարևան նուկլեոտիդների փոխազդեցության էներգիայով: Հենց այս՝ ստեկինգ փոխազդեցություններն են ձևավորում ԴՆԹ-ի զսպանակաձև ոլորվածության աստիճանը ֆիզիոլոգիական լուծույթում, և դրանց միջև առկա կապի ուժը գերազանցում է ԴՆԹ-ի երկու շղթաները կոմպլեմենտար կապող ազոտային հիմքերի ջրածնային փոխազդեցության ուժը: Նույնիսկ մեկ նուկլեոտիդի փոփոխությունը ԴՆԹ-ի շղթայի կազմում կարող է փոփոխել շղթաների ներմոլեկուլային էներգետիկ վիճակը և առաջացնել հալեցման պայմանների փոփոխություն մինչև 1 0С:

Նմուշում առկա ԴՆԹ-ի առանձին հատվածները կազմված են յուրահատուկ նուկլեոտիդային հերթականություններից, որոնք հալեցվում են՝ բնափոխվում որոշակի ջերմաստիճանի պայմաններում, որը և հանդիսանում է տվյալ հատվածի հալեցման ջերմաստիճանը: ԴՆԹ շղթայի ամեն հատվածի կազմում առկա են հալեցման շրջաններ, որոնց բնորոշ են նույն հալեցման ջերմաստիճանը և բնափոխող նյութերի նույն խտությունները: Այստեղից հալեցման ջերմաստիճանը (Т) հավասար է այն ցուցանիշին, որի դեպքում ԴՆԹ-ի շղթան բնափոխվում է կամ հալեցվում: Հալեցվող հատվածի երկարությունը տատանվում է 25-ից մինչև մի քանի հարյուր նուկլեոտիդային զույգ: Նույն նմուշի հարևան հատվածների հալեցման ջերմաստիճանը կարող է տարբերվել մի քանի աստիճանով: 100-1000 ն.զ-ներից կազմված ԴՆԹ-ի շղթայում սովորաբար առկա են 2-ից մինչև 5 այդպիսի հալեցման շրջաններ: Քրոմոսոմային ԴՆԹ-ի ռեստրիկտազներով կտրտված հատվածների՝ ռեստրիկտների հալեցման ջերմաստիճանը գտնվում է 65-80 0С սահմաններում: Ավելի ուշ առաջարկվեց ԴՆԹ-ների տարբեր նուկլեոտիդային կազմ ունեցող շղթաների բաժանման համար միավորել նույն փորձում բնափոխում առաջացնող քիմիական գործոնների խտությունների

և

ջերմաստիճանի բարձրացման ազդեցությունները: 60 0С ջերմաստիճանը մի փոքր զիջում է ամենահեշտ բնափոխվող հատվածների հալեցման ջերմաստիճանի ցուցանիշին: Երկշղթա ԴՆԹ-ի հատվածը շարժվում է ՊԱԱԴ-ում էլեկտրական դաշտի ազդեցությամբ սեփական մոլեկուլային զանգվածին համապատասխանող արագությամբ: Այն պահին, երբ ԴՆԹ-ի հատվածը հասնում է դոնդողի հալեցման ջերմաստիճանի (Т) շրջանին կամ բնափոխող նյութերի խտության ցուցանիշին, շղթան ճյուղավորվում է. ամենահեշտ հալեցվող հատվածը բաժանվում է երկու շղթաների, իսկ մնացած մասը մնում է երկշղթա: Այսպես փոխված մոլեկուլը բռնվում է դոնդողի խորշերով, և դրա շարժման արագությունը խիստ նվազում է: Արագության նվազումը համամասնային է հեշտ հալեցվող հատված139

ների երկարությանը. ինչքան ավելի երկար են միաթել շղթաները, այնքան ավելի է նվազում արագությունը: Եթե ֆորեզի ջերմաստիճանը և բնափոխող նյութերի խտությունների գրադիենտները ճիշտ են ընտրված, միայն մեկ նուկլեոտիդով տարբերվող ԴՆԹ-ի շղթաների արագությունը դանդաղում է դոնդողի տարբեր գոտիներում, և հետզհետե տարբեր կազմով շղթաները հեռանում են իրարից: Այսպիսով՝ ջերմաստիճանի և բնափոխող նյութի խտության աստիճանաբար բարձրացումը առաջացնում է որոշակի կազմով երկշղթա ԴՆԹ-ների հալեցում միայն դրանց բնորոշ ջերմաստիճանի և բնափոխող նյութերի խտության պայմաններում՝ տարբեր որոշակի կետում: Կատարված հետազոտությունների արդյունքում բացահայտվեց, որ նույնիսկ շղթայի այն հատվածներում, որոնց բնորոշ է հալեցման բարձր ջերմաստիճան, նուկլեոտիդային փոխարինումները բացահայտվում են բնափոխող գրադիենտային դոնդողային էլեկտրաֆորեզի՝ ԲԳԴԷ եղանակով: Հետազոտությունների ընդունված մեթոդով չեն բացահայտվում միայն ամենաբարձր հալեցման ջերմաստիճանով բնութագրվող հատվածները: Պատճառը այն է որ այդ հատվածների հալեցման ջերմաստիճանի պայմաններում հալեցվում է ԴՆԹ-ի ամբողջ հատվածը և ամբողջ մոլեկուլը բնափոխվում է ձևավորում միաշղթաներ, իսկ դրանց շարժման արագությունն այլևս պայմանավորված չէ մոլեկուլների կազմակառուցվածքային տարբերություններով: Եթե անհրաժեշտություն է առաջանում բացահայտել նուկլեոտիդային փոխարինումը ամենադժվար հալեցվող հատվածում, ապա հետազոտվող ԴՆԹ-ի թիրախ հատվածին կարում են ավելի դժվար հալեցվող ցիտոզինգուանին զույգերից կազմված շղթա՝ «GCո-ծամկալ», և դրա առկայությամբ հաջողվում է բացահայտել մուտանտ նուկլեոտիդը պարունակող լոկուսը: Նշենք, որ բնափոխող գրադիենտային էլեկտրաֆորեզի եղանակով հաջողվում է հետազոտել 100-ից մինչև 1000 զ.ն-ից կազմված հատվածները: Այս սահմանափակումը պայմանավորված է ՊԱԱԴ-ի

առանձնահատկություններով և խորշերի փոքր չափսերով: ԲԳԴԷ-ի եղանակով կարելի է թեստավորել 1000 նուկլեոտիդներից կազմված շղթայի կեսը՝ 500 նուկլեոտիդ: Ավելի բարձր արդյունքների հասնելու համար հետազոտվող շղթային միացնում են օժանդակ զոնդ և թեստավորում երկարացված շղթայի կազմը: ԲԳԴԷ փուլերը կատարվում են հիմնականում սովորական էլետրաֆորեզի եղանակով, որոշակի առանձնահատկությունները ներկայացվում են նկարներ 2.44 և 2.45-ում: ԲԳԴԷ 1-ին Ա փուլում կատարվում է մուտացիաների բացահայտումը: Ա՝ առաջին էլեկտրաֆորեզի արդյունքում որոշակի Tm պայմաններում աջ ծայրին մոտ շղթան բնափոխվում է և կանգ առնում դոնդողի որոշակի շրջանում: Բացահայտվում է շղթայի միջին հատվածին մոտ գտնվող լոկուսում

B-նշվող մուտացիան: Բ փուլում այլ

մուտացիա բացահայտելու համար ձախ՝ շղթայի հակառակ ծայրին ՊՇՌ-ի միջոցով որպես պրայմերի մաս ավելացվում է GC ծամկալը: Կրկնապատկման արդյունքում շղթան դառնում է ավելի ջերմակայուն:

ՊՇՌ-ից

ստացված

ԴՆԹ-ի

հատվածները

նույնպես

ենթարկվում են ԲԳԴԷ բաժանման և այն դեպքում, երբ ԴՆԹ-ի պատճենների կազմում առկա են փոփոխված՝ մուտանտ շղթաներ, ֆորեգրամի վրա առաջանում են դրանց հատուկ բծեր և բացահայտվում է երկրորդ՝ A մուտանտ հատվածը (նկ. 2.45): Այժմ արդեն էլեկտրաֆորեզի արդյունքների դետեկցիայի համար մշակվել են համակարգչային ծրագրեր, որոնք թույլ են տալիս ճշգրիտ բացահայտել ԴՆԹ-ի շղթայի նույն լոկուսում կատարված տարբեր կետային մուտացիաները դրանց տեսակով պայմանավորված հալեցման և բնափոխման պայմաններով: Բնափոխող գրադիենտային էլեկտրաֆորեզի հետազոտական մեթոդը կիրառվում է գենոմիկայում ԴՆԹ-ի մուտացիաների և պոլիմորֆիզմների բացահայտման համար, առավել հաճախ դա կիրառվում է այն դեպքերում, երբ ժառանգվող մուտացիաները դառնում են գենետիկական շեղումների կամ քաղցկեղի առաջացման պատճառ:

ն

Ճ

TmA1TmB

'Cl

i': Cl Ը:. Ը:.

,0

Cյ.

=Հ =Հ Պ#

Պ'եl_ 'Պ-

i':

s

.2. .t::..

.2. C:

~

ր

նC-6~;..,._-+---~~;:: Պlրաi~tր 1

TոՃրTո8

Պlրաi~tր 2

=~- - - , - - - - - ՇC

Tո GՇ» Tո Ճ •Tո8

Նկ. 2.44. ԲԳԴԷ-ի փուլերը և պրոցեսին մասնակցող տարրերը: A, B, - ԴՆԹ-ի շղթայի մուտացիա պարունակող լոկուսներ, TmA, TmB - լոկուսների հալեցման ջերմաստիճանները, PCR - պոլիմերազային շղթայակցման ռեակցիա ՊՇՌ, GCո - գուանին-ցիտոզին նուկլեոտիդային զույգերից կազմված ջերմակայուն շղթա: Ա - առաջին ԲԳԴԷ, բացահայտվում է B մուտացիա կրող լոկուսը, Բ - ՊՇՌ GCո ծամկալի ներմուծում շղթայի կազմ այլ մուտանտ լոկուսների բացահայտման համար http://hdklab.edu_manual/dgge1. html%25 (Helms, 1990):

Մեթոդը կիրառվում է նաև տեսակների գենետիկական տարբերության գնահատման համար, օրինակ՝ բակտերիաների և մանրէների շտամերի որոշման, վիրուսների ախտորոշման, տեսակայուրահատուկ ՀԾ-ների բացահայտման, էկոլոգիական խնդիրների լուծման և այլն (Wartell, Benight, 1985, Muyzer, de Waal, Uitterlinden, 1993, К. Ванбруховен, А. Рингаерт, П. Ваттио, Р. Де Мот, Д. Спрингаэль, 2004, Квон, Вацек, Зейн, Хоппел и Керр, 2006):

I

S 6

9 10 ll 12

] aեmեpaօօc~tե•""''

յ

'lոյորiոն.կ[ե1աlsերl

Նկ. 2.45. ԲԳԴԷ միջոցով ստացված տարբեր նմուշներում մուտանտ լոկուսների առկայությունը բացահայտող ֆորեգրամ: Այն նմուշները որոնք չեն պարունակում մուտացիա առաջացնում են 1 բիծ և հալեցվում են նույն ջերմաստիճանային պայմաններում՝ հոմոդիմերներ են: Նմուշները որոնցում առկա են մուտանտ լոկուսներ հալեցվում են տարբեր ջերմաստիճանների պայմաններում և առաջացնում մի շարք բծեր՝ հետերոդիմերներ են http://hdklab.edu_manual/dgge1.html%25, Helms, 1990):

ԲԳԴԷ համար օգտագործվող սարքավորումները արտադրվում են Bio-Rad, INGENY, CBS Scientific և Biometra կազմակերպությունների կողմից (նկ. 2.46):

Վ'

Blօոetra TՇՇԷ Maxi Տ/steո

8loոetրթ TGGE Տysteո

JY-TD331A

Նկ 2.46. ԲԳԴԷ համար օգտագործվող սարքեր https://www.ld.ru/molecular/ilist 3455.html, https://ru.made-inchina.com/co_zjtop17/product_JyTd331A-Series-Denaturing-GradientGel-Electrophoresis System_rgehysigg.html

2.16. ՌԵՍՏՐԻԿՏԱԶ ՖԵՐՄԵՆՏՆԵՐԸ ԵՎ ԴՐԱՆՑ ՕԳՏԱԳՈՐԾՄԱՆ

ԲՆԱԳԱՎԱՌՆԵՐԸ

Ռեստրիկտազ (restrictio՝ սահմանում) ֆերմենտներ անվանում են հիդրոլիտիկ բնույթի՝ էնդոնուկլեազային ռեակցիաներ գրգռող և ԴՆԹ-ի շղթան միջին հատվածներում հատող ֆերմենտների խումբը: Ռեստրիկտազները բակտերիաների և արխեյների ցիտոպլազմային հակաֆագային պաշտպանական համալիրի գործոններ են, որոնք, կտրտելով ֆագերի ԴՆԹ-ները, ապահովում են տեր-բջջի անվտանգությունը: Ռեստրիկտազ խմբի ֆերմենտները կտրում են ԴՆԹ-ի երկշղթան հատուկ լոկուսներում՝ նուկլեոտիդային զույգերի որոշակի հերթականությունների՝ պալինդրոմների հատվածում կամ դրանց հարևանությամբ: Պալինդրոմները, լինելով կազմված ներքին կառուցվածքային սիմետրիայի սկզբունքով, ճանաչվում են ֆերմենտի հատուկ՝ ճանաչման կենտրոններով: Պետք է նշել, որ պոլինդրոմների սիմետրիան կամ առկա է նույն շղթայի հերթականությունում՝ GTAATG, կամ բացահայտվում է կոմպլեմենտար շղթաների վրա՝ GTATAC առաջին շղթայի հերթականությունը սիմետրիկ է երկրորդ շղթայի CATATG հերթականությանը: Պալինդրոմները կազմված են 4-ից 14 զ. նուկլե5'-AՇՇCTՇ- 3' 3'-TCCՇAC- 5'

ոտիդային զույգերից, օրինակ՝ պալինդրոմը կազմված է 6 զ.ն-ից: Էնդոնուկլեազները և մեթիլտրանսֆերազները ռեստրիկցիայիմոդիֆիկացիայի ֆերմենտային համալիրի տարրեր են: Նույն ֆերմենտը կարող է կատարել երկու ֆունկցիաները կամ լինի մասնագիտացված՝ կատարի դրանցից մեկը: Մոդիֆիկացիայի ակտիվությամբ օժտված այս խմբի ֆերմենտները մեթիլավորում են բակտերիաների ԴՆԹ-ների ճանաչման սայտերի ցիտոզինները և ադենինները և դրանով պաշտպանում դրանք քայքայումից: Ռեստրիկտազների ակտիվ կենտրոնները չեն ճանաչում մեթիլավորված սայտերը և դրա շնորհիվ չեն կտրտում սեփական ԴՆԹ-ն: Բակտերիալ բջջում ԴՆԹ-ի նոր սինթեզված շղթաների մեթիլավորումը կատարվում է մեթիլ144

տրանսֆերազ խմբի մոդիֆիկացնող ֆերմենտներով անմիջապես ռեդուպլիկացիայի պրոցեսում՝ մայրական ԴՆԹ-ի մեթիլավորման տարբերակով: Ռեստրիկցիայի և մեթիլավորման պրոցեսները փոխկապված են և կազմում են մոդիֆիկացիայի-ռեստրիկցիայի համալիր (И. Кобаяши, 2001): Անցյալ դարի 50-ական թվականներին հայտնաբերվեցին առաջին ռեստրիկտազ ֆերմենտները, իսկ այժմ հայտնաբերված ռեստրիկտազների քանակը արդեն 3600-ից ավելի է (У. Арбер, С. Линн, 1969): Հայտնի ռեստրիկտազների թվից 3000-ն արդեն լավ հետազոտված են, իսկ 800-ը՝ հասանելի գնման համար: Նշենք, որ ռեստրիկտազները շատ կարևոր են գենային ինժեներիայի և մոլեկուլային կենսաբանության բնագավառներում կատարվող աշխատանքների համար: Ռեստրիկտազ ֆերմենտները հատում են ԴՆԹ-ի մոլեկուլը երկու փուլով. նախ հատվում է առաջին շղթան, հետո հատման կետի հարևանությամբ կտրվում է երկրորդ շղթան: ԴՆԹ-ի հատման կետի ճանաչման և դրա հետ ռեստրիկտազների միացման մեխանիզմի բացատրման համար առաջարկվել է երկու վարկած: Առաջին վարկածի համաձայն՝ ֆերմենտը շարժվում է ԴՆԹ-ի երկարությամբ, հասնում հատման կետին, ճանաչում այն և հատում: Ճանաչման մեխանիզմը դեռևս պարզաբանված չէ: Երկրորդ վարկածի համաձայն՝ ֆերմենտը ունի երկու ակտիվ կենտրոն՝ ճանաչման և հատման: Ֆերմենտի ճանաչման կենտրոնը գտնում է թիրախ ԴՆԹ-ի ճանաչման կետը և միանում դրան: Ապա քաշում է թիրախ ԴՆԹ-ի շղթան, հատման կենտրոնը մոտեցնում ֆերմենտի հատող կետին և կտրում: Հետազոտությունների արդյունքում բացահայտվել է, որ ռեստրիկցիայի պահին թիրախ ԴՆԹ-ի վրա առաջանում են հանգույցներ, որոնք կարող են լինել ֆերմենտի գործունեության արդյունք, այսինքն՝ երկրորդ վարկածը գուցե ավելի հիմնավորված է: Ռեստրիկտազները բացահայտվել են ինչպես բակտերիաների, այնպես էլ արխեյների և որոշ խմորասնկերի բջիջներում: Ֆերմենտների անվանումները տրվում են տեր-բջիջների անվան առաջին երեք տառերով՝ Streptomyces albus՝ Sal, Escherichia coli՝ Eco, և այլն, ու եթե նույն տեսակի բջջում բացահայտվել է մեկից ավելի ռեստրիկտազ՝

Hind II, Hind I, Hind III (Haemophilus influenzae), համարակալվում են բացահայտման հերթականության համաձայն: Ռեստրիկտազային ակտիվությամբ ֆերմենտները նշվում են R տառով՝ (R Hind III), իսկ մեթիլազները՝ M (M Hind III): Այսօր արդեն բացահայտված 3600 ռեստրիկտազների համար հայտնի են 120 տիպի ճանաչման սայտեր: Հայտնի ռեստրիկտազներից 800-ից ավելին օգտագործվում են գիտահետազոտական և կիրառական աշխատանքներում: Ռեստրիկտազ ֆերմենտները, որոնց բնորոշ են ճանաչման և հատման նույն սայտերը, բայց մեթիլավորման տարբեր եղանակներ՝ Sph I (CGTAC^G) Bbu I (CGTAC^G), կոչվում են իզոշիզոմերներ: Այս խմբի առաջին հայտնաբերված ֆերմենտը կոչվում է պրոտոտիպ, մնացածները՝ իզոշիզոմերներ, որոնց օրինակները ներկայացված են աղյուսակում.

SphI CGTAC^G

BbuI CGTAC^G

NcoI C^CATGG

Bsp19I C^CATGG

XapI Y^GGCCR

AcsI Y^GGCCR

NdeII ^GATC

BstKTI ^GATC

BstMBI ^GATC

Kzo9I ^GATC

Տարբեր հերթականություններ ճանաչող, բայց նույն տիպի ծայրեր առաջացնող ռեստրիկտազները կոչվում են իզոկաուդոմերներ, օրինակ՝ Mbo I ռեստրիկազը առաջացնում է N*GATC N և N CTAG*N ծայրեր, իսկ BamH I ռեստրիկազը՝G*GATC C և C CTAG*G ծայրեր: Նույն հերթականություն ճանաչող, բայց տարբեր եղանակով հատող ֆերմենտները կոչվում են հետերոշիզոմերներ, օրինակ՝ Sma I

(GGG^CCC) Xma I (G^GGCCC):

ԴՆԹ-ի շղթաների ռեստրիկտազներով կտրտված ծայրերը կարող են լինել բութ կամ կպչուն: Կպչուն են լինում մոլեկուլների 3՛ և 5՛ ծայրերը (նկ. 2.47): Ռեստրիկտազ ֆերմենտների ակտիվությունը դրսևորվում Mg2+ իոնների ներկայությամբ: Ֆերմենտային ակտիվության 1 միավորը հավասար է 37 ºC պայմաններում 1 ժամում 50 մկլ ռեակցիոն խառնուրդի ծավալում ԴՆԹ-ի 1 մկգ-ի հիդրոլիզի համար անհրաժեշտ ֆերմենտի քանակին:

նթ)

(R5at)

ոLl'lfl'l հարր 0այ1ե('l

Նկ. 2.47. Ռեստրիկտազ ֆերմենտները կտրում են ՆԹ-ի զույգ շղթաները՝ առաջացնելով երեք տիպի ծայրեր՝ բութ, կպչուն 3՛ և կպչուն 5' (https://yandex.ru/images/search ? text=рестриктазы&img_url):

Որոշ ռեստրիկտազ ֆերմենտներ անբարենպաստ պայմաններում փոխում են յուրահատուկ ազդեցության մեխանիզմը՝ ճանաչում են այլ պալինդրոմ. այս երևույթը կոչվում է Star-ակտիվություն: Օրինակ՝ EcoRI-ը լուծույթում рН-ի բարձրացման կամ բուֆերի իոնային ուժի նվազման պայմաններում 5՛- GAATTC-3՛ հերթականության փոխարեն ճանաչում է 5՛- NAATTN-3՛ հերթականությունը (N՝ որևէ նուկլեոտիդ): Նուկլեոտիդների քանակը պալինդրոմում անմիջականորեն ազդում է ԴՆԹ-ի շղթայում դրա հանդիպման հաճախականության վրա: Ամեն մի նուկլեոտիդի հանդիպման հաճախականությունը որևէ լոկուսում հավասար է 1/4-ի: Ուստի 4 նուկլեոտիդներից կազմված պալինդրոմի հանդիպման հաճախականությունը ԴՆԹ-ի շղթայի կազմում որոշվում է 1/44 բանաձևով և հավասար է 1/256 նուկլեոտիդի: Իսկ 6 նուկլեոտիդներից կազմված պալինդրոմի հաճախականությունը հավասար է 1/46, այսինքն՝ այս պալինդրոմների հաճախականությունը հավասար է 1/4096 նուկլեոտիդի: Ներկայացված հաշվարկները ցույց են տալիս պալինդրոմի հանդիպման տեսական հաճախականությունը, բայց չեն բացահայտում փաստացի վիճակը: Օրինակ՝ T7 բակտերիոֆագի 40 000 զ.ն-ից կազմված գենոմում EcoRI ռեստրիկտազով ճանաչվող (G↑AATTC) պալինդրոմներ չկա: Փոքր՝ 4-ից 6 նուկլեոտիդներից կազմված պալինդրոմներ ճանաչող և ԴՆԹ-ի մոլեկուլը մանր հատվածների բաժանող ռեստրիկտազները կոչվում են կարճ կտրող, 6-8 նուկլեոտիդներից կազմված պա147

լինդրոմներ ճանաչող ռեստրիկտազները միջին կտրող են, իսկ մեծ՝ 914 նուկլեոտիդներից կազմված պալինդրոմներ ճանաչող և ԴՆԹ-ն մեծ հատվածների բաժանող ռեստրիկտազները՝ երկար կտրող: Կարճ կտրողների թվին են պատկանում HpaII և Alu (Arthrobacter luteus), երկար կտրողների թվին՝ EcoRI (Escherichia coli) և HindIII: 2.16.1. Ռեստրիկտազների դասակարգումը ԴՆԹ-ի շղթայի հատման եղանակին համապատասխան ռեստրիկտազները դասակարգվում են հինգ դասի: Առաջին դասի ռեստրիկտազները (օրինակ՝ EcoK Escherichia coli К12 և B), ճանաչում են որոշակի հերթականություն և կտրում են ԴՆԹ-ի շղթան այդ կետից առնվազն 1000 զ.ն. հեռավորության վրա: Ճանաչման սայտը ասիմետրիկ է և կազմված է 3 առանձին հատվածներից. առաջինը կազմված է 3-4 զ.ն-ից, իսկ երկրորդը՝ 4-5 զ.նից: Երկու հատվածների միջև գտնվում է 6-8 նուկլեոտիդային զույգերից կազմված սպեյսեր՝ տարանջատող հերթականություն: Նշված ֆերմենտները բազմաֆունկցիոնալ են՝ կատարում են և էնդունուկլեազային և մոդիֆիկացնող՝ մեթիլավորման ֆունկցիա: Ֆունկցիայի ընտրությունը պայմանավորված է ԴՆԹ-ի շղթայի կարգավիճակով: Այս դասի ֆերմենտների լիարժեք ակտիվության համար անհրաժեշտ են 3 կոֆակտորներ՝ S-ադենոզիլմեթիոնին՝ AdoMet, հիդրոլիզացված ադենոզինեռաֆոսֆատ և (Mg2+) իոններ: Առաջին դասի ֆերմենտները կազված են 3 ենթամասերից՝ HsdR, HsdM և HSDDS: HsdR ենթամասը մասնակցում է ռեստրիկցիայի, իսկ HsdM-ն՝ ԴՆԹ-ի շղթայի մեթիլավորման գործընթացին: HSDDS ենթամասը պատասխանատու է գործողության կատարման սայտի ճշգրիտ ընտրության համար: Երկրորդ տիպի ֆերմենտները (օրինակ՝ EcoRI) հոմոերկմերներ են, դրանք ճանաչում են պալինդրոմները և կտրում երկու շղթաները պալինդրոմի հատվածում: Երկրորդ դասի ռեստրիկտազները կտրում են ԴՆԹ-ի շղթան կոմպլեմենտար նուկլեոտիդների հատվածում և առաջացնում բութ ծայրեր, կամ կտրում երկրորդ շղթան մի քանի նուկլեոտիդ շեղված և առաջացնում կպչուն ծայրեր: Այս տիպի

ռեստրիկտազների ակտիվության համար

պահանջվում է

միայն

Mg իոնների ակտիվությունը: Պալինդրոմների չափսերը տատանվում են 4-8 սահմաններում: 2000-ական թվականին բացահայտվեցին երկրորդ խմբի ռեստրիկտազների նոր տեսակներ: Այս ֆերմենտների դասակարգման նպատակով մշակվեց նոր կարգաբանական համակարգ, որի շնորհիվ երկրորդ դասի ֆերմենտները դրանց ակտիվության պայմանների և ազդեցության առանձնահատկությունների համաձայն բաժանվեց մի քանի ենթադասերի: Ենթադասերի նշման համար օգտագործվում են տառային նիշեր: Օրինակ՝ IIB տիպի BcgI և BplI ֆերմենտները մեկից ավելի մոնոմերներ պարունակող բազմամերներ են: Դրանք կտրում են ԴՆԹի շղթան ճանաչման սայտի երկու կողմերից, այսինքն՝ անջատում ԴՆԹ-ի շղթայից ճանաչման սայտը: Ակտիվության համար այս ենթադասի ֆերմենտներին անհրաժեշտ են AdoMet կոֆերմենտը և Mg2+ իոնները: IIE և IIF տիպի ֆերմենտները՝ օրինակ NgoMIV-ն փոխազդում են ճանաչվող հատվածների երկու պատճենների հետ և կտրում են դրանք միաժամանակ: IIM տիպի օրինակ DpnI ռեստրիկտազները ունակ են կտրել ԴՆԹ-ի մեթիլավորված սայտերը: IIT տիպի Bpu10I և BslI ռեստրիկտազները կազմված են երկու տարբեր մոնոմերներից: Դրանցից մեկը ճանաչում է պալինդրոմը, իսկ մյուսի ճանաչման սայտը ասիմետրիկ է (А. Пингуд, А. Ельч (сентябрь 2001, W. Siwek, H. Czapinska, M. Bochtler, J.M. Bujnicki, K. Skowronek, 2012, K. Mierzejewska, 2+

W. Siwek, H. Czapinska, M. Kaus-Drobek, et al., 2014): Երրորդ III տիպի ռեստրիկտազներ են օրինակ Res(P08764) և Mod(P08763): Այս տիպի ֆերմենտները պրոկարիոտների ռեստրիկցիայի-մոդիֆիկացիայի համալիրի գործոններ են: Ֆերմենտները կազմված են 2 կամ ավելի տարբեր մոնոմերներից և ռեստրիկցիայի ակտիվացման համար պահանջվում են AdoMet, իսկ մոդիֆիկացիայի համար՝ ATP կոֆերմենտները: Երրոդ տիպի ռեստրիկտազները կազմված են հետերոօլիգոմերային բազմաֆունկցիոնալ սպիտակուցներից: Երրորդ տիպի ռեստրիկտազները ճանաչում են 5-6 զ.ն. կազմված ասիմետրիկ հերթականությոնները և կտրում դրանք ճանաչման սայտից 25-ից 27 զ.ն. հեռավորության վրա գտնվող կետում առաջացնելով

կարճ կպչուն 5՛ ծայր: Ռեստրիկցիայի համար անհրաժեշտ է երկու՝ մեկը մյուսի նկատմամբ հակառակ ուղղված չմեթիլավորված ճանաչման սայտերի առկայություն: Mod(P08763) ռեստրիկտազի Mod ենթամասնիկը ճանաչում է դրան համապատասխանող ճանաչման սայտը և, լինելով մոդիֆիկացնող-մեթիլտրանսֆերազ, մեթիլավորում է ԴՆԹ-ի շղթաներից մեկի վրա ադենոզիլային մնացորդը N-6 դրությունում: Մեկ շղթայի մեթիլավորումը փոխանցվում է նաև հաջորդ սերունդներին և բավարար է ԴՆԹ-ի շղթայի անվտանգության պահպանման համար: Res ենթամասնիկը չունի էնզիմային ակտիվություն, բայց մասնակցում է ռեստրիկցիայի գործընթացին: Երրորդ տիպի ռետրիկտազները դասակարգվում են որպես N-6 ադենին տրանսֆերազների ենթաընտանիքի ֆերմենտներ: Դրանց մոլեկուլները կազմված են մի շարք ենթամասնիկներից՝ հերթականություն I, գրպան, AdoMet (FXGXG) կապող, հերթականություն IV, կատալիտիկ հատված (S/D/N (PP) Y/F) և այլն (А.А. Бурникель, Т.А. Бикл, 2002, С. Систла, Д.Н. Рао, 2004): Չորրորդ IV տիպի ռեստրիկտազները հիմնականում ճանաչում են մոդիֆիկացված՝ մեթիլավորված ճանաչման սայտերը՝ օրինակ E. Coli-ի McrBC և Mrr սայտերը (Эндонуклеазы рестрикции производства New England Biolabs, 06.09.2017): Հինգերորդ V տիպի ռեստրիկտազները, օրինակ, CRISPR-ի cas9-gRNA համալիրը (ճանաչող ՌՆԹ-ներ) օգտագործում են հարուցիչների ԴՆԹ-ների յուրահատուկ, ոչպալինդրոմային հերթականությունների ճանաչման համար: Ֆերմենտների փոփոխականության և ճկունության բարձր աստիճանը նպաստում է դրանց օգտագործմանը գենային ինժեներիայի խնդիրների լուծման գործընթացում: Արհեստական ռեստրիկտազ ֆերմենտներ Արհեստական ֆերմենտները սինթեզվում են բնական կամ նորովի ձևավորված ԴՆԹ-ի դոմեն ճանաչող հատվածի և որևէ ռեստրիկտազի՝ օրինակ IIS FokI նուկլեազային դոմենի միացման եղանակով:

Նորովի ձևավորված ճանաչման դոմենները կարող են լինել մեծ՝ պարունակել մինչև 36 զ.ն. և հատուկ կազմված ԴՆԹ-ի որոշակի սայտի հետ կապելու նպատակով: Գենային ինժեներիայի նպատակներով առավել հաճախ օգտագործվում են ցինկային մատների նուկլեազները: Դրանք օգտագործվում են նաև գեների կլոնավորման համար: Որպես ԴՆԹ-ների ճանաչման հատված օգտագործվում են նաև էֆեկտորների ԴՆԹ կապող TAL սայտը (Революция в биотехнологии с помощью искусственных рестрикционных ферментов, 2017): Արդեն մշակվել են ՌՆԹ-ները որոշակի սայտերում կտրող ՌՆԹ-նուկլեազներ: Դրանք նշվում են PNAzyme և պարունակում են Cu (II)-2,9-դիմեթիլֆենանտրոլին խումբը: Ֆերմենտը ընտրողական եղանակով գտնում է բարձր համապատասխանության սայտը և կտրում այն (М. Муртола, М. Венска, Р. Стремберг, 2010): Ռեստրիկտազների оգտագործման բնագավառները բազմազան են և կապված են ինչպես ՆԹ-ների հետազոտման խնդիրների, այնպես էլ գենային ինժեներիայի և թերապիայի խնդիրների հետ: Ռեստրիկտազները օգտագործվում են ՊՇՌ-ի համար նմուշների նախապատրաստման և ՊՇՌ-ի արդյունքների դետեկցիայի, գենոմների համեմատական հետազոտությունների, ԴՆԹ-ի հերթականություններում մուտացիաների բացահայտման համար և այլն: Մեկ կամ երկու ռեստրիկտազներով կտրտված ԴՆԹ-ի մոլեկուլները առաջացնում են տարբեր երկարության հատվածներ: Այս պատկերը անվանում են ռեստրիկցիոն ֆրագմենտների երկարության պոլիմորֆիզմ՝ ՌՖԵՊ-ն (RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism) և օգտագործում տեսակների գենոմային ԴՆԹ-ի հետազոտությունների համար: Որպես օրինակ քննարկենք ռեստրիկտազների օգտագործմամբ կատարվող գենոմային ԴՆԹ-ի փոփոխականության հետազոտման մեթոդը: Քանի որ տարբեր մարդկանց կամ այլ տեսակների առանձնյակների գենոմում նուկլեոտիդների հերթականությունը, լինելով կոնսերվատիվ, գրեթե նույնն է, նույնը պետք է լինեն նաև դրանց պալինդրոմների դասավորությունը որոշակի լոկուսներում: Այնուամենայնիվ բա151

վականին հաճախ հանդիպող փոքր մուտացիաները կարող են առաջացնել առանձին լոկուսներում պալինդրոմների կորուստ կամ նոր պալինդրոմների ձևավորում: Մուտացիաներով փոփոխված ԴՆԹ-ի կտրտման արդյունքում առաջանում են տարբեր չափսի ֆրագմենտներ: Այսպիսով՝ ռեստրիկտազները կտրում են նույն տեսակի տարբեր առանձնյակների գենոմային ԴՆԹ-ն պալինդրոմներում և առաջացնում տեսակին բնորոշ ԴՆԹ-ի հատվածների՝ հիմնականում նույն, բայց անհատական առանձնահատկություններ ունեցող հատվածների պատկեր: Ռեստրիկտազներով բաժանված ԴՆԹ-ի ֆրագմենտները ենթարկում են էլեկտրաֆորեզի և ստացված ու ներկված ֆորեգրամների դետեկցիայի միջոցով բացահայտում հետազոտված ԴՆԹ-ների նմանություններն ու տարբերությունները: Էուկարիոտների գենոմների մեծ քրոմոսոմները սովորաբար հետազոտվում են պուլս-էլեկտրաֆորեզի եղանակով: Նախ ԴՆԹ-ն անջատվում է բջիջներից բջջաթաղանթի քայքայման միջոցով, ապա կատարվում է ՌՆԹ-ի քայքայում: Մաքրված նմուշները մշակվում են երկար կտրող ռեստրիկտազներով: Առաջացած մակրոռեստրիկտների խառնուրդը բաժանվում է թորամասերի պուլս-էլեկտրաֆորեզի եղանակով և հետազոտվում: Ռեստրիկտազները օգտագործվում են նաև սեկվենացման համար ԴՆԹ-ի նմուշների պատրաստման և գենոմի հերթականությունների որոշման գործընթացում: Գենային թերապիայում և գենային ինժեներիայում ռեստրիկտազները օգտագործվում են վեկտորների ձևավորման համար:

2.17. ԷԼԵԿՏՐԱՖՈՐԵԶԻ ՕԳՏԱԳՈՐԾՄԱՆ ԲՆԱԳԱՎԱՌՆԵՐԸ

Էլեկտրաֆորեզը լիցքավորված մոլեկուլների կամ այլ մասնիկների բաժանման և տեղափոխման մեթոդ է, որը լայնորեն կիրառվում է ինչպես գիտական հետազոտություններում, այնպես էլ պրակտիկ՝ տնտեսական և առողջապահական բնագավառներում: Էլեկտրաֆորեզը օգտագործվում է տնտեսական աշխատանքներում՝ մակերեսների մշակման և պաշտպանող շերտով պատման համար: Օգտագործման տնտեսական բնագավառներն են քիմիական արտադրությունը, մեքենաների և այլ մակերեսների ներկումը, մառախուղի և ծխի կոնդենսացումը, քիմիական նյութերի բաժանումը թորամասերի: Բժշկությունում էլեկտրաֆորեզը կիրառվում է դեղամիջոցների նպատակային ներմուծման և էլեկտրական դաշտի միջոցով նյարդային և հումորալ համակարգերի գործունեության կարգավորման նպատակով: Կենսաքիմիական և մոլեկուլային հետազոտություններում էլեկտրաֆորեզը կիրառվում է սպիտակուցների, նուկլեինաթթուների, այլ մակրոմոլեկուլների բաժանման, քանակական և որակական դետեկցիայի համար: Մեթոդը կիրառական մեծ նշանակություն ունի կենսաքիմիական, մոլեկուլային կենսաբանության, պոպուլյացիաների գենետիկայի, կլինիկական ախտորոշման հարցերի լուծման համար: Վերջին տարիներին ձևավորվել են հետազոտման նոր մեթոդներ, որոնց հիմքում ընկած են էլեկտրաֆորեզի մեխանիզմները, դրանք են՝ իմունաէլեկտրաֆորեզը, բջջաթաղանթի կառուցվածքային սպիտակուցների հետազոտման մեթոդները, պուլս-էլեկտրաֆորեզի կիրառմամբ մակրոմոլեկուլների կազմի, կառուցվածքի և փոփոխականության հետազոտման եղանակները և այլն: Էլեկտրաֆորեզի կատարման մեթոդներն ու սարքավորումները մշտապես բարեփոխվում են, ընդլայնվում է ինչպես օգտագործվող կրիչների, այնպես էլ դետեկցիայի համար կիրառվող նյութերի ցանկը: Էլեկտրաֆորեզի կատարման նորագույն մեթոդներից է միկրոչիպային տեխնոլոգիան:

ԳԼՈՒԽ 3. ՊՇՌ-Ն ԵՎ ԴՐԱ ԿԻՐԱՌՄԱՆ ԲՆԱԳԱՎԱՌՆԵՐԸ

(Polymerase Chain Reaction, PCR)

3.1. ՌԵԱԿՑԻԱՅԻ ԸՆԴՀԱՆՈՒՐ ԲՆՈՒԹԱԳԻՐԸ

Կենսաբանամոլեկուլային ուսումնասիրությունների խնդիրն է կենսաբանական նյութի հետազոտումը: Այս խնդիրը լուծվում է հետազոտական մեթոդների մի ամբողջ համալիրի միջոցով, որի օգտագործմամբ կատարվում է թիրախ նյութի անջատում, բացահայտում, իդենտիֆիկացիա, որակական և քանակական բնութագրում: Սովորաբար հետազոտման նպատակն է ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի մոլեկուլների, առանձին գեների՝ դրանց կոդավորող և չկոդավորող հատվածների նուկլեոտիդային կազմի և դրա փոփոխությունների ուսումնասիրությունը: Այսինքն՝ մեթոդները հիմնվում են ԴՆԹ-ի կազմի և դրա փոփոխությունների հետազոտման վրա: ԴՆԹ-ի ախտորոշման հիմնական խնդիրն է դրա անհրաժեշտ քանակի ստացումը և ապա հետազոտումը տարբեր՝ ռեստրիկցիայի, հիբրիդացման և սեկվենացման եղանակներով: Առաջին փուլը՝ հետազոտվող ԴՆԹ-ի կամ ՌՆԹ-ի անհրաժեշտ քանակի ստացումը այժմ կատարվում է ՊՇՌ՝ պոլիմերազային շղթայակցող ռեակցիայի միջոցով: Մեթոդի հիմքում ընկած է ամպլիֆիկացիայի պրոցեսը, որի ընթացքում ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի շղթաների վրա կոմպլեմենտարության սկզբունքի համաձայն, եռաֆոսֆոնուկլեոտիդների յուրահատուկ հատկությունների շնորհիվ և ԴՆԹ պոլիմերազ ֆերմենտների ազդեցությամբ սինթեզվում է կոմպլեմենտար շղթա՝ կատարվում է ՆԹ-ի քանակի կրկնապատկում: Այժմ ՊՇՌ ռեակցիան, շնորհիվ բազմաթիվ նոր տեխնոլոգիաների, ձեռք է բերել նոր խնդիրներ և կիրառման բնագավառներ: Այսպես՝ ՊՇՌ-ի օգտագործմամբ կատարվում են ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի շղթաների տարբեր փոփոխություններ՝ մուտացիաների ներմուծումներ, հիբրիդային մոլեկուլների ձևավորում, շղթաների կառուցվածքի վերափոխումներ: ՊՇՌ մեթոդը կիրառվում է նաև նոր գեների անջատման, գեների կլոնավորման, անձերի ու տեսակների թեստավորման և ժառանգական ու վարակիչ հիվանդությունների ախտորոշման համար: Այս եղա154

նակով ուսումնասիրվում են տեսակների, ռասսաների և ցեղերի ժառանգական նյութի հոմոլոգիան, դրանց ֆիլոգենեզի մեխանիզմներն ու բարեկամական կապերը: Չնայած նրան, որ սկսած 1970 թ. գիտական գրականությունում քննարկվում է ԴՆԹ-ի կլոնավորման մեթոդի օգտագործումը մեծ քանակությամբ նյութի ստացման համար, մեթոդի փաստացի առաջարկը կատարել է 1985 թ. ամերիկացի կենսաքիմիկոս Կերրի Մուլլիսը: Այս մեթոդը թույլ էր տալիս ստանալ ԴՆԹ-ի բազմաթիվ պատճեններ՝ դրա շղթաների բազմակի անգամ կրկնվող ամպլիֆիկացիաների միջոցով: Ամպլիֆիկացիաները կատարվում էին ԴՆԹ-պոլիմերազ ֆերմենտով, հաջորդական, բազմաթիվ անգամ կրկնվող առանձին փուլերում: Աշխատանքի այս եղանակը պահանջում էր նույն փորձի նորանոր կրկնություններ և մարդու ակտիվ մասնակցություն: Բայց արդյունքում ստացվում էր ԴՆԹ-ի նմուշի հետազոտման համար անհրաժեշտ քանակ: 1993 թ. Կերրի Մուլլիսը այս մեթոդի մշակման համար ստացավ Նոբելյան մրցանակ: 1990 թ. Roch Molecular Systems կազմակերպությունը գնեց ՊՇՌի վկայագիրը և արդեն 1995 թ. սկսեց առաջին ավտոմատ սարքի արտադրությունը: Այսուհետև ՊՇՌ ռեակցիան կատարվում էր մեքենայացված եղանակով, և դրա փուլերը հաջորդում էին մեկը մյուսին առանց մարդու միջամտության՝ ավտոմատ ռեժիմով: ՊՇՌ-ի ավտոմատիզացման համար շատ կարևոր գործոն դարձավ taq-ԴՆԹ պոլիմերազ ֆերմենտի բացահայտումը, քանի որ ավտոմատ ռեժիմում պահանջվում էին բարձր ջերմաստիճանի նկատմամբ կայուն նյութեր, իսկ այս ֆերմենտը հայտնագործվեց ջերմադիմացկուն, գեյզերներում ապրող բակտերիաների բջիջներում: taqԴՆԹ պոլիմերազ ֆերմենտի առանձնահատկությունն այն է, որ դա չի կորցնում ակտիվությունը եռման ջերմաստիճանի պայմաններում, իսկ աշխատանքային բարենպաստ ջերմաստիճանը 72 ºС-ն է: Մեթոդի պարզությունը և արդյունավետությունը, կատարման բարձր արագությունը նպաստեցին դրա արագ տարածմանը և օգտա-

գործմանը ոչ միայն գիտական, այլև առողջաբանական նպատակներով: Այժմ ՊՇՌ-ն ամենատարածված և արագ զարգացող տեխնոլոգիաներից մեկն է: ՊՇՌ-ի միջոցով ուսումնասիրվում են բոլոր տաքսոնների գենոտիպերը՝ վիրուսից մինչև մարդ, ախտորոշվում են ժառանգական և վարակիչ հիվանդությունները, մշակվում են բուժման տեխնոլոգիաներ: Մեթոդի զարգացմանը զուգահեռ հետազոտությունների արժեքը նվազում է, իսկ օգտագործման բնագավառները՝ ընդլայնվում:

3.2. ԴՆԹ-Ի ԿՐԿՆԱՊԱՏԿՄԱՆ ՄԵԽԱՆԻԶՄԸ

ՊՇՌ մեթոդով կրկնապատկվում է ԴՆԹ-ն՝ ժառանգական ինֆորմացիայի գրեթե միակ կրողը: ԴՆԹ-ի պոլիմերային մոլեկուլը կազմված է 4 դեզօքսինուկլեոտիդներից և կառուցված է որպես երկու կոմպլեմենտար շղթաների պարուրաձև ոլորված աժդահա ժապավեն: Շղթաները հակազուգահեռ են՝ ունեն հակառակ ուղղվածություն: Առաջին շղթայի 5՛ ծայրին կոմպլեմենտար է երկրորդ շղթայի 3՛ ծայրը: ԴՆԹ-ի կրկնապատկման հնարավորությունը՝ ռեպլիկացիան, դրա մոլեկուլի երկշղթա կառուցվածքի արդյունքն է: Ռեպլիկացիան կատարվում է միտոտիկ ցիկլի հանգստի փուլի սինթետիկ ենթափուլում, երբ մայրական մոլեկուլի երկու շղթաները ապաոլորվում են տոպոիզոմերազ ֆերմենտների ազդեցությամբ, հեռանում իրարից և յուրաքանչյուրի վրա սինթեզվում է կոմպլեմենտար զույգը. այսպիսով՝ մեկ մայրական մոլեկուլի հիման վրա ձևավորվում են զույգ դուստր մոլեկուլներ: Կրկնապատկման այս եղանակը կիսակոնսերվատիվ է, քանի որ ամեն նոր ԴՆԹ կազմված է մեկ մայրական և մեկ նոր՝ մայրականին կոմպլեմենտար դուստր շղթաներից: Էուկարիոտների ամեն մի քրոմոսոմի ԴՆԹ-ի մոլեկուլի կրկնապատկումը սկսվում է մի քանի կենտրոններում և շարունակվում մինչև հարևան կրկնապատկման կենտրոն կամ մոլեկուլի ծայրը: Ամեն ինքնուրույն կրկնապատկվող հատված կոչվում է ռեպլիկոն: Կրկնապատկումը սկսվում է հատուկ պրայմերներից՝ մերաններից, որոնք սինթեզի ինիցիացիայի առաջացման

անհրաժեշտ գործոններ են: Պրայմերները կազմված են 100-ից 200 նուկլեոտիդներից: ԴՆԹ պոլիմերազ ֆերմենտը սկսում է պոլիմերիզացումը, եթե ապաոլորված, բաժանված շղթայի վրա առկա է փոքր, պրայմերով առաջացվող երկշղթա հատված՝ ստարտի բլոկ: Կարևոր պայման է նաև այն, որ ԴՆԹ պոլիմերազ ֆերմենտը միացնում է պրայմերին նոր նուկլեոտիդը միայն 5՛-3՛ ուղղությամբ: Նոր նուկլեոտիդի միացումը պրայմերին կատարվում է պրայմերի վերջին նուկլեոտիդի դեզօքսիռիբոզի 3՛ դիրքում գտնվող և OH- խմբի հետ կապվող ածխաջրի և միացվող նուկլեոտիդի եռաֆոսֆատային ռադիկալի առաջին ֆոսֆորի միջև: Արդյունքում ձևավորվում է միջնուկլեոտիդային կապ, իսկ երկու ֆոսֆորային խմբերը անջատվում են (նկ. 3.1):

o1

ն= P- 0

?-

ն- P- 0

b-

PPL

ո

..

3' նH

T

~ ~ ~ ~

3'~

Նկ. 3.1. ԴՆԹ-ի պոլիմերացման ռեակցիայի սխեման (Н.В. Цымбаленко, https://www.herzen.spb.ru/img/files/zoolog/Lekcii_3,_4_Replikaciya__DNK.pdf):

Բոլոր պրոկարիոտների ԴՆԹ-ի կենսասինթեզը սկսվում է ռեպլիկացիայի սկզբնակետ կոչվող origin of replication կետից, որի անվանումը պարունակում է ori տառերը: Տարբեր տեսակների ռեպլիկացիայի սկզբնակետը նշվում է ori գումարած տեսակի անվան տառը, օրինակ` Escherichia coli-ի սկզբնակետը նշվում է оriC: ԴՆԹ-ի ori (origin of replication) հատվածը կազմված է 245 ն.զ-ներից: Նուկլեոտիդային հերթականությունը տարբեր տեսակների մոտ տարբեր է, բայց բոլոր դեպքերում հարուստ է ԱԹ նուկլեոտիդներով և դրա շնորհիվ հեշտ է հալեցվում՝ բաժանվում առանձին շղթաների: оri հերթականության կազմում բացահայտվել են ակտիվության երկու

կենտրոններ. առաջինը կապում է ռեպլիկացիան ակտիվացնող ինիցիացիայի գործոնը՝ DnaA-ն, իսկ երկրորդը ԴՆԹ-ի զսպանակի ապաոլորման DUE (DNA unwinding element) կենտրոնն է: оriC-ի կազմում DUE կենտրոնը կազմված է 4 անգամ կրկնվող 9-ական զ.ն-ից, իսկ DnaA-ն կապող կենտրոնը կազմված է 3 անգամ կրկնվող 13 զ.ն-ից: DnaA սպիտակուցը բնորոշ է բակտերիաների տարբեր տեսակներին և կատարում է դրանց քրոմոսոմների ռեպլիկացիայի ակտիվացման ֆունկցիան: DnaA-ն ճանաչում է ori հերթականությունը և կապվում 4 անգամ կրկնվող 9-ական զ.ն. հերթականությունների հետ, նպաստում ոլորված, ԱԹ նուկլեոտիդներով հարուստ ori հատվածների ապաոլորմանը և հելիկազ՝ DnaВ ֆերմենտի ներգրավմանը ապաոլորված հատվածի շղթաների միջև (նկ. 3.2): Հելիկազ ֆերմենտը կտրում է կոմպլեմենտար շղթաների միջև առկա ջրածնային կապերը և առաջացնում ռեպլիկացիայի ճանկ՝ երկճյուղ: ԴՆԹ-ի մոլեկուլի վրա ձևավորվում են փուչիկաձև կենտրոններ: Միաշղթա հատվածները պատրաստ են կրկնապատկման: Այսպիսով՝ ձևավորված ֆերմենտային բարդ համալիրը, որը կազմված է տոպոիզոմերազ, հելիկազ, պրայմազ և ԴՆԹ-պոլիմերազ ֆերմենտներից, համատեղ և համակարգված գործունեությամբ իրականացնում է ԴՆԹ-ի երկու մայրական շղթաների վրա կոմպլեմենտար դուստր շղթաների սինթեզը և նոր՝ դուստր մոլեկուլների ձևավորումը: Նշենք, որ սինթեզվող շղթաներից մեկի ուղղությունը համապատասխանում է ԴՆԹ պոլիմերազ ֆերմենտի ակտիվության ուղղությանը՝ 5՛-3՛, և այս շղթայի վրա կենսասինթեզը իրականացվում է անընդհատ եղանակով: Այս շղթան կոչվում է ուղղորդող: Չնայած երկրորդ սինթեզվող շղթայի ուղղությունը հակառակն է՝ 3՛-5՛, դրա կրկնապատկումը, շնորհիվ ռեպլիկացիայի ճանկում ձևավորվող պրայմերների, նույնպես կատարվում է 5՛-3՛ ուղղությամբ առանձին հատվածներով: Երկրորդ շղթան կոչվում է ուշացող: Ռեպլիկացիայի ճանկը ֆերմենտային համալիրի ազդեցությամբ շարժվում է մայրական քրոմոսոմով և հեռացնում շղթաները միմյան158

ցից: Առաջին շղթայի սինթեզը կատարվում է անընդհատ ֆերմենտային համալիրի շարժին զուգահեռ: Երկրորդ շղթայի որոշակի միաշղթա հատվածի առաջացումից հետո ֆերմենտային համալիրի պրայմազ ֆերմենտը սինթեզում է դրա վրա կարճ, ԴՆԹ-ի հատվածին կոմպլեմենտար ՌՆԹ պրայմեր, իսկ ԴՆԹ պոլիմերազը, շարունակելով պրայմերը, սինթեզում է ԴՆԹ-ի միաշղթա հատվածին կոմպլեմենտար զույգ շղթան:

Նկ. 3.2. DnaA սպիտակուցի ազդեցությունը ԴՆԹ-ի ռեպլիկացիայի ակտիվացման պրոցեսում (https://www.herzen.spb.ru/img/files/zoolo g/Lekcii3,_4_Replikaciya__DNK.pdf):

Սինթեզված հատվածը կոչվում է Օկազակիի ֆրագմենտ: Ռեպլիկացիայի հաջորդ փուլում ԴՆԹ-ի շղթաների ճանկի խորքում ձևավորվում են նոր միաշղթա հատվածներ և ուշացող շղթայի վրա սինթեզվում է հաջորդ՝ 2-րդ պրայմերը (նկ. 3.3): ԴՆԹ պոլիմերազը շարունակում է երկրորդ պրայմերը մինչև առաջին պրայմերի սկզբնակետը: Այստեղ ԴՆԹ պոլիմերազ ֆերմենտի հատուկ տարբերակը փոխում է առաջին պրայմերի ՌՆԹ-նուկլեոտիդները ԴՆԹ-նուկլեոտիդներով:

5' 3'

5' Շ']րածtր~ հեն, Շ']րածtր~ րաժածո,ն հեt~~ագո~ ~ otնթ~~աց ա

5'

րաdա(ո16lt

otնթl'otjաց~ա

3'

llllllllllllll

3' 5'

3' երկշգրա նա11ա~ած "I\Aa

5' 3'

Նկ. 3.3. ԴՆԹ-ի ռեպլիկացիայի հաջորդական փուլերի սխեման (https://www.herzen.spb.ru/img/files/zoolog/Lekcii_3,4_Replikaciya__DNK.pdf):

Ուշացող շղթայի վրա առաջին և երկրորդ Օկազակիի ֆրագմենտների միջև ձևավորվում է միաշղթա կտրվածք, որը կարվում է լիգազ ֆերմենտով: Կենսասինթեզը շարունակվում է նույն եղանակով՝ այնքան ժամանակ, մինչև ամբողջ ռեպլիկոնի երկրորդ շղթան կրկնապատկվի (նկ. 3.4): Առաջին շղթան կրկնապատկվում է ռեպլիկոնի սկզբնակետից մինչև վերջնակետը՝ նույն ֆերմենտի անընդհատ գործունեության ներքո: Ռեպլիկացիայի համալիրի բոլոր ֆերմենտները փոխկապված են և առաջացնում են միասնական շարժվող և գործող ամբողջական համալիր (նկ. 3.4): Արդյունքում երկու՝ ուղղորդող և ուշացող շղթաների կրկնապատկումները կատարվում են միասնական, նույն արագությամբ և ավարտվում են նույն ժամանակում նույն կետում՝ ռեպլիկոնի ծայրում:

'lufa Lկոtt,ilերiագ I I 1-t, 11t,ilերio

'lufa հt,րiագ l.jաil ոոLկոt,գոilերiագ

Ol.jագաl.jt,t, ~[lագilենUl

O 2011 PN,sօո Էdսcaliօl\ ո:.

Lt,գագ

Նկ. 3.4. ԴՆԹ-ի կրկնապատկման սխեման: Պրոցեսին մասնակցող ֆերմենտային համալիրը շարժվում է մայրական ԴՆԹ-ի վրա ձևավորված ճանկում և առաջացնում միաշղթա հատվածներ: Զուգահեռ միաշղթա հատվածների վրա կատարվում է կրկնապատկում (http://www.myshared.ru/slide/467021/):

3.3. ՊՇՌ ՄԵԹՈԴԻ ԿԱՏԱՐՄԱՆ ՍԿԶԲՈՒՆՔՆԵՐԸ

ԴՆԹ-ի կրկնապատկման համար անհրաժեշտ բարդ ֆերմենտային համալիրի համակարգված գործունեության ամբողջ պրոցեսի իրականացումը արտաբջջային պայմաններում գրեթե անհասանելի է և կապված է բարդագույն տեխնիկական խնդիրների հետ: Այդ պատճառով ԴՆԹ-ի in vitro կրկնապատկման համար անհրաժեշտ է, օգտագործելով ԴՆԹ պոլիմերազ ֆերմենտի բնական ակտիվությունը, մշակել մեթոդներ, որոնք թույլ կտան շրջանցել կրկնապատկման պրոցեսի դժվար իրականացվող փուլերը՝ փոխանակել դրանց իրականացման ֆերմենտային մեխանիզմը այլ գործոններով և տեխնոլոգիաներով ու ապահովել սպասվող արդյունքը՝ ԴՆԹ-ի ռեպլիկացիան:

Ինչպես ասվել է, ԴՆԹ-ի կրկնապատկման համար անհրաժեշտ է տոպոիզամերազ և հելիկազ ֆերմենտներով իրականացվող ԴՆԹ-ի զսպանակի ապաոլորում և շղթաների բաժանում, այսինքն՝ մոլեկուլի բնափոխում: Արտաբջջային պայմաններում պոլիմեր մոլեկուլի բնափոխումը իրականացվում է ջերմային ռեժիմի փոփոխման և միջավայրում հարմար pH-ի ապահովման եղանակով: Հաջորդ անհրաժեշտ գործոնի՝ պրայմերի սինթեզը բնական պայմաններում կատարում է պրայմազ ֆերմենտը, in vitro պայմաններում պրայմերները սինթեզվում են նախապես, և ռեակցիայի պրոցեսում կապվում միաշղթա ԴՆԹ-ի մատրիցին ջերմային պայմանների հերթական փոփոխման միջոցով: Այս պրոցեսը կոչվում է վառոցք: Այսպիսով՝ ֆերմենտային ազդեցությունները in vitro պայմաններում փոխարինվում են ֆիզիկական և մի շարք քիմիական պայմանների կարգավորման եղանակով, օրինակ՝ իրականացվում են ջերմաստիճանի փուլային փոփոխություններ: Իր հերթին ռեակցիայում բարձր ջերմաստիճանի օգտագործումը ստեղծում է որոշակի խնդիր՝ ջերմադիմացկուն ԴՆԹ պոլիմերազ ֆերմենտի անհրաժեշտություն: Հաշվի առնելով ներկայացված նախապայմանները՝ ՊՇՌ-ի կատարման

համար

առաջարկվեց

մեթոդ,

որը

բավարարում

է

առաջադրված պահանջները և ապահովում ԴՆԹ-ի կրկնապատկում բազմաթիվ կրկնվող ցիկլերով ավտոմատ ռեժիմում: ՊՇՌ-ի ռեակցիայի պրոցեսում ՆԹ-ի կրկնապատկումը կատարվում է փորձանոթներում բազմաթիվ՝ նախապես որոշված թվով ցիկլերի ընթացքում: Յուրաքանչյուր ցիկլ կրկնապատկման մեկ ռեակցիա է: Փորձանոթում ցիկլերի և դրանց ընթացքում կատարվող ռեակցիաների ու պրոցեսների հերթականությունը կարգավորվում է ջերմաստիճանի փոփոխման եղանակով: Փորձանոթում եղած նյութերի խառնուրդը կոչվում է ինկուբացիոն խառնուրդ և պարունակում է կենսասինթեզի համար անհրաժեշտ բոլոր նյութերն ու ԴՆԹ պոլիմերազ ֆերմենտը: Ջերմաստիճանի բարձրացումը մինչև 93-95 ºС առաջացնում է ԴՆԹ-ի նմուշի բնափոխում՝ շղթաների ապաոլորում և հալեցում:

Հաջորդ փուլում ջերմաստիճանն իջեցվում է մինչև 50-65 ºС, և կատարվում է պրայմերների միացում կոմպլեմենտար շղթաների հակառակ ծայրերին՝ վառոցք: Երրորդ փուլում ջերմաստիճանը բարձրացվում է մինչև ջերմադիմացկուն ֆերմենտի աշխատանքի համար նպաստավոր 70-72 ºС, և շղթաները կրկնապատկվում են: Առաջին ցիկլը ավարտվում է: Այնուհետև սկսվում է երկրորդ ցիկլը: Բազմաթիվ ցիկլերի արդյունքում ԴՆԹ-ի թիրախ հատվածի քանակը դառնում է բավարար ինչպես հետազոտման, այնպես էլ կենսատեխնոլոգիական կիրառման համար: ԴՆԹ-ի կրկնապատկվող հատվածը ընտրելու համար պրայմերները պատրաստվում են հետազոտվող հատվածի սահմանին գտնվող հերթականություններին կոմպլեմենտար՝ մեկը սկզբնակետին, մյուսը վերջնակետին, ինչի շնորհիվ կրկնապատկվում է մայրական ԴՆԹ-ի միայն թիրախ, նախաընտրված հատվածը: Ինչպես արդեն նշվել է, կրկնապատկման կամ ամպլիֆիկացիայի ամեն ցիկլ կատարվում է երեք փուլերով՝ տարբեր ջերմաստիճանների պայմաններում: 1-ին փուլ՝ բնափոխում. կատարվում է 93-95 ºС պայմաններում, 30-40 վրկ ընթացքում: 2-րդ փուլ՝ վառոցք (պրայմերի միացում): Յուրաքանչյուր պրայմերի հատուկ է որոշակի ջերմաստիճան, բայց, ընդհանուր առմամբ, դա տատանվում է 50-65 ºС սահմաններում: Պրայմերները միանում են երկու շղթաների 5՛ ծայրերին՝ ամեն մեկին համապատասխան, կրկնապատկվող հատվածի հարևանությամբ: Փուլի տևողությունը 10-60 վայրկյան է: 3-րդ փուլ՝ ԴՆԹ-ի շղթաների կրկնապատկումը կատարվում է 70-72 ºС պայմաններում: Յուրաքանչյուր շղթայի վրա 5՛ ծայրում միացած պրայմերից սկսվող կրկնապատկումը կատարվում է ԴՆԹ պոլիմերազ ֆերմենտի ազդեցությամբ՝ 5՛-ից 3՛ ուղղությամբ: Փուլի տևողությունը 20-40 վայրկյան է:

.,,mt-կ

5'

3'

5'

-

.,

3-¾

3' 5'

Նկ. 3.5. Երրորդ փուլում ԴՆԹ պոլիմերազ ֆերմենտը շարունակում է պրայմերը և կրկնապատկում թիրախ հատվածը (http://www.myshared.ru/slide/467021/):

ԴՆԹ-ի սինթեզված նոր հատվածները դառնում են մատրիցներ հաջորդ փուլի համար (նկ. 3.6): ~ ' 3' ~ 5' 1 ~ 3'

I

-

iiiii"ii,i,iidi&3'

lյlաQա Q ոL ~ .. 9կ°C

, 3'

-

3'

5' 3'

ծ'

,Վ \,. 2 LկաtMt

'lեuաlllորաgt,ա 2

uոր gt,lո

Նկ. 3.6. Կրկնապատկման առաջին փուլում սինթեզվող 1-ին շղթայի պատճեն սկսվում է 5՛ ծայրում միացած պրայմերից և շարունակվում մինչև նմուշ ԴՆԹ-ի 3՛ ծայրը: Երկրորդ շղթան ունի հակառակ ուղղություն. այն նույնպես սկսվում է 5՛ ծայրի կողմում գտնվող պրայմերից, բայց դրա տեղը նմուշ-շղթայի վրա կոմպլեմենտար է առաջին շղթայի 3՛ ծայրին: Երկու շղթաների վրա կենսասինթեզը ընթանում է 5՛-3՛ ուղղությամբ՝ անընդհատ եղանակով: Երկու շղթաները կրկնապատկվում են միաժամանակ և զուգահեռ (http://www.niipfm.nizhgma.ru/_resources/ directory/130/common/Lukyanov_2011_NN_lection3.pdf):

Սովորաբար կրկնապատկվող հատվածի չափսերն ընտրվում են ըստ հետազոտման խնդրի, և դրանց չափերը ավելի փոքր են, քան բջջից անջատված ԴՆԹ-ի հատվածի երկարությունը: Անհրաժեշտ

հատվածի կրկնապատկման համար նախապես սինթեզվում են պրայմերներ, որոնք, լինելով կոմպլեմենտար թիրախ հատվածի ծայրին նախորդող հերթականությանը, միանում են դրան և նշում կրկնապատկվող հատվածի սկզբնակետը: Կրկնապատկման երկրորդ փուլում ամեն հատվածի վրա պրայմերի միացումը կատարվում է երկրորդ ծայրի հարևանությամբ և նշում դրա սկզբնակետը:

Նկ. 3.7. ՊՇՌ-ի արդյունավետության սխեման. 1 - ՊՇՌ-ի երկրորդ փուլի սխեման: Մի կողմից պրայմերով սահմանափակված հատվածը սահմանափակվում է հակառակ ծայրում երկրորդ պրայմերով, և կրկնապակվում է միայն ամպլիկոնի հատվածը, 2 - պատճենների քանակի ավելացումը յուրաքանչյուր ցիկլի վերջում (http://www.niipfm.nizhgma.ru/ _resources/directory/130/common/Lukyanov_2011_NN_lection3.pdf):

Այսպիսով՝ երկրորդ ցիկլի վերջում ձևավորվում է կրկնապատկվող նպատակային հատվածը՝ ամպլիկոնը: Ամպլիկոնը, լինելով ավելի կարճ, քան նմուշի շղթան, ավելի հեշտ է ներգրավվում կենսասինթեզի պրոցեսի մեջ, և դրա կրկնապատկման ինտենսիվությունն ավելի բարձր է (նկ. 3.7): Հաջորդ ցիկլերում խառնուրդում կուտակվում են ամպլիկոնները: Քանակը որոշվում է 2n բանաձևով, որտեղ n-ը ցիկլերի քանակն է: Եթե փորձի սկզբում ինկուբացիոն խառնուրդում առկա էր ԴՆԹ-ի միայն մեկ մոլեկուլ 38-40 ցիկլ անց խառնուրդում կուտակվում են 108 պատճեններ, որոնք բավարար են թիրախ հատվածի հետազոտման համար: Ավտոմատ ՊՇՌ-ն կատարում են հատուկ սարքի՝ ամպլիֆիկատորի մեջ, որը ծրագրվում է ջերմաստիճանային ցիկլերի որոշված քանակով կրկնողությունների համար: 3.3.1. Ամպլիֆիկացիայի կատարման համար անհրաժեշտ նյութերը և սարքերը 1. Ամպլիֆիկատոր: 2. Հետազոտվող հերթականությունը պարունակող ԴՆԹ-ի նմուշ: 3. Պրայմերներ, որոնք սովորաբար կազմված են 20-ից 30 ն. և կոմպլեմենտար են հետազոտվող հատվածի զույգ շղթաների 5՛

ծայրերից

առաջ

գտնվող

հերթականությանը:

Պրայմերի

ճշգրիտ որոշումը շատ կարևոր է կատարվող կրկնապատկման յուրահատկության պահպանման համար: 4. Դեզօքսիռիբոնուկլեոտիդեռաֆոսֆատների

խառնուրդ,

որն

անհրաժեշտ է նոր սինթեզվող շղթայի առաջացման համար: Խառնուրդը պետք է պարունակի 4 տեսակի դեզօքսինուկլեոտիդեռաֆոսֆատների հավասար քանակներ՝ 200-600 մկմ: 5. Տագ- ԴՆԹ պոլիմերազ ֆերմենտ, որը երկարացնում է պրայմերը՝ դրա ծայրին միացնելով նորանոր, զույգ շղթայի նուկլեոտիդային հերթականությանը կոմպլեմենտար նուկլեոտիդներ:

6. Բուֆերային լուծույթ՝ ռեակցիոն խառնուրդ, որը պարունակում է ֆերմենտի ակտիվությունն ապահովող Mg2+-ի իոններ և պահպանում լուծույթի pH-ի 6,8-7,8 մակարդակը: 3.3.2. ՊՇՌ-ի կատարման կարգը Առաջին փուլում պատրաստվում է ռեակցիոն խառնուրդ. 1. Անջատված ԴՆԹ-ի նմուշ՝ նախապատրաստված ամպլիֆիկացիայի համար, որի կազմում պետք է լինի ԴՆԹ-ի նպատակային հատվածը, օրինակ՝ վիրուսի կամ բակտերիայի ԴՆԹ: ԴՆԹ-ի բացակայությամբ ռեակցիան տեղի չի ունենում: 2. Բուֆերային լուծույթ: Անիոնների և կատիոնների խառնուրդ, որն ապահովում է ռեակցիայի լավագույն ընթացքը և պահպանում pHի ամենանպաստավոր մակարդակը: 3. Ֆերմենտի ակտիվության համար անհրաժեշտ Mg2+ իոններ: 4. Երկու պրայմեր՝ կազմված 18-30 նեւկլեոտիդներից, կոմպլեմենտար են ԴՆԹ-ի նմուշի շղթաների 3՛ ծայրերին: Պրայմերները պետք է լինեն յուրահատուկ. ամենակարևոր մասը դրանց 3՛ ծայրն է, որից սկսվում է կրկնապատկումը: Եթե կոմպլեմենտարության մակարդակը ցածր է, կարող են կատարվել նաև այլ հատվածների կրկնապատկումներ, և կառաջանան այլ ԴՆԹ-ի պատճեններ: Այս դեպքում ռեակցիայի զգայունության մակարդակը նվազում է: Նվազում է նաև նպատակային նյութի քանակի աճը ինչպես պրայմերների կողմնակի օգտագործման, այնպես էլ դեզօքսիռիբոնուկլեոտիդեռաֆոսֆատների ոչ նպատակային ծախսի պատճառով: Պրայմերների կազմում բացառվում է կոմպլեմենտար հատվածների առկայությունը, որոնց պատճառով վառոցքի ժամանակ կարող են առաջանալ դուպլեքսներ կամ հանգույցներ: Ռեակցիայի հաջող ընթացքի ապահովման համար օգտագործվող երկու պրայմերների վառոցքի օպտիմալ ջերմաստիճանը պետք է տարբերվի ամենաշատը 5 ºC-ով և լինի ցածր կամ հավասար ԴՆԹ պոլիմերազի ակտիվության օպտիմալ ջերմաստիճանին: Այն դեպքում,

երբ այս ջերմաստիճանները մոտ են, վառոցքի և էլոնգացիայի փուլերը կարող են միավորվել: Շատ կարևոր է պրայմերների կազմում GC-նուկլեոտիդների բարձր՝ 40-60 % խտությունը և դրանց առկայությունը 3՛ ծայրում, որի շնորհիվ երեք ջրածնային կապերի առկայությունը կապահովի նմուշ*պրայմեր կապի բարձր կայունություն: Պրայմերի միացման հատվածը պետք է հեռու լինի մուտացիաների կամ դուպլեքսների առաջացման տեսակայուրահատուկ լոկուսներից, քանի որ այդ հատվածների հանդիպման դեպքում պրայմերը չի միանում շղթային՝ կոմպլեմենտար չէ, և առաջացնում է շեղված՝ ԴՆԹի բացակայության պատկեր: 5. 4 դեզօքսինուկլեոտիդֆոսֆատների՝ դՆԵՖ-ների խառնուրդ, որն անհրաժեշտէ ԴՆԹ-ի շղթաների սինթեզի համար: 6. Ջերմադիմացկուն ԴՆԹ պոլիմերազ. հաճախ Taq պոլիմերազը (անջատված է Thermus aquaticus բակտերիաներից): ԴՆԹ պոլիմերազը շարունակում է պրայմերի 3՛ ծայրը և կոմպլեմենտարության սկզբունքի համաձայն սինթեզում երկրորդ շղթան: Կատարվող ռեակցիայի էֆեկտիվության վերահսկման կամ ստացվող արդյունքների դետեկցիայի համար խառնուրդ կարող են ներմուծվել նաև այլ բաղադրիչներ: Ներքին ստուգիչ նյութ՝ մեծ չափսերի օտար ԴՆԹ-ն իր պրայմերներով, որի կրկնապատկման բնույթը թույլ է տալիս գնահատել տարբեր փորձանոթներում կատարվող ռեակցիայի էֆեկտիվության մակարդակը: Հատուկ ԴՆԹ զոնդեր՝ ֆլուորեսցենտ կամ ռադիոակտիվ նշադիրներ, որոնք, միանալով ռեակցիայում առաջացող շղթաներին՝ ամպլիկոններին, նշում են դրանք և օգնում բացահայտել դետեկցիայի փուլում: Ռեակցիոն խառնուրդի գոլորշացումը արգելակելու համար խառնուրդի կազմ են ներմուծվում գոլորշացման բարձր մակարդակ ունեցող ճարպեր, օրինակ՝ վազելինի ճարպ, բայց եթե ամպլիֆիկա168

տորի կափարիչ ունի սառեցման հնարավորություն, ապա ճարպերի ավելացումը ավելորդ է: Ինչպես արդեն նշվել է, ամեն մի նոր նուկլեոտիդի միացումը ԴՆԹ-ի շղթային առաջացնում է պիրոֆոսֆատի անջատում, և դրա կուտակումը ռեակցիոն խառնուրդում դանդաղեցնում է պոլիմերացման պրոցեսը: Պիրոֆոսֆատազ ֆերմենտի ներմուծումը ռեակցիոն խառնուրդ ակտիվացնում է պիրոֆոսֆատի հիդրոլիզն ու օրտոֆոսֆատի ձևավորումը և դրանով իսկ բարձրացնում ռեակցիայի արդյունավետության մակարդակը: Երկրորդ փուլում պատրաստի ռեակցիոն խառնուրդը ներմուծվում է ամպլիֆիկատորի կամ թերմոցիկլերի մեջ: Առաջին ամպլիֆիկատորներն ըստ էության ծրագրավորվող ջերմապահարաններ էին: Ամպլիֆիկատորում կատարվում են 30-40 ջերմային ցիկլերի կրկնողություններ: Յուրաքանչյուր ցիկլ կազմված է 3 փուլերից (նկ. 3.6): Ժամանակակից ամպլիֆիկատորներն ավելի բարդ են և թույլ են տալիս կիրառել բարդ ծրագրեր, այդ թվում՝ «տաք ստարտով», Touchdown «սանդղակային» ՊՇՌ և այլն: Արդեն արտադրվում են ֆլուորեսցենտ դետեկտորներ պարունակող և ռեալ ժամանակում աշխատող ամպլիֆիկատորներ, ստեղծվել են ավտոմատ խուփով և միկրոպլանշետների խցիկով համալրված սարքեր, որի շնորհիվ դրանք կարող են ներգրավվել ավտոմատ համալիրների կազմ: Այնուհետև միացվում է ամպլիֆիկատորը, և կատարվում է ՊՇՌ. արդյունքների դետեկցիայի եղանակները ՊՇՌ-ի տարբեր տեսակների համար տարբեր են և ներկայացվում են հաջորդ բաժիններում:

3.3.3. ՊՇՌ ռեակցիայի դինամիկան Ռեակցիայի սկզբում ԴՆԹ-ի շղթայի նպատակային հատվածների քանակն արագ ավելանում է: Շատ դանդաղ աճում է նաև սկզբնական՝ նմուշ շղթաների քանակը: Այս փուլում ՊՇՌ-ի ռեակցիայում առաջացող շղթաների քանակը որոշվում է A=m×2n բանաձևով, որտեղ m-ն ԴՆԹ-ի նախնական քանակն է, A-ն՝ ամպլիֆիկացիայի արդյունքում առաջացող հատվածների քանակը, իսկ n-ը՝ կատարված ցիկլերի քանակը: Հայտնի տվյալների համաձայն՝ յուրաքանչյուր ցիկլի էֆեկտիվության աստիճանը գտնվում է 78-97 % սահմաններում: Այդ պատճառով ստացվող պատճենների ավելի ճշգրիտ հաշվարկ կատարելու համար օգտագործվում է А=m×(1+Е)n բանաձևը, որտեղ Е-ն ռեակցիայի էֆեկտիվության մակարդակն է: Հիշեցնենք, որ խառնուրդում կուտակվում են նաև հետազոտության համար օգտագործվող սկզբնական նմուշների պատճենները, բայց դրանց քանակի ավելացումը տեղի է ունենում թվաբանական աճի եղանակով՝ К = М×n բանաձևով: Ամպլիֆիկացիայի պրոցեսում կրկնապատկվող շղթաների քանակի աճը հետզհետե դանդաղում է, հասնում է առավելագույն մակարդակին՝ հարթակին, և մնում գրեթե անփոփոխ: Նման փոփոխության պատճառներն են ռեակցիոն լուծույթում պրայմերների և եռաֆոսֆոնուկլեոտիդների խտության նվազումը և ռեակցիայի կողմնակի բաղադրիչների խտության աճը, եռաֆոսֆոնուկլեոտիդների ու ԴՆԹ պոլիմերազ ֆերմենտի ակտիվության անկումը, պիրոֆոսֆատների քանակի աճը: Նշենք, որ ՊՇՌ-ի արդյունքում առաջացող նյութերի քանակի ավելացումը խառնուրդում նույնպես ազդում է ռեակցիայի ակտիվության վրա: Բացահայտվել է, որ ինչքան ավելի բարձր է նմուշի խտությունը ռեակցիոն խառնուրդում ռեակցիայի սկզբում, այնքան ավելի արագ է կրկնապատկման արդյունքում ամպլիկոնների խտության աճի արագությունը հասնում հարթակին, այսինքն՝ հավասարակշիռ վիճակի (նկ. 3.8):

C.

I ,0

Ը:,

-;:r.::r C. 3 Շ'.::,

3 3 5 Cl C.

""'Ըo Շ: ~

I5

2Հր

Պ

••

--

Նկ. 3.8. ՊՇՌ ռեակցիայի դինամիկայի գրաֆիկը ԴՆԹ-ի նմուշների տարբեր խտությունների դեպքում. ա - առավելագույն խտություն, բ - միջին խտություն, գ - նվազագույն խտություն (http://www.niipfm.nizhgma.ru/_resources/directory/130/common/ Lukyanov_ 2011_NN_lection3.pdf):

ԴՆԹ նմուշի նախապատրաստման եղանակները ՊՇՌ-ի կատարման համար անհրաժեշտ է անջատել ԴՆԹ-ն շրջապատող կենսաբանական նյութերից և ստանալ կրկնապատկման համար մաքրված ԴՆԹ-ի նմուշի բավարար քանակ: Բջջից ԴՆԹ-ի անջատման ամենահասարակ եղանակը նախնական նյութի եռացումն է 5-10 րոպե, բայց այս եղանակով անջատված ԴՆԹ-ի մաքրման մակարդակը միշտ չէ, որ բավարար է ՊՇՌ-ի կատարման համար: Կենդանական նյութից մաքուր նմուշների անջատման համար լայնորեն կիրառվում է Մարմուրի կողմից առաջարկված մեթոդը, որի ժամանակ նախ կատարվում է փորձնական նյութ պարունակող բջիջների քայքայում, ապա բջջային սպիտակուցների պրոտեալիզ և ԴՆԹի իջեցում նստվածք՝ սպիրտի ազդեցությամբ: Բայց այս մեթոդը աշխատատար է և պարունակում է տոքսիկ նյութերի՝ ֆենոլի և քլորոֆորմի օգտագործման փուլ (տես գլուխ 1): Այժմ լայն տարածում է ստացել Boom-ի և աշխատակիցների մեթոդը, որի ընթացքում նպատակային բջիջների քայքայման համար

կիրառվում է բարձր խտությամբ (5М) գուանիդին իզոտիոցիոնատ (GuSCN) նյութը: Այնուհետև կատարվում է ԴՆԹ-ի աբսորբցիա կրող տարրի՝ ապակե գնդերի, ապակե կաթի կամ դիատոմային հողի վրա: Մի շարք լվացումներից հետո աբսորբված ԴՆԹ-ն հեշտությամբ անջատվում է կրող տարրերից հատուկ բուֆերով: Մեթոդը հարմար է և հեշտ, բայց ունի մի շարք թերություններ. ԴՆԹ-ի մի մասը կարող է կորչել լվացումների ընթացքում կամ մնալ կապված կրող տարրերի հետ, բացի դրանից՝ GuSCN նյութի ամենափոքր մնացորդների առկայության դեպքում արգելակվում է ՊՇՌ ռեակցիան: Ուստի մեթոդի կիրառությունը պահանջում է բարձր զգուշությամբ ընտրել սորբենտը և փորձը կատարել ճշգրտությամբ: Կարևոր է նաև խուսափել կոնտամինացիայից՝ նմուշի աղտոտումից օտար ԴՆԹ-ով: Նմուշների պատրաստման մեթոդների մեկ այլ խումբ նախատեսում է իոնային փոխարկիչների օգտագործում, որոնք, ի տարբերություն ապակու, աբսորբում են ոչ թե ԴՆԹ-ն, այլ ՊՇՌ-ի ինհիբիտորները՝ աղտոտող նյութերը: Մեթոդը կատարվում է երկու փուլով: Սկզբում նախանմուշը եռացվում է, և դրա կազմի բջիջները քայքայվում են, ԴՆԹ-ն անցնում է լուծույթ: Երկրորդ փուլում ստացված լուծույթը մշակվում է իոնների փոխարկիչի վրա: Մեթոդը մատչելի է, հարմար և շատ արդյունավետ: Եթե բջիջների թաղանթը չի քայքայվում եռացնելիս, ապա նմուշի կազմ կարող են ավելացվել քայքայող նյութեր:

3.4. ՊՇՌ-Ի ԷՖԵԿՏԻՎՈՒԹՅԱՆ ՎՐԱ ԱԶԴՈՂ ԳՈՐԾՈՆՆԵՐԸ

ՊՇՌ-ի արդյունավետ ընթացքը պայմանավորված է մի շարք գործոնների ազդեցությամբ: Կարևորագույններից մեկը է պրայմերի ճշգրիտ ընտրությունն է: Այս գործընթացում կարևորվում են պրայմերի չափսերը՝ երկարությունը տարբեր դեպքերում կարող է լինել 8-ից մինչև 1000 նուկլեոտիդ և պայմանավորված է ինչպես կրկնապատկվող հատվածի չափսերով, այնպես էլ դրա նուկլեոտիդային կազմով: Կարևոր է նաև պրայմերի նուկլեոտիդային հերթականության կազմում GC էլեմենտների բարձր խտությունը, որն ապահովում է պրայմերի

ուժեղ կապվելու ունակությունը: GC էլեմենտների ցածր խտության դեպքում լիարժեք վառոցքի ապահովման համար պահանջվում է բավական երկար պրայմեր:

Գերադասելի է, որ պրայմերի ծայրում

գտնվեն G կամ C նուկլեոտիդները: Կարևոր է նաև, որ պրայմերների զույգում

բացակայեն

երկրորդային

կառուցվածքներ

առաջացնող

կոմպլեմենտար հերթականությունները, օրինակ՝ 1-ոլյ նայl"lո Ufflայl)ե11

5' TATՇTAՇՇAՇՇTTAMAՇՇՇ

~

II ~

ՇATՇՇAAAՇՇTAՇՇAՇAՇ Տ'

2-1111 նայl"lո Lկ11այl)ել'I

Պրայմերների խտությունը ռեակցիոն խառնուրդում նույնպես կարևոր գործոն. ցածր խտությունը դանդաղեցնում է ռեակցիան, իսկ շատ բարձր խտությունը կարող է առաջացնել ոչ յուրահատուկ ամպլիֆիկացիա՝ ոչ նպատակային հատվածների կրկնապատկում: ՊՇՌ-ի ակտիվ ընթացքի համար կարևոր գործոն է ջերմաստիճանը: Բարձր ջերմաստիճանի պայմաններում ակտիվ ԴՆԹ պոլիմերազի ներմուծումը նպաստում է ռեակցիայի արագ ակտիվացմանը: Ռեակցիայի ճշգրիտ իրականացման համար նշանակալի գործոն է նաև դեզօքսիռիբոնուկլեոտիդների խտությունը ռեակցիոն խառնուրդում: Սովորաբար օգտագործվում է 20-ից -400 մկմ, բայց եթե խտությունն ավելի բարձր է, ապա կարող են առաջանալ կամ ընթերցման սխալներ կամ Mg2+ իոնների քանակի նվազում: Ցածր խտությունը կարող է դանդաղեցնել ռեակցիան: Նշենք, որ խառնուրդի սառեցման/հալեցման բարձր հաճախականությունը նույնպես կարող է խոչընդոտել ռեակցիայի նորմալ ընթացքը: Կարևոր գործոն է նաև դեզօքսիռիբոնուկլեոտիդների մաքրության աստիճանը: Mg2+ իոնների խտությունը շատ կարևոր գործոն է ՊՇՌ ռեակցիայի նորմալ ընթացքի համար, բայց խտության գերբարձրացման պայմաններում սինթեզի ակտիվությունը նվազում է (նկ. 3.9):

I

I

'

- ---I I

I

Նկ. 3.9. Mg2+ իոնները անհրաժեշտ են Tag ԴՆԹ պոլմերազի ակտիվության համար: Ներկայացվող դեպքում ամենաարդյունավետ ցուցանիշն է՝ 2,0: Բայց իոնների խտության անչափ բարձրացումը հանգեցնում է հակառակ արդյունքի՝ կենսասինթեզը դանդաղում է (http://www.niipfm.nizhgma.ru/_ resources/directory/130/common/Lukyanov_ 2011_NN_lection3.pdf):

ՊՇՌ ռեակցիայի նորմալ ընթացքը պայմանավորված է նաև ԴՆԹ-ի նմուշի մաքրության աստիճանով, կազմով, չափսերով և քանակով (նկ. 3.10):

Մարiրiո գենոliայր '11.յԹ

Նկ. 3.10. Նմուշի քանակի ավելացումը նպաստում է ռեակցիայի արագացմանը և արդյունավետությանը (http://www.niipfm.nizhgma.ru/ _resources /directory/130/common/Lukyanov_2011_NN_lection3.pdf):

Օրինակ՝ սպիտակուցների, աղերի, օտար ԴՆԹ-ի ներկայությունը ռեակցիոն խառնուրդում խոչընդոտում են ռեակցիայի նորմալ ընթացքը: Նշանակություն ունեն նաև նմուշի քանակը, նմուշների կազմում GC էլեմենտների քանակը, նմուշների երկարությունը և կազմային բարդությունը:

Բարդ նմուշների ՊՇՌ-ն կարգավորելու համար օգտագործում են գլիցերին և DMSO, որոնք քայքայում են երկրորդային նյութերը (նկ. 3.11): Կախված պրայմերի կազմից՝ այս գործոնները կամ ինտենսիվացնում են ռեակցիան կամ դանդաղեցնում: БСА-ա բետադինը ինտենսիվացնում է ՊՇՌ-ն:

Նկ. 3.11. DMSO առկայությամբ բարձրանում են ԴՆԹ-ի GC հատվածների ամպլիֆիկացիայի արագությունը և յուրահատկությունը: Apo E գենի 2 կբ. հատվածը պարունակում է 74% GC ն.: Փորձը կատարվել է ստանդարտ եղանակով՝ DMSO տարբեր խտությամբ լուծույթներում: Լավագույն արդյունքը բացահայտվել է DMSO-ի 10 %-ի դեպքում (http://www.niipfm.nizhgma.ru/resources /directory/):

Մեծ է նաև նմուշի պահման պայմանների ճշգրիտ ընտրությունը և պահպանված նմուշների անջատման մեթոդը: Օրինակ՝ TYR գենի 4-րդ էկզոնը օգտագործվել է որպես նմուշ երկու ՊՇՌ ռեակցիաներում: Առաջին փորձում նմուշը մշակվել է սովորական ստանդարտ մեթոդով (Whatman FTA protocol), երկրորդում 5 տարի պահված նմուշը անջատվել է մեթանոլի օգտագործմամբ (նկ. 3.12):

Նկ. 3.12. 1-12-ը ԴՆԹ-ի նմուշներն են, M-ը՝ ԴՆԹ-ի հատվածների երկարության մարկերներ, N-ը՝ բացասական, ԴՆԹ չպարունակող ստուգիչ նմուշ: Մեթանոլով մշակված նմուշն ավելի լավ է պահպանվել և տալիս է ցայտուն պատկեր (http://www.niipfm.nizhgma.ru/ _resources/directory/130/common/ Lukyanov_2011_NN_lection3.pdf):

ՒTA ~երո~ 2$7եp-

3.5. ՊՇՌ-Ի ԹԵՐՈՒԹՅՈՒՆՆԵՐԸ ԵՎ ԴՐԱՆՑ ՀԱՂԹԱՀԱՐՄԱՆ

ԵՂԱՆԱԿՆԵՐԸ

ՊՇՌ-ի արդյունքում առաջացվող նյութը՝ ամպլիկոնը, կարճ է՝ կազմված է 5000 նուկլեոտիդներից: ՊՇՌ-ի նյութի կազմում բարձր է սխալների խտությունը՝ ամեն 1000 նուկլեոտիդներից մեկը սխալ է միացվում: Սխալների նվազեցման հարմար եղանակ է հիմնական ԴՆԹ պոլիմերազի հետ օգտագործել 3՛-5՛ ուղղված էնդոնուկլեազային բարձր ակտիվությամբ օժտված, բայց ցածր պոլիմերազային ակտիվություն դրսևորող երկրորդ ֆերմենտը: Համատեղ օգտագործվող պոլիմերազ ֆերմենտների ակտիվությունների համեմատական պատկերը ներկայացվում է նկարներ 3.13 և 3.14-ում: ՊՇՌ-ի կատարման որակի համար մեծ նշանակություն ունեն նաև ԴՆԹ նմուշի մաքրման աստիճանը և օգտագործվող ֆերմենտների ու այլ նյութերի մաքրությունը: Բարենպաստ ազդեցություն է գործում նաև էլոնգացիայի փուլի երկարացումը: Ռեակցիային կարող է խոչընդոտել խառնուրդում օտար ֆերմենտների և այլ ակտիվ նյութերի առկայությունը:

9.երն:iարiհնացljոն 'lնրթ-o LllոlհLiերiագներiոl ~ան,արillորi '1նրթ-հ նհնրեգհ շՏ2գր'lU1ոLl3յաU անն,հlՏանo ԾNA

Utնա1ներi'1 րնlil LՏ2գր1U1ոLրթյոLU0

Քօl/ոerase

10կ6

Pfu

1.3 ± 0.2

7.7

Deeր Մeոt

2.7 ± 0.2

3.7

Vent

2.8 + 0.9

3.6

Taq

8.0 + 3.9

1.3

U/Tma

55.3 + 2.0

0.2

Utնա1ներiti աUU1'1ծանo QոLյQ t Ulա[!iU աթա2ացորi LiոU1ացi,աներi'1 QաUաljo աliեն 10 2րiրթա1'1 L[[lա LՏ2գր1U1ոL[թյաU աUU1'1/ՏաUQ QոLյQ t lilա[!iU [թե '1նԹ-'1 կագli QաU!i lilաUUյակ հագարi Liեlj t կաU1ա[lL[ոLi նtնա1 նոկ1եո11'111'1 ներiLiոoոLi:

Նկ. 3.13. Տարբեր պոլիմերազ ֆերմենտների ազդեցությունը ԴՆԹ-ի շղթայի ճշգրիտ ընթերցման վրա (http://www.niipfm.nizhgma.ru/_resources/directory/ 130/common/Lukyanov_2011_NN_lection3.pdf):

ՊՇՌ-ի կարևորագույն թերություններից է ռեակցիոն խառնուրդում կամ նմուշում օտար ՆԹ-ների առկայությունը՝ կոնտամինացիան: Կոնտամինացիան շեղում է ռեակցիայի ընթացքը, և այն պետք է զգուշությամբ բացառվի նախապատրաստական փուլերի տարածքային անջատման միջոցով: Կոնտամինացիայի հիմնական պատճառներն են տարբեր նմուշների փոխադարձ աղտոտումը, աղտոտումը լաբորատոր սարքավորումների կամ պրայմերների միջոցով: Աղտոտման հաղթահարման մեթոդներից մեկը ուրացիլ պարունակող օտար նյութերի քայքայումն է, որն իրականացվում է ուրացիլ քայքայող ֆերմենտի օգնությամբ: ՊՇՌ-ի ոչ օպտիմալ պայմանները և ցիկլերի մեծ քանակը նույնպես բարձրացնում են սխալների մակարդակը: Կատարվող ռեակցիայի ճշգրտության աստիճանը պետք է գնահատվի օբյեկտիվ ստուգիչ նմուշների դրական՝ մատրիցային ԴՆԹ, և բացասական՝ առանց ԴՆԹ-ի կիրառման եղանակով:

- ՊlոttՊ11lեոագա- t!)գոնոկ[եա- t!)գոնոկ[եա- 3' oաiոեոti Պ1ոLtնlեր,ագ- ե ոկաոակ 5'-3' Ըա/llն 3'-5' Lրlացոնl ցոգթյոնo յtiն ակոtit.lո+ -) ներ, րlյոLLID 95"C անոհtlոնթ1ոնր ակոtյկոtր)յոLUO նոiո)

(~-~լյ

Tթգ

Բար)Oրl

+

-

Ճ - OH

Ttհ

Բար)Oրl

+

-

-

Ճ-OH

րfu

Ցած[)

-

+

Մeոt

կ00

-

+

Deeր Մeոt

ՑաO[l

+

UITոթ

ՑաO[l

+

Pաo

1000(

ՑաO[l

+

ՑաO[l

Նկ. 3.14. Սխալների նվազեցումը կատարվում է ռեակցիոն խառնուրդում երկու պոլիմերազների օգտագործմամբ: Դրանցից մեկը պետք է ունենա բարձր պոլիմերազային, իսկ երկրորդը՝ 3՛-5՛ ուղղված էկզոնուկլեազային ակտիվություն: Երկրորդը ուղղում է առաջինի սխալները և նպաստում ռեակցիայի շարունակմանը (http://www.niipfm.nizhgma.ru/_resources/directory/130/ common/Lukyanov_2011_NN_lection3.pdf):

3.6. ՊՇՌ-Ի ՏԵՍԱԿՆԵՐԸ

Վերջին տարիներին նախկինում ՆԹ-ների ամպլիֆիկացման համար օգտագործվող ՊՇՌ մեթոդը, անցնելով զարգացման մի շարք փուլեր, դարձել է ինքնուրույն հետազոտական տեխնոլոգիա: Այժմ արդեն մշակվել են ՊՇՌ-ի կատարման բազմաթիվ եղանակներ: Դրանցից յուրաքանչյուրն ունի որոշակի նպատակային ուղղվածություն՝ ապահովել ռեակցիայի էֆեկտիվության բարձրացում՝ կիրառելով «տաք» ստարտի (hot-start PCR) մեթոդը, կամ կատարել ստացված նյութի քանակական որոշում՝ թՊՇՌ, կամ հետազոտել ալելայուրահատուկ հիբրիդային մոլեկուլները և այլն:

3.6.1. Կոնվենցիոնալ կամ սովորական ՊՇՌ ՊՇՌ-ի այս տարատեսակը կիրառվում է ԴՆԹ-ի որակական ախտորոշման համար: Ռեակցիան ընթանում է նախապես որոշված ցիկլերի քանակով՝ 30-40, ապա որոշվում է խառնուրդում կուտակված երկշղթա ԴՆԹ-ների քանակը: Ռեակցիայի դրական արդյունքը վկայում է ԴՆԹ-ի ինչ-որ քանակների առկայության մասին, բացասական պատասխանը՝ ԴՆԹ-ի բացակայության: ԴՆԹ-ի նախնական քանակի գնահատումը ռեակցիայի արդյունքով անհնար է, քանի որ, անկախ նմուշի սկզբնական քանակից, ռեակցիայի վերջում այն հասնում է հարթակի մակարդակին: ԴՆԹ-ի առկայությունը խառնուրդում ռեակցիայի ավարտից հետո հիմնականում ստուգվում է էլեկտրաֆորեզի եղանակով՝ ագարոզային կամ պոլիակրիլամիդային դոնդողի վրա: Ռեակցիայի արդյունքում առաջացած մոլեկուլները բաժանվում են դոնդողում մոլեկուլային զանգվածի համաձայն. թեթև մոլեկուլները արագ են շարժվում և անցնում են երկար հատված, կարճ մոլեկուլները շարժվում են դանդաղ և քիչ են հեռանում ստարտի գծից: Դոնդողին ավելացվում է ինտերկոլարացնող ֆլուորեսցենտ ներկանյութ, շատ հաճախ բրոմի էտիդիում, որը, միանալով երկշղթա ԴՆԹ-ի հետ, լույս է արձակում: Դոնդողը մշակելով ուլտրամանուշակագույն ճառագայթներով՝ կարելի է դոնդողի վրա նկատել լույս արձակող բծեր և ըստ դրանց տեղի որոշել՝ համապատասխանում են արդյոք դրանք փնտրվող ԴՆԹ հատվածներին: Ախտորոշիչ հետազոտություններում դոնդողի վրա միշտ դրվում են ստուգիչ նմուշներ՝ դրական և բացասական (նկ. 3.15): Նշենք, որ հաճախ դոնդողի վրա երևում են ոչ միայն թիրախ ԴՆԹ-ները, այլև կողմնակի մոլեկուլներ, օրինակ՝ պրայմերների երկմերներ: Այսպիսով՝ ԴՆԹ-ի փնտրված հատվածները բացահայտվել են միայն K+ դրական ստուգիչի և 1-ին ու 2-րդ նմուշների կազմում:

KԻ 1

կ

ծ

K-

Նկ. 3.15. Առաջին նմուշը դրական ստուգիչն է՝ K+, դրան համապատասխանում է ներքևի լուսավոր բիծը, 2-7-ը փորձնական նմուշներն են: 1 և 2-ը դրական են՝ պարունակում են թիրախ ԴՆԹ-ն, և լուսավոր: 3-7-ը խավար են և չեն պարունակում թիրախ հատված, 8-րդը բացասական ստուգիչ նմուշն է՝ K-, որը նույնպես խավար է (https://studfiles.net/preview/1778291/):

3.6.2. «Տաք ստարտով» ՊՇՌ (Hot-start PCR) ՊՇՌ-ի այս տարատեսակի օգտագործումը կարգավորում է ռեակցիայի ընթացքը և արգելակում դրա ակտիվացումը պրայմերների վառոցքից առաջ: Այս նպատակով ՊՇՌ ռեակցիայում օգտագործվող ԴՆԹ-պոլիմերազ ֆերմենտը նախօրոք ապաակտիվացվում է հակամարմիններով կամ դրանց փոխարինող ցածրամոլեկուլային Affibody նյութերով: Ֆերմենտը մնում է ապաակտիվ մինչև առաջին բնափոխման փուլը, որը կատարվում է 95 ºC պայմաններում և տևում է 10 րոպե (նկ. 3.16): Մինչև անհրաժեշտ ջերմաստիճանի հասնելը ֆերմենտի վաղաժամ ակտիվացումը և փոխազդեցությունը ռեակցիոն խառնուրդի այլ բաղադրիչների հետ՝ կարող է առաջացնել ոչ յուրահատուկ նյութերի ձևավորում: Ֆերմենտի վաղաժամ ակտիվացումը հաղթահարելու նպատակով կարելի է օգտագործել նաև դյուրահալ պարաֆին կամ թեթև լիպիդներ: Ռեակցիայի ամեն փուլի ջերմաստիճանի ճշգրիտ ընտրությունը կարևոր է նաև պրայմերների լիարժեք վառոցքի համար: Առանձին տիպի պրայմերներին, կախված դրանց չափսերից և GC նուկլեոտիդների խտությունից, բնորոշ է բնափոխման որոշակի Tm՝ սահմանային ջերմաստիճան, որի դեպքում առաջանում են թույլ ջրածնային կապեր:

Նկ. 3.16. «Տաք ստարտը» բարձրացնում է ԴՆԹ պոլիմերազի ազդեցության յուրահատկությունը, ակտիվացնում նպատակային ամպլիֆիկացիան: Խառնուրդում կուտակվում են նմուշ հատվածի պատճենները, որոնք լավ են բացահայտվում էլեկտրաֆորեգրամի վրա (Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР), 2012):

Ջերմաստիճանի

բարձրացումը

Tm

մակարդակից

բարձր

հանգեցնում է պրայմերի բնափոխման, և այն անջատվում է ԴՆԹ-ի շղթայից: Ռեակցիայի ճշգրիտ ընթացքի ապահովման համար անհրաժեշտ է վառոցքի փուլում ջերմաստիճանը բարձրացնել այն մակարդակի, որը բնորոշ է վառոցքի ջերմաստիճանին և քիչ է տարբերվում բնափոխման ջերմաստիճանից: Այս պայմաններում պրայմերը ամուր միանում է միայն բացարձակ կոմպլեմենտար շղթային՝ դրանով իսկ ապահովելով ռեակցիայի յուրահատկության բարձրագույն աստիճան: Նույնիսկ այն դեպքում, երբ պրայմերի վառոցքը կատարվել է մինչև ջերմաստիճանի բավարար բարձրացումը օտար շղթաների հետ, ապաակտիվ ֆերմենտը չի կատարում էլոնգացիան, իսկ ջերմաստիճանի բարձրացման արդյունքում պրայմերները անջատվում են ոչ կոմպլեմենտար շղթաներից և ոչ յուրահատուկ նյութեր չեն սինթեզվում: Այսպիսով՝ նկարագրված «տաք ստարտի» մեթոդը արգելակում է ռեակցիայի կողմնակի ընթացքները և ապահովում նպատակային շղթայի կրկնապատկման բարձր աստիճան:

3.6.3. Ներդրված ՊՇՌ (Nested PCRR) Նպատակային ձևով օգտագործվում է ռեակցիոն խառնուրդում ոչ նպատակային մոլեկուլների քանակի կրճատման համար: Այս դեպքում օգտագործվում է պրայմերների երկու զույգ. առաջինը կոմպլեմենտար է նմուշ շղթայի ծայրային հերթականություններին, իսկ երկրորդը՝ դրա ներքին՝ նպատակային հատվածի ծայրերին (նկ. 3.17): 'll.,fa-հ 211Pա ll1ll1ll1ll11ll1ll1ll1lll1ll1ll1ll11ll1ll1ll1lll1ll1ll1ll1I 1-հն գոiգ ն.ոայներ,ներiհ ներ,նոծոն

1 -5'--------m ffl 3'

'1l[1այtlե[1

'1l[1այLlե[1 2

3,

I

5'

UնLL11'1~'1կացհա 1-հն անLL11'1~'1կացհահ ՄյոԼ~

ՊՊ' lll.... ll ,.,.. lll..., lll...,. ll ,.,.. 111.... 111,.,.. ll..., lllՊՊՊ ll ll 'Պl...., lllՊՊՊ llՊՊ' lllՊՊՊ ll ,.,.. III....II

lI 'llրiա1tlերi3

2-րiրi LlllՊlայUեր,հ ներ,նոթոն

lllll

ոո

'1l[1այLlե[1 կ

I

Uնl.կI'1~'1կացi,ա 'TlՇր'1-հ Պl'l j jրրl j j j...,. j jրրl j j jՊjՊ'j l'l'!' j j j'l'l'l j j jl'l'!' j j-j j j կւr,2ՄակաՄ . նյոLԲD

l

Նկ. 3.17. «Ներդրված ՊՇՌ-ի» մեթոդի սխեման: Օգտագործվում են երկու զույգ պրայմերներ: Առաջին զույգը կոմպլեմենտար է նմուշ շղթայի ծայրային հերթականությանը՝ այս պրայմերների քանակը նվազ է և օգտագործվում են սինթեզի 1-ին փուլում: Երկրորդ զույգ պրայմերները կոմպլեմենտար են նպատակային հերթականության ծայրերին՝ ներմուծվում են ավելի ուշ, և դրանց խտությունը բարձր է: Այս փուլից սկսած ամպլիֆիկացվում է միայն նպատակային հատվածը և ավելորդ նյութերի քանակը խառնուրդում չի ավելանում (http://zavantag.com/docs/427/index-2014031-1.html?page=44):

3.6.4. «Ինվերտացնող կամ հակառակ» ՊՇՌ (Inverse PCR) Օգտագործվում է այն դեպքում, երբ հայտնի է ամպլիֆիկացվող հատվածի միջին հերթականությունների մի մասը: Այս մեթոդի կիրառմամբ շղթայի հայտնի միջին հատվածները տեղափոխվում են ծայրային լոկուսներ, որի շնորհիվ ԴՆԹ-ի հայտնի ծայրային հերթականությունների համար ապահովվում են կոմպլեմենտար պրայմերներ:

•

նt.uո11~կոազայ~ն tlշակո11l

•

կանlոttl

--

Հայlil~t, հաuujա6

U~հայtո հաtոljա6

1~զազոլ

111111}1

ոեutորt,կgt,այti կեtո

Հակաuակ որiրitlա6 "ltո ~Pայ~եր~եր

Նկ. 3.18. Ինվերտացնող ՊՇՌ-ի կատարման սխեման (Ochman, Gerber, Hartl, 1988):

Փորձի կատարման սկզբում նմուշ շղթան պոլինդրոմի հատվածներում կտրվում է որևէ կարճ կտրող ռեստրիկտազով և առաջացնում կպչուն ծայրեր: Կպչուն ծայրերը միանում են այլ կերպ, և ձևավորվում է օղակաձև մոլեկուլ: Օղակաձև մոլեկուլի հայտնի հատվածին կոմպլեմենտար, հակառակ ուղղություն ունեցող պրայմերները միացվում են օղակաձև մոլեկուլի երկու տարբեր շղթաներին և կատարվում է կրկնապատկում՝ ամպլիֆիկացիա: ՊՇՌ-ի կատարման համար մոլեկուլի գծային կամ օղակաձև կառուցվածքը հավասար ընդունելի է, և եթե որևէ պատճառով գերադասելի է կրկնապատկել գծային կառուցվածք ունեցող հատվածներ, հայտնի հերթականությունը կարող է կտրվել ռեստրիկտազով (նկ. 3.18):

Մեթոդի կիրառությունը կարևոր է այն դեպքում, երբ անհրաժեշտ է բացահայտել վիրուսային գենոմի կամ ռետրո- և սովորական տրանսպոզոնների ներմուծման սայտը բջջի գենոմ: Այս դեպքում օգտագործվում են ներբջջային վիրուսների գենոմներին կամ ԳՇԷ-ին կոմպլեմենտար պրայմերներ և դրանցով կատարում ՊՇՌ: Եթե ՊՇՌ տեղի է ունեցել, ուրեմն պրայմերը կոմպլեմենտար է ներմուծված հատվածին, և ներմուծվող հատվածի ինչ լինելը բացահայտվել է: Ապա, օգտագործելով ներմուծված հատվածի ծայրերին կոմպլեմենտար պրայմերներ, կատարվում է ինվերտացնող ՊՇՌ, և որոշվում է հատվածի ներմուծման սայտի հերթականությունը: Հաջորդ փուլում սեկվենացիայի կամ այլ եղանակով բացահայտվում է դրա տեղը բջջի գենոմում: 3.6.5. ՊՇՌ հետադարձ տրանսկրիպցիայի օգտագործմամբ (ReverseTranscription PCR, RT-PCR) Հաճախ տարբեր հյուսվածքների բջջային պրոտեոմի հետազոտման և գեների էքսպրեսիայի մակարդակի ուսումնասիրության նպատակով նմուշներում հետազոտվում է իՌՆԹ-ների առկայությունը և խտությունը: Այս դեպքում որպես ուսումնասիրության թիրախ են ընտրվում կամ ամբողջական ի-ՌՆԹ-ները, կամ դրանց ներքին նպատակային հատվածները: ՌՆԹ-ները միաշղթա են և բնական պայմաններում դրանց կենսասինթեզը կատարվում է ԴՆԹ-ի որոշակի հատվածի տրանսկրիպցիայի եղանակով: Այս պատճառով ՊՇՌ-ի եղանակով կատարել ՌՆԹ-ի շղթաների ուղղակի կրկնապատկում հնարավոր չէ, բայց հնարավոր է կրկնապատկել և հետազոտել իՌՆԹ-ին համապատասխանող ԴՆԹ-ի հատվածը: Ուստի իՌՆԹ-ներից ռևերտազ կամ դրա ֆունկցիան կատարող այլ ֆերմենտի օգնությամբ կատարվում է ՌՆԹին համապատասխանող ԴՆԹ-ի շղթայի կենսասինթեզ, ապա կրկնապատկվում է ստացված ԴՆԹ-ն: ԴՆԹ-ի կենսասինթեզի համար օգտագործվում են Avian myeloblastosis կամ Moloney murine leukemia վիրուսների ռևերտազները: Ռևերտազ ֆերմենտները ջերմազգայուն են, և դրանց ակտիվության օպտիմալ ջերմաստիճանը 42 ºC է: ՌՆԹ-ի

շղթաները այս ջերմաստիճանի պայմաններում հակված են առաջացնել երկրորդային երկշղթա հատվածներ, և պատճենահանման էֆեկտիվությունը նվազում է մինչև 5 %: ԴՆԹ-ի կենսասինթեզին խանգարող այս գործոնների ազդեցությունը հաղթահարվում է ռեակցիան ակտիվացնող Мn2+ իոնների և ռևերտազային ակտիվությամբ օժտված ջերմադիմացկուն պոլիմերազ ֆերմենտի օգտագործման միջոցով: Հետադարձ տրանսկրիպցիայի ռեակցիայում օգտագործվող խառնուրդը պետք է պարունակի յուրահատուկ պրայմերներ և 4 դՆԵՖ-ներ:

Շրuaաutրհ l)ե6աl!1որաgհա L, արայutրuերր1utրuոoո

նեtj_երlllազր ,յրայllեր 1-ր L, l)եզo1,uհt.ոաliո~tեոlflհll:i,ոu:i,աlfl!յերր uերuոoոu ....i կ2_1.յlo

~

@.Ո

I

""'ոt1o

l

--

Շրu,աuերր l)ե!յաl!lորաgրա L. աPայllեր 2-ր (յերuոoոll

"lՇո աuui1ր:ii րկաgրա

'11.յlo-ր կ1ոu

կ'11.յlo-ր կ1ոu

ա

ր

-

Նկ. 3.19. ՌՆԹ-ի ամպլիֆիկացիայի մեխանիզմի սխեման: ՌՆԹ-ների ՊՇՌ կրկնապատկումը կատարվում է փորձանոթներում՝ անմիջապես անջատումից նետո: Ապա մՌՆԹ-ից ռեստրիկտազ ֆերմենտների օգնությամբ ստացվում է հետազոտվող հատվածը: Հաջորդ փուլում ռևերտազ ֆերմենտի միջոցով սինթեզվում է ՌՆԹ-ին կոմպլեմենտար կԴՆԹ: Բնափոխումից հետո կԴՆԹ-ն ներմուծվում է ռեակցիոն խառնուրդ և կրկնապատկվում (http://www.niipfm. nizhgma.ru/_resources/-directory/130/common/Lukyanov_2011_NN_lection3.pdf):

Առաջին հերթին սինթեզվում է ԴՆԹ պատճեն՝ կԴՆԹ-ն, որը օգտագործվում է ՊՇՌ-ում որպես կլոնավորման մատրիցա (նկ. 3.19): Այս եղանակով հետազոտում են ՌՆԹ-ի որակական կազմը և քանակը: Նույն մեթոդը կիրառվում է նաև ՌՆԹ վիրուսների բացահայտման համար: 3.6.6. Ասիմետրիկ ՊՇՌ (Asymmetric PCR) ՊՇՌ-ի այս տարբերակը օգտագործվում է այն դեպքերում, երբ հետազոտությունների համար անհրաժեշտ է ստանալ ԴՆԹ-ի շղթաներից միայն մեկի պատճենների մեծ քանակ: Ուստի փորձի համար օգտագործվող ռեակցիոն խառնուրդին ավելացվող պրայմերների քանակը տարբեր է. մեծ է թիրախ շղթայի համար անհրաժեշտ պրայմերներինը և փոքր՝ երկրորդ շղթայինը: ՊՇՌ-ի այս եղանակը կիրառվում է սեկվենացման կամ Բլոտհիբրիդացման եղանակով կատարվող հետազոտության նմուշի նախապատրաստման համար (նկ. 3.20):

i::::::::::::::::::::=:i:

'11:iնաոորiացtiա , LllրlայLiե[lUերlր._L!_ա_ր1_ո_րա _ _ _ _ _2'Tffl ~ 3• 50 UjUո[.

1 lljUո[. 3,. mս:

-5'

1'11Շր1-ti 30ցրlj[

5'•-----------3'

. կ

1 LL1Liո1. երiLiշ11_ր,եա 111iրa

3'-

.5•

~

5 LL1Liո1 3'-- - - - - - - - կ - -•5' Liրաշրնթա '1uրa 3 :-_ -5' - - - - - -- -կ--•5'

3•.

-5'

Նկ. 3.20. Ասիմետրիկ ՊՇՌ-ի սխեման: ՊՇՌ-ի այս տարբերակի դեպքում ռեակցիոն խառնուրդի մեջ ներմուծվող պրայմերների քանակը կտրուկ տարբերվում է՝ 1/50 կամ նույնիսկ 1/100 հարաբերությամբ ներմուծվում է թիրախ շղթային կոմպլեմենտար պրայմեր: Ռեակցիայի ավարտի փուլում թիրախ շղթաների քանակը 5 անգամ գերազանցում է երկշղթա մոլեկուլների քանակը (http://www.niipfm.nizhgma.ru/_ resources/directory/130/common/ Lukyanov_2011_NN_lection3.pdf):

3.6.7. Սանդղակային ՊՇՌ (Touchdown PCR) ՊՇՌ-ի այս տարբերակը թույլ է տալիս իջեցնել պրայմերի ոչ յուրահատուկ միացումների քանակը: Հայտնի է, որ վառոցքի օպտիմալ ջերմաստիճանի պայմաններում պրայմերի առանձին հատվածները կապվում են կոմպլեմենտար շղթայի հետ և ամպլիֆիկացիան կատարվում է որոշակի շեղումներով: Շեղումներից խուսափելու նպատակով ռեակցիայի առաջին փուլերում վառոցքը կատարում են բարձր ջերմաստիճանի պայմաններում, ապա մի քանի փուլ անց ջերմաստիճանը մի փոքր իջեցվում է: Այս գործողությունը կրկնվում է մի քանի անգամ, մինչև բացահայտվում է պրայմերի ճշգրիտ միացման համար անհրաժեշտ օպտիմալ ջերմաստիճանը: Այս պայմաններում պրայմերը կապվում է կոմպլեմենտար շղթային ամբողջ երկարությամբ, և կատարվում է անթերի ամպլիֆիկացիա: Դեպքերի մեծ մասում ամպլիֆիկացիայի առաջին 10 փուլերը պետք է կատարել 72-75 ºС ջերմաստիճանի պայմաններում, հետո անցնել օպտիմալ՝ 60-65 ºС ջերմաստիճանին: 3.6.8. Երկար ֆրագմենտների ՊՇՌ (Longrange PCR) Ամպլիֆիկացիայի՝ երկար ֆրագմենտների ՊՇՌ-մեթոդը օգտագործվում է այն դեպքերում, երբ անհրաժեշտ է սինթեզել ԴՆԹ-ի երկար՝ 10 000 և ավելի նուկլեոտիդ պարունակող շղթաներ: Այս դեպքում ոչկոմպլեմենտար նուկլեոտիդների միացումների հաճախականությունը կարող է առաջացնել սինթեզի պրոցեսի ընդհատումներ: Նման շեղումներից խուսափելու համար ռեակցիայում օգտագործվում են պոլիմերազ տիպի 2 տարբեր ֆերմենտներ՝ Tag պոլիմերազը, որը սինթեզում է ԴՆԹ-ի երկար շղթաներ, և Pfu պոլիմերազը, որը, օգտագործելով սխալները շտկող էնդոնուկլեազային՝ 3՛-5՛ ուղղված ակտիվությունը, ուղղում է առաջացած շեղումները և նպաստում կրկնապատկման

շարունակմանը

(նկ.

3.21.1):

Սխալների

անմիջապես

ուղղման եղանակը հնարավորություն է տալիս սինթեզել երկար, անթերի պատճեններ:

3' -

ո 1կMuu M t uոար uոկ1եաոt,11ti աu2աոո~

5· ազ111:igո11>1աu ljեոo

5· T Ճ T ··· 3• ....................................,. ~ ' Պ.. - .. _ •..-, .ՊՊ' • •ՊՊ•~---------------._ 5·

րո,րa ~ ո1t,~երազ

Utuարո ոlflflՀIան

t

sկ G T Ճ T

5·

Li աtlր11ա ~ագt, գենոtlt, հաոllա ծներ,t, ա tlն.նt,~t,[jացt,ա նաlllL!աOt, Հաlllttաot, եր,LյարiորթiոնQ հ.գ.ն.-ոtt ե[1կա[1ոL ն3յոLUQ հ.գ .ն. 2 ,9 Ց 10 2.9 5 1 0 15 M 10. 0 6 .0 5 .0

կ.0

5.0

3 0

3 .0

2 .0 1. 0

1.0

ԼՃ-ՔՇԲ ոixture (Բոc/clօ, Բvrօցeո)

Taq DNՃ Քօl/ոerase

հագ. գ . նոl.i t -

Նկ. 3.21. ԴՆԹ-ի ռեպլիկացիայի սխալների ուղղման սխեման: 1 - էնդոնուկլեազային 3՛-5՛ ակտիվությամբ Pfu ԴՆԹ պոլիմերազը անջատում է ոչկոմպլեմենտար նուկլեոտիդը և օգնում հիմնական պոլիմերազ ֆերմենտին շարունակել ամպլիֆիկացիան: 2 - երկար ֆրագմենտների ՊՇՌ ֆորեգրամը: Առաջին ֆորեգրամում ներկայացված է միայն Tag ֆերմենտով կատարվող երկար շղթաների ամպլիֆիկացիա, երկրորդ ֆորեգրամում՝ երկու ֆերմենտներով կատարվող ամպլիֆիկացիայի արդյունքը: Երկրորդ դեպքում սինթեզվում են և կարճ, և երկար շղթաներ (https://www.files.pimunn.ru /niibiomed/speckurs/bionj/Lukyanov_2011_NN_lection3.pdf):

Նշենք, որ Tag պոլիմերազի խտությունը ռեակցիոն խառնուրդում պետք է գերազանցի Pfu պոլիմերազի խտությունը տասնյակ անգամներ՝ 50:1-ի կամ նույնիսկ 100:1-ի հարաբերակցությամբ: Երկու պոլիմերազների օգտագործման արդյունավետությունը բացահայտվում է Լյամբդա ֆագի գենոմի ռեստրիկտների ՊՇՌ-ի միջոցով: Առաջին փորձում ռեստրիկտների ՊՇՌ կատարվել է միայն Tag պոլիմերազի օգտագործմամբ: Ամենաերկար ստացված ամպլիկոնի երկարությունը հավասար է 5 000 ն.: Երկրորդ փորձում օգտագործվել են երկու պոլիմերազները՝ Tag և Pfu: Այս դեպքում կրկնապատկված ամպլիկոնների երկարությունները հավասար են 5, 8, 10 և նույնիսկ 15000 ն. (նկ. 3.21.2): 3.6.9. Մոլեկուլային գաղութների ՊՇՌ (PCR-Colony) Մոլեկուլային գաղութների ՊՇՌ-ի մեթոդը մասնագիտացված հետազոտությունների կատարման եղանակ է, որն օգտագործվում է պլազմիդների կազմում նպատակային ԴՆԹ հերթականությունների բացահայտման համար: Հայտնի է, որ գենոմային հետազոտություններում տեսակի ԴՆԹ-ների հատվածներից կազմվում են գենոմային գրադարաններ, որոնցում վեկտորների կազմում պահվում են գենոմի առանձին հատվածները: Վեկտորներն ընտրվում են գենոմի հատվածի չափսերին համապատասխան, ապա ներմուծվում բակտերիաների կազմ: Հաճախ որպես վեկտոր օգտագործվում են պլազմիդները: Օրինակ՝ մկների գենոմի առանձին ընթերցված հատվածները ներմուծվում են պլազմիդների կազմ և պահվում E.coli բակտերիայի կլոնների գրադարանի կազմում: Այս գրադարանում պլազմիդային վեկտորի կազմում նպատակային հերթականության առկայության ստուգման համար կիրառվում է PCR-Colony կամ մոլեկուլային գաղութների ՊՇՌ մեթոդը: Մեթոդը հասարակ է կատարման տեսակետից, արագընթաց, չի պահանջում բակտերիաների նախապես կլոնավորում և ԴՆԹ-ի անջատում բջիջներից:

Հետազոտությունը կատարվում է դասական ՊՇՌ-ի եղանակով՝ սովորական կազմ ունեցող ռեակցիոն խառնուրդի օգտագործմամբ: Բացի ռեակցիոն խառնուրդից փորձանոթների մեջ ավելացվում են հատուկ պրայմերների երեք զույգ և նմուշը: Պրայմերների բազմաքանակությունը պայմանավորված է հետազոտության առջև դրվող խնդիրների բազմազանությամբ: Գրադարանի ստեղծման համար անհրաժեշտ է ոչ միայն բացահայտել թիրախ հատվածը նմուշում, այլև պարզել դրա լոկուսը պլազմիդում և շղթայի ուղղվածությունը: Այս երեք հարցերի պատասխանը ստացվում է երեք պրայմերների օգտագործման դեպքում (նկ. 3.22):

Նկ. 3.22. Մոլեկուլային գաղութների մեթոդով կատարվող ՊՇՌ-ում օգտագործվող պրայմերների միացման սխեման. 1 - ներդիր հատվածի ծայրերի պրայմերներ, 2 - պլազմիդի սահմանային հատվածների պրայմերներ, 3 - ներդիր հատվածի ուղղվածությունը բացահայտող պրայմերներ (https://geneticeducation.co.in/colony-pcr-principleprocess-protocol-advantages-and-limitations/):

Փորձում օգտագործվող պրայմերները պետք է բավարարեն բոլոր պրայմերներին ներկայացվող պահանջներին՝ լինեն կազմված 20 ն., պարունակեն GC նուկլեոտիդների ցածր խտություն, չառաջացնեն ծամկալներ և ոչսպեցիֆիկ միացումներ: Աշխատանքի ընթացքը. Փորձի կատարման համար նախապատրաստվում է նմուշը (նկ. 3.23): 1-ին փուլում բակտերիայի բջիջները տրանսֆորմացվում են թիրախ գեն պարունակող պլազմիդներով: 2-րդ փուլում տրանսֆորմացված բակտերիաները բազմանում են, առաջացնում գաղութներ:

3-րդ փուլում գաղութներից անջատված բակտերիաները տեղափոխվում են ստերիլ փորձանոթ, ավելացվում է TE բուֆեր, և խառնուրդը տաքացվում է ջրային բաղնիքի վրա մինչև 65 ºC և մշակվում 20 րոպե: Ապա փորձանոթը հանվում է ջրային բաղնիքից, լավ թափահարվում և ցենտրիֆուգվում արագ ռեժիմով 2 րոպե: Սուպերնատանտը տեղափոխվում է այլ փորձանոթ և օգտագործվում որպես ԴՆԹ մատրիցա: Լուծույթից 20 մկլ տեղափոխվում է ՊՇՌ-ի համար նախապատրաստված փորձանոթի մեջ: ԲակLոեր,t,աներit, lո ր1աUU կրո[1ilացոնl llեկոնրt,նանLո lկl ն..գնt,րiներiոt.l

Qենոilայt,ն գր,արiարiանt, նlոերՊ\OոLU

Տր,աննկրոր,նացt.lաo րակLոեր,t,աներ,t, "lCո-t, գարiոգթներi նաtնաLկաlոր1աUlոոLU

Uր,րiյոնE' կրոր,եգր,ան

Նկ. 3.23. ՊՇՌ-ի նախապատրաստման և կատարման փուլերը (https://geneticeducation.co.in/colony-pcr-principle-process-protocol-advantagesand-limitations/):

ՊՇՌ-ի համար նախապատրաստվող փորձանոթների մեջ ներմուծվում է ռեակցիոն խառնուրդը: Խառնուրդում առկա են Taq ԴՆԹ պոլիմերազը, չորս տեսակի dNTP, ռեակցիոն բուֆերի 5 մկլ (պարունակում է 2 մՄ MgCl2*), նուկլեազներ չպարունակող ջուր՝ 3 մկլ, և պրայմերները՝ 1-ական մկլ: Նույն փորձանոթի մեջ ավելացվում է 3 մկլ ԴՆԹ մատրիցա պարունակող լուծույթ: Ընդհանուր ծավալը հասցվում է 25 մկլ: 4-րդ փուլում դասական եղանակով կատարվում է ՊՇՌ-ի 25 ցիկլ: Ստացված լուծույթի ծավալները տեղափոխվում են ագարոզային

կամ ՊԱԱԴ դոնդողում պատրաստված խորշերի մեջ: Պետք է նշել, որ վերևում նշված երեք խնդիրների լուծման համար կիրառվում է պրայմերների որոշակի զույգ (նկ. 3.24): M

կ

M-

ilո1tկոգա)tՊ1ն ն2արitiրi

1.'"lրակաo հuկt>t աոաog o~ոշt> 2. ut;րրit>րtio հաu,ոկ LկPայ~t;ր 3."lլազ ~t>րit> հարuան հաU1ljա60t;րt> LկPայ~t;ր կ. ոu11\ կա6ոia1աo uu,ոզuաo 1.կրայ~t;ր

ո a55

5.ut;րրit>ր t>նհաu,ոկ հuկt>t 6: ոtl\l\tlա6որ-1աo uu,ոզuաo 1.կրայ~t;րt> րաgաuակաo հUկt>!

Նկ. 3.24. Պլազմիդի կազմում ներդիր ԴՆԹ շղթայի առկայության և ուղղվածության բացահայտման սխեման (https://geneticeducation.co.in/colonypcr-principle-process-protocol-advantages-and-limitations/):

Ինչպես և բոլոր ՊՇՌ ռեակցիաներում, մեր դեպքում էլ փորձում կիրառվում են ստուգիչ հսկիչներ՝ 1, 5, 6: 1-ին նմուշում կատարվում է ռեակցիայի դրական հսկողությունը մատրիցայի բացակայության պայմաններում: Սինթեզված ամպլիկոնների երկարությունը հավասար է 200 զ.ն.: 5-րդ նմուշում ստուգվում է ներդիրի ինքնությունը: 6-րդ նմուշում կատարվում է բացասական հսկում մատրիցայի բացակայության պայմաններում: 2-րդ նմուշում եթե նախապես հայտնի է, որ ներդիրը կազմված է 400 զ.ն-ից ապա ներդիրին հատուկ պրայմերների առկայությամբ կրկնապատկվում է միայն ներդիրը և ձևավորվում են դրա պատճենները: Ինչպես տեսնում ենք ֆորեգրամի վրա, 2-րդ նմուշի ամպլիկոնների երկարությունը համապատասխանում է ստուգիչ M սանդղակի 400 զ.ն-ին: Ուրեմն նմուշում առկա է ներդիրը: Պլազմիդի կազմում ներդիրի առկայությունը ապացուցվում է

3-րդ նմուշում գտնվող ներդիրի և պլազմիդի սահմանային հատվածներին համապատասխանող պրայմերների օգնությամբ: Այս դեպքում կրկնապատկվում է պլազմիդի սահմանային մասերի հատվածը և ներդիրը: Ստացված հատվածները մեծ են ներդիրից և հավասար են 600 զ.ն.: 4-րդ նմուշը պարունակում է ներդիրի ուղղվածության ստուգման համար օգտագործվող պրայմերները, և, դրանց միացման լոկուսների համաձայն, ամպլիկոնները ավելի մեծ են, քան ներդիրը, բայց փոքր են, քան սահամանային հատվածներ պարունակող ամպլիկոնը՝ 500 զ.ն.: Ներկայացված մեթոդը հասարակ է կատարման տեսակետից, արագ կատարվող և ճշգրիտ, բայց ունի նաև որոշ թերություններ՝ չի բացահայտում ներդիրի նուկլեոտիդային հերթականությունը և կետային մուտացիաները: Մեթոդը կիրառվում է գեների գրադարանների ստեղծման և գեների տեղափոխման աշխատանքներում: Բացի դրանից՝ օգտագործվում է գենային ինժեներիայում՝ գեների կլոնավորման համար: 3.6.10. Պատահական ամպլիֆիկացիայով ՊՇՌ (Random Amplification of Polymorphic DNA, RAPD) RAPD ՊՇՌ-ն կիրառվում է այն դեպքերում, երբ անհրաժեշտ է տարբերակել գենետիկորեն մոտ, բայց ոչ իդենտիկ ԴՆԹ-ի նուկլեոտիդային հերթականություններ ունեցող օրգանիզմները, օրինակ՝ նույն տեսակի բույսի տարբեր սորտերը, շների ցեղերը, բակտերիաների կամ վիրուսների շտամերը: Քանի որ վիրուսների և վիրոիդների գենոմը լավ հետազոտված է դրանց որոշումը կարող է կատարվել համապատասխան պրայմերների կիրառմամբ՝ ինչպես հետազոտվող ԴՆԹ-ի ամբողջ ծավալով, այնպես էլ դրա առանձին հատվածներով: Բակտերիաների, սնկերի և օոմիցետների ԴՆԹ-ների նուրբ ախտորոշման համար սովորաբար օգտագործում են ռիբոսոմային ՌՆԹ-ներ կոդավորող ԴՆԹ-ի հատվածները: Այս հատվածները ներկայացված են գենոմում բազմաթիվ պատճեններով, ինչի շնորհիվ

ՊՇՌ-ի ճշգրտության աստիճանը շատ բարձր է: Երկրորդ բարենպաստ հանգամանքն այն է, որ, չնայած այս գեների կոդավորող հերթականությունները կոնսերվատիվ են, քիչ են ենթարկվում մուտացիոն փոփոխությունների, և գրեթե նույնն են բոլոր տեսակների մոտ, բայց 5.8 S-perno H լոկուսի կազմում գտնվում են փոփոխականության բարձր աստիճանով բնութագրվող հատվածներ (ITS սպեյսերներ): Կոնսերվատիվ հատվածները հարմար են պրայմերների ընտրության համար, իսկ փոփոխվող հատվածները տեսակայուրահատուկ են և կարող են օգտագործվել հարուցչի տեսակի, շտամի կամ նույնիսկ ռասայի որոշման համար: Սնկերի տեսակայուրահատուկ իդենտիֆիկացիան կատարվում է տան տնտեսության որոշ՝ օրինակ բետատուբուլինի գեների ԴՆԹ-ի լոկուսներով: Բակտերիաների դետեկցիայի համար օգտագործվում են պաթոգենության գեները կամ պլազմիդային ԴՆԹ-ի որոշ հատվածներ: Վատ հետազոտված գենոմների դեպքում սովորաբար ռեակցիայում օգտագործվում է կարճ՝ 10 նուկլեոտիդից կազմված մեկ պրայմեր, որը մասամբ կոմպլեմենտար է հետազոտվող նմուշների տարբեր հատվածներին: Ստացվում են տարբեր չափսերի շղթաներ, որոնց ծայրերը սահմանում է պրայմերին կոմպլեմենտար հերթականությունը: Մուտացիաները առաջացնում են տարբեր տեսակների ԴՆԹ-ներից ամպլիֆիկացվող շղթաների տարբերակներ: Դրանց էլեկտրաֆորեզային բաժանումը բացահայտում է տարբեր պատկերներ, որոնք և օգտագործվում են տարատեսակների դետեկցիայի համար: Պրայմերի կազմի և չափսերի, վառոցքի օպտիմալ ջերմաստիճանի փոփոխման միջոցով հետզհետե ձևավորվում են ամեն մի գենոմի համար յուրահատուկ պրայմերներ, և երկու նմուշների համար ստացվում են ՊՇՌ-ի տարբեր պատկերներ: Օրինակ՝ Escherichia coli (ExPEC)-ի արտաաղիքային ձևերը շտամերի հատուկ խումբ են, որոնք ունակ են հաղթահարել հարուցվող օրգանիզմի իմունային պաշտպանությունը և, շնորհիվ յուրահատուկ պաթոգենության, առաջացնել ոչաղիքային հիվանդությունների զար194

գացում: Նշված խմբի գենետիկական առանձնահատկությունների հետազոտությունը հնարավորություն է ընձեռում ավելի մանրամասն ճանաչել գենոմային տարբերությունները և դրանց կապը գերպաթոգենության հատկանիշների հետ: Այս նպատակով կատարվել է հետազոտություն, որում պատահական ամպլիֆիկացիայի ՊՇՌ մեթոդով հետազոտվել են ExPEC խմբի E. coli 536, NU14 և RS218 շտամերը: Փորձի կատարման համար օգտագործվել է 1247 պրայմերը (նկ. 3.25): 12կ7 Ըo N

<D

M

en

0::

ll)

M

կ

Նկ. 3.25. E. coli 536, NU14 և RS218 շտամերի ԴՆԹ հետազոտության պատահական ամպլիֆիկացիայի եղանակով կատարված ՊՇՌ արդյունքների ֆորեգրամը: M-ԴՆԹ հատվածների երկարության սանդղակ՝ 3000-250 զ.ն. (https://journals.asm.org/doi/full/ 10.1128/ecosalplus.esp-0004-2017):

NU14 և RS218 շտամերի ֆորեգրամները նույնն են, բայց NU14 շտամը առաջացնում է ցիստիտ հիվանդությունը, իսկ RS218՝ նեոնատալային մենինգիտ: 536 շտամի ֆորեգրամը տարբերվում է մնացածներից, և այս շտամը առաջացնում է երիկամների պիէլոնեֆրիտ հիվանդությունը:

3.6.11. Խումբ յուրահատուկ ՊՇՌ (group-specific PCR) Օգտագործվում է տեսակի սահմաններում կամ գենետիկորեն մոտ տեսակների ԴՆԹ-ներում տարբերվող նուկլեոտիդային հերթականությունների բացահայտման համար, օրինակ` ռիբոսոմային ՌՆԹներ կոդավորող գեների կազմի սպեյսերների համար տեսակայուրահատուկ պրայմերների ձևավորման նպատակով: Ռիբոսոմային 18S և 26S գեները կոնսերվատիվ են, և տարբեր տեսակների այս գեների ՊՇՌ-ն կարող է կատարվել նույն պրայմերներով, բայց սպեյսերներն այս դեպքում տարբեր են՝ տարբեր տեսակների մոտ ունենում են տարբեր նուկլեոտիդային կազմ, ուստի կարող են օգտագործվել տեսակների ԴՆԹ-ների նուկլեոտիդային հերթականության տարբերության բացահայտման համար: 3.6.12. Ալելյուրահատուկ ՊՇՌ (Allele-specific PCR) Գենոտիպում տարբեր ալելների բացահայտման համար օգտագործվում են ալելյուրահատուկ պրայմերներ: Առաջին պրայմերը կոմպլեմենտար է 1-ին ալելին, երկրորդը՝ մյուսին: ՊՇՌ-ն կատարվում է միայն այն դեպքում, երբ ռեակցիոն խառնուրդում առկա է պրայմերին կոմպլեմենտար կազմ ունեցող ալելը (նկ. 3.26): Եթե ռեակցիան կատարվում է միայն առաջին պրայմերի օգտագործման փորձում, գենոտիպը հոմոզիգոտ է առաջին ալելով: Եթե ռեակցիան կատարվում է միայն երկրորդ սովորական պրայմերի փորձում գենոտիպը հոմոզիգոտ է երկրորդ ալելով: Իսկ եթե ռեակցիան կատարվում է և առաջին, և երկրորդ պրայմերների հետ կատարված փորձերում գենոտիպը հետերոզիգոտ է:

ա ալtլ 1 5' ալtլ 2 3'

3'

A Շ

5'

աttt 1 յորiահան,ոկ lյ.lրՊlայLitրi նՃՏԲ1)

ր

կոննtրil[ան,ոl[ lյ.l[ՊlայLit[Պl

Շ աttt 2 յորiահան,ոկ lյ.lրՊlայLitրi նՃՏԲ2) ալՇl 1 Ճ

Ltաli Ltաli

Ltաli Ltաli

5 ::=::=:եեեե

~5 Ըր _ , աliuuհ~հկաgհա 1կա _ _ _.__

~5 Ճ

աliuuհ~հljաgհա 1'-lա

Նկ. 3.26. ՊՇՌ-ի ռեակցիոն խառնուրդում գտնվում են երկու հետազոտվող նմուշները և հերթով՝ առաջին ռեակցիայում ավելացվում է առաջին ալելի ծայրին կոմպլեմենտար պրայմերը և կոնսերվատիվը՝ երկրորդ ծայրի համար: Եթե 1-ին ալելը առկա է խառնուրդում կատարվում է ռեակցիա՝ սինթեզվում են պատճեններ, քանի որ շղթան պարունակում է այս պրայմերի նուկլեոտիդները և պրայմերը միանում է շղթային: Եթե նուկլեոտիդները այլ են, պրայմերը չի միանում շղթային ակտիվ լոկուսում և սինթեզ չի կատարվում: Ապա թեստավորվում է երկրորդ պրայմերը: Այսպես բացահայտվում է գենոտիպը (http://docplayer.ru/46774071-Metody-raboty-s-dnk-pcr-restrikciya.html):

3.6.13. Նպատակային ՊՇՌ՝ մուտագենեզ վերածածկվող պրայմերների կիրառմամբ (Overlap extension PCR) Ինչպես գիտական նպատակներով՝ գեների արգելակման, հիվանդությունների առաջացման կամ իմունային պատասխանի ձևավորման մեխանիզմների բացահայտման համար և այլն, անպես էլ արտադրության խնդիրների լուծման նպատակով անհրաժեշտ է լինում փոփոխել ԴՆԹ-ի նուկլեոտիդների հերթականությունը՝ ներմուծել կամ արտահանել մեկ կամ մի քանի նուկլեոտիդ կամ փոխարինել դրանք՝ առաջացնելով նպատակային մուտացիա որոշակի կետում: ՊՇՌ-ի կիրառությամբ ԴՆԹ-ների շղթաների կազմ կետային մուտացիաների ներմուծման համար կատարվում է ՊՇՌ նպատակային մուտագենեզ վերածածկվող պրայմերների կիրառմամբ: Փորձի համար կիրառում են պրայմերների 2 զույգ. առաջին զույգը՝ A և A՛ պրայմերները, պարունակում են մուտանտ հերթականություն և կապվում են նպատակային մոլեկուլի տարբեր շղթաների հետ, երկրորդ զույգը՝ B և C պրայմերները, մուտացիաներ չեն պարունակում և օգտագործվում են ամբողջական շղթաների ամպլիֆիկացիայի համար (նկ. 3.27): Երկու փորձանոթներում, օգտագործելով մեկական՝ A կամ A՛ պրայմեր, կատարվում է մուտացիայի ներմուծում շղթաներից մեկի կազմ և ամպլիֆիկացիա: Յուրաքանչյուր պրայմեր սահմանափակում է կրկնապատկվող շղթան, և երկու փորձանոթներում սինթեզվող պատճեններն ունեն որոշակի կոմպլեմենտար մուտացիա պարունակող հատված: Կոմպլեմենտար շղթաներ պարունակող ռեակցիոն խառնուրդները միավորվում են, կատարվում է երկշղթա մոլեկուլների բնափոխում, ապա ռեկոմբինատիվ ռենատուրացիա, և առաջանում է դուպլեքս մոլեկուլ, որի երկու ծայրերը միաշղթա են: Դրանք լրացվում են ԴՆԹ պոլիմերազ ֆերմենտներով B և C պրայմերների օգտագործմամբ: Ձևավորվում է մուտացիա պարունակող ամպլիկոն: Նույն եղանակով, փոփոխման ենթակա շղթայի կազմ ներմուծելով նոր հատվածներ կամ եղած հատվածների արտանահման միջոցով ձևավորվում են դելեցիաներ կամ ավելացումներ՝ տրանսլոկացիաներ:

ՊlոայiltiոՃ

3' ....................... ....,,l'\,_ 5•

Պlոայiltiո Ճ' 5' ......;"\,.... ....................... 3'

3' •····----------------- 5·

Պlոայiltiո Շ

'11Շո

luա11 uո1111ut.11 ր uրաlլորո u '11:.նաոոոացtiա ոtiնաոոոացtiա

'ՊՊ\l,0 1.կո[tili եոագ Uոոանո 5 · - - - - - " ' ilոLեliոLti • --------------- + __________________ ,.,. Lոացոնl Uոոանո '1li0-ti անն.նtiltil.iացtiա

ՊlՇո 8 1., Ը 1.կոա1Liեոնեոti հեո

Նկ. 3.27. ԴՆԹ-ի կազմ մուտացիայի ներմուծում ՊՇՌ-ի մեթոդով: A և A՛ պրայմերների մուտացիա պարունակող հատվածները նշված են անկյունով, B և C պրայմերները՝ գծիկով (https://molpit.org/files/874_PatrushevL06.pdf):

ՊՇՌ-նպատակային մուտագենեզ վերածածկվող պրայմերների կիրառմամբ մեթոդը օգտագործվում է և այն դեպքերում, երբ անհրաժեշտություն է առաջանում նույն շղթայի կազմ ներմուծել մի քանի մուտացիաներ: Մուտանտ հատվածները ներմուծվում են կամ միասին՝ օղակաձև մոլեկուլի վրա նույն պրոցեսում տարբեր պրայմերների օգտագործմամբ, կամ որոշակի հերթականությամբ՝ փուլ առ փուլ, պրայմերների օգտագործման եղանակով:

3.6.14. Մուլտիպլեքսային կամ բազմապրայմերային ՊՇՌ (in silico PCR) ՊՇՌ-ի այս տարբերակի հիմքում ընկած է ամպլիֆիկացիայի պրոցեսում պրայմերների բազմաթիվ զույգերի միասնական օգտագործումը, որի արդյունքում զուգահեռաբար կատարվում է նմուշում առկա երկու և ավելի ԴՆԹ շղթաների միաժամանակ, զուգահեռ ամպլիֆիկացիա: Ներկայացվող եղանակը մշակվել է այն դեպքերի համար, երբ անհրաժեշտություն է առաջանում նմուշի կազմում բացահայտել հարուցիչների՝ տարբեր բակտերիաների, վիրուսների կամ այլ տեսակների ԴՆԹ-ի ներկայությունը, կամ հետազոտել որոշակի տեսակի ԴՆԹ-ում առանձնյակին բնորոշ ալելների կազմը: ՊՇՌ-ի հաջող և արդյունավետ ընթացքը պայմանավորված է օգտագործվող պրայմերների նուկլեոտիդային հերթականությամբ. դրանք պետք է չլինեն կոմպլեմենտար իրար նկատմամբ և չառաջացնեն դուպլեքսներ: Բացի դրանից՝ մեծ նշանակություն ունի վառոցքի ջերմաստիճանի ճշգրիտ որոշումը, որը կապահովի բոլոր պրայմերների հնարավորինս ուժեղ կապը համապատասխան հերթականությունների հետ և, ուրեմն, բոլոր ամպլիֆիկացվող ԴՆԹ հատվածների նույն քանակների առաջացումը: Ճշգրիտ արդյունքների ստացման և ախտորոշման համար անհրաժեշտ է, որ տարբեր հարուցիչների հետազոտվող ԴՆԹ հատվածները լինեն տարբեր չափերի և հեշտ տարբերակվեն դետեկցիայի փուլում: Մուլտիպլեքսային ՊՇՌ-ն լայնորեն օգտագործվում է տարբեր տաքսոնների՝ կենդանիների, բույսերի, միաբջիջ հարուցիչների ախտորոշման համար: Մուլտիպլեքսային ՊՇՌ-ն կիրառել է Ջոնգ Սուն Կիմը՝ մսի կազմում մի շարք հարուցիչների (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, Salmonella spp.) ախտորոշման համար:

Մուլտիպլեքսային մեթոդի կիրառմամբ կատարվում է մարդու սուր ռեսպիրատոր հիվանդություններ և ինֆեկցիոն էնցեֆալիտներ առաջացնող վիրուսների շտամերի ախտորոշումը, բացահայտվում է գենոմում գեների ալելային կազմը, որոշվում է գեների էքսպրեսիայի մակարդակը (Y.R. Park, E.M. Kim, Y.J. Lee, S.G. Yeo, C.K. Park, 2017): Տարբեր խնդիրների լուծման համար մշակվել են մուլտիպլեքսային ՊՇՌ-ի մի շարք մոդիֆիկացիաներ: Օրինակ՝ եթե ռեակցիոն խառնուրդ ավելացվեն նշադրված դՆԵՖ-ներ, ստացված ամպլիկոնները կնշադրվեն և հեշտ կախտորոշվեն: Վերջերս ստեղծվել է ռեալ ժամանակում ԴՆԹ-ի որոշման միկրոպլեքսային անալիտիկ համակարգ: 3.6.15. ՊՇՌ վեկտորի կլոնավորման համար ՊՇՌ-ի ներկայացվող մեթոդը կիրառվում է գենային ինժեներիայում և գենային թերապիայում վեկտորների անհրաժեշտ քանակի արտադրման համար: Այս դեպքում պրայմերների կազմում առկա են ռեստրիկազների պոլինդրոմային հերթականություններ: Ամպլիֆիկացիայի պրոցեսում, միանալով նպատակային շղթային, պրայմերները առաջացնում են նոր ծայրի ձևավորում: Նպատակային շղթաները ամպլիֆիկացվում են ՊՇՌ մեթոդով առնվազն 20 ցիկլի ընթացքում: Ստացված ամպլիկոնները մշակվում են համապատասխան ռեստրիկտազ ֆերմենտով և ապա միավորվում մի փորձանոթում նույն ռեստրիկտազով մշակված և կոմպլեմենտար կպչուն ծայրեր ունեցող պլազմիդների հետ՝ ձևավորվում են ռեկոմբինանտ վեկտորներ (նկ. 3.28):

ՄՄԼlll~կ'~կացԼյ.ոrt հաԼոl_ա6

3' ICCTAՇՇ I

I

5' i, ՇAT C ՇM

L.!........,--&lոHI 5fte

I

I

I TTCՇAAj5'

M At ՇՇ

T Tj3'

L.!._____--,--.

"l6ո-ո

Hindlll 5ite

L,ն 20 ցt,Lն

3' !GI

Հաոոժ oենորit,Liոագ ~երiժենոոյ j ր T T ՇGՃ j 5'

j

M Aj:i'

5' jՇATCC:: M

Ը___,--,

Lն-կ1ոն

oաո

U'7աgոli

l

'--llll/ոU ծt.յiրi

Lկլազ0'7flայ'7U Lլեljtոոf1'7 կLկ!ոLU նայflեf1'7u

Նկ. 3.28. Վեկտորներ ձևավորող ՊՇՌ-ի կատարման սխեման: Առաջին փուլում 5՛-3՛ ուղղությամբ ներմուծվում է առաջին ծայրին կոմպլեմենտար և պոլինդրոմ պարունակող պրայմերը, 2-րդ փուլում՝ հակառակ ուղղված շղթային կոմպլեմենտար պրայմերը: Հաջորդող փուլերում ստացված ամպլիկոնները կրկնապատկվում են 20 ցիկլի ընթացքում: Ռեստրիկտազ ֆերմենտի կիրառումից հետո նպատակային շղթաները և կպչուն ծայրերով պլազմիդները միավորվում են նույն փորձանոթում, կատարվում է ռեկոմբինացիա և ձևավորվում են նպատակային հերթականություններ պարունակող պլազմիդային վեկտորներ (http://docplayer.ru/46774071-Metody-raboty-s-dnk-pcr-restrikciya.html):

3.6.16. ՊՇՌ-ELISA (Immunocapture PCR –ՊՇՌ իմունային կլանումով) ՊՇՌ-ELISA մեթոդում միավորվում են հետազոտական իմունաքիմիական և մոլեկուլային մեթոդները: Իմունաֆերմենտային մեթոդը կարող է կիրառվել կամ հետազոտության սկզբնական, կամ վերջին փուլում: Փորձի համար օգտագործվում են բազմաթիվ մեկուսացված խորշեր պարունակող պլանշետներ, որոնց մեջ նախապես ներմուծվել և ամրացվել են տարբեր շտամերի կամ տեսակների նկատմամբ զգայուն կապող հակամարմիններ՝ ՀՄ-ներ: Հաջորդ փուլում խորշերի մեջ ավելացվում է նմուշը: Եթե նմուշի կազմում գտնվում է կապող ՀՄ-ով ճանաչվող հարուցչային ՀԾ-ը տեղի է ունենում ՀԾ*ՀՄ ռեակցիա և ձևավորվում է համալիր: Ապա խորշերի մեջ ներմուծվում են ԴՆԹ-ով նշադրված և հարուցիչների ՀԾ-ներին յուրահատուկ ՀՄ-ներ, որոնք նույնպես կապվում են հարուցչի ՀԾ-ի հետ: ՀԾ-ի առկայությունը նմուշում առաջացնում է բարդ համալիրի ձևավորում. կազմված է կապող ՀՄ-ից, հարուցչի ՀԾ-ից և ԴՆԹ-ով նշադրված յուրահատուկ ՀՄ-ից: Համալիրի դետեկցիան, այսինքն՝ հարուցչին բնորոշ ՀԾ-ի առկայությունը խորշում բացահայտվում է ԴՆԹ-ի նիշի ամպլիֆիկացիայի եղանակով՝ ՊՇՌ-ի միջոցով (նկ. 3.29):

Նկ. 3.29. ՊՇՌ-ELISA մեթոդի կատարման սխեման (Д.Ю. Рязанцев, Д.В. Воронина, С.К. Завриев, 2016):

Փորձում կիրառվում է կամ սովորական ՊՇՌ-ն, կամ ներդրված ՊՇՌ-ի մեթոդը: Այս մեթոդի կիրառությունը բարձրացնում է ախտո203

րոշման ճշգրտության աստիճանը, նպաստում յուրահատուկ ախտորոշման արդյունավետ ընթացքին: Մեթոդը կիրառվում է բույսերի ու կենդանիների հարուցիչների ախտորոշման համար: Վերջին տարիներին մշակվել են ՊՇՌ-ELISA մեթոդի մոդիֆիկացված եղանակներ, որոնք նախատեսում են ՀՄ-ԴՆԹ-նիշ համալիրի ձևավորման համար միջնորդ տարրերի օգտագործում: Դրանցից ամենաարդյունավետը և հուսալին նանոմասնիկների օգտագործման մեթոդն է: Օրինակ՝ ՀՄ-ները ֆիքսելու համար առաջարկվում է օգտագործել ոսկյա և մագնիսային նանոմասնիկներ: Բիոբարկոդինգի (biobarcodeassay) մեթոդում մագնիսային մասնիկները օգտագործում են կապող ՀՄ-ների հետ միացման, իսկ ոսկյա մասնիկները՝ թեստավորող յուրահատուկ ՀՄ-ների և դրանց հետ կապված ԴՆԹ-ների միացման համար: Իմունաակտիվ ռեակցիայի ավարտից հետո իմունային համալիրները հավաքվում են մագնիսով, իսկ ԴՆԹ շղթաները անջատվում են ոսկու մասնիկներից հետագա դետեկցիայի համար (նկ. 3.30):

Նկ. 3.30. Նանոմասնիկների օգտագործմամբ կատարվող ՊՇՌ-ELISA մեթոդի սխեման (J.M. Nam, S.J. Park, C.A. Mirkin 2002):

Դետեկցիան կարող է կատարվել, օրինակ, ՊՇՌ-ից հետո ստացված ամպլիկոնների էլեկտրաֆորեզային մշակման միջոցով: Այժմ ԴՆԹ-ի դետեկցիան կատարվում է սկանոմետրիկ վերլուծության եղանակով, այստեղից էլ մեթոդը ստացել է բիոբարկոդինգ (biobarcodeassay) անվանումը: Վերլուծության այս եղանակը հիմնվում է զոնդերի օգտագործման սկզբունքի վրա: Ապակյա մակերեսին ամրացվում են ԴՆԹ նիշի զույգ շղթայի կես երկարությամբ զոնդեր, ապա նիշերը կոմպլեմենտար միացնում են դրանց: Այնուհետև ներմուծվում են արծաթապատ ոսկյա նանոմասնիկներ, որոնց ամրացված են նիշի երկրորդ կեսին կոմպլեմենտար զոնդեր: Վերջին փուլում ավելացվում է արծաթը վերականգնող լուծույթ, և ԴՆԹ նիշի առկայության դեպքում համակարգը առաջացնում է դրական ազդակ:

3.7. ՊՇՌ-Ի ԱՐԴՅՈՒՆՔՆԵՐԻ ԴԵՏԵԿՑԻԱՅԻ ՄԵԹՈԴՆԵՐԸ ԵՎ

ԵՂԱՆԱԿՆԵՐԸ

ՊՇՌ-ի դետեկցիայի ժամանակակից մեթոդները բաժանվում են երեք հիմնական եղանակների. 1. Էլեկտրաֆորեզ ագարոզի կամ պոլիակրիլամիդային՝ ՊԱԱԴ դոնդողի վրա: 2. Ֆերմենտային հիբրիդացում: 3. Ֆլուորեսցենտ հիբրիդացում: Ֆլուորեսցենտ հիբրիդացման դեպքում դետեկցիան կատարվում է կամ ՊՇՌ-ի ավարտից հետո «վերջնակետի որոշման» եղանակով, կամ «ռեալ ժամանակում» կատարվող դետեկցիայի եղանակով: 3.7.1. Դետեկցիա էլեկտրաֆորեզի մեթոդով Մինչև վերջերս ԴՆԹ-ի դետեկցիայի ամենատարածված մեթոդը՝ հորիզոնական կամ ուղղահայաց էլեկտրաֆորեզը թույլ է տալիս բաժանել նմուշում գտնվող ԴՆԹ-ի շղթաները առանձին թորամասերի: Փորձի կատարման համար օգտագործվում է ագարոզային կամ պոլիակրիլամիդային՝ ՊԱԱԴ դոնդող:

Ձևավորված դոնդողը տարածական ցանցակալ է, որում շարժվում են ԴՆԹ-ի մոլեկուլները: Նույն չափսի մոլեկուլները շարժվում են նույն արագությամբ և դոնդողի վրա առաջացնում առանձին կուտակումներ: Առաջացած կուտակումների բացահայտման համար սովորաբար օգտագործվում են ներկանյութեր, օրինակ՝ բրոմէտիդիում, որոնք ներմուծվում են երկշղթա ԴՆԹ-ի շղթաների միջև և բացահայտվում ԴՆԹ-ի կուտակումների շրջանում (նկ. 3.31): Դետեկցիայի հիմքում ընկած է այս նյութերի ունակությունը լույսի ազդեցությամբ առաջացնել ֆլուորեսցենցիա: Նույն նպատակով օգտագործվող ներկանյութերի խմբից են SYBR (SYBRGreenI, SYBRGold), LCGreen, SYTO 9, YOPRO, BEBO և այլն: 5YBR Շրeeո IL.

o~աշրuaա 'YuԹ

5YBR Շրeeո IL. l:iflկ2'lfՀIա 'H.1Թ

--"- Վ ut.րկաCյյնLfil(! 81 tiCյU1t.րկա1աgզոul 1ոյUti արllազաlte ! Iյա

uհրljա ltյոfi!(! tiնյU1հրljա1աgզոul t I, ա րllաljոul լ ոLյU

Նկ. 3.31. SYBRGreenI ներկանյութի մոլեկուլները ներգրավվում են ԴՆԹ-ի զույգ շղթաների միջև՝ առաջացնելով ոչկովալենտ կապեր, և արձակում լույս (С.М. Бикбулатова и др., 2012):

Ֆորեզի ավարտից հետո դոնդողը տեղափոխվում է ՈՒՄ լույս (254-310 նմ) արձակող տրանսիլյումինատորի ֆիլտրի վրա: ԴՆԹ-ի մոլեկուլները կլանում են 260 նմ ՈՒՄ ճառագայթներ և փոխանցում էներգիան ներկանյութին: Ներկանյութը արձակում է էներգիա 580 նմ հատվածում՝ տեսանելի կարմրանարնջագույն միջակայքում: Արձակված լույսի պայծառության աստիճանը գնահատվում է 3, 4, 5 բալերով: ԴՆԹ-ի չափսերը որոշվում են ստանդարտ սանդղակի՝ տարբեր չափերի շղթաներ պարունակող ստուգիչ նմուշի (DNAladder) հետ համեմատման միջոցով: Ստուգիչ նմուշը ենթարկվում է էլեկտրաֆորեզի փորձնական նմուշների հետ միասին (նկ. 3.32):

Հիշեցնում ենք, որ ՊՇՌ-ի ավարտից հետո առաջացված նյութի քանակը անմիջականորեն պայմանավորված չէ նախնական նմուշի ԴՆԹ-ի քանակով: Հաճախ բիծի պայծառությունը նվազում է ինհիբիտորների ազդեցությամբ, այնպես որ արձակվող լույսի պայծառության մակարդակով կարելի է որոշել ԴՆԹ-ի շղթաների միայն մոտավոր քանակը:

Նկ. 3.32. Էլեկտրաֆորեզից հետո ստացված ֆորեգրամի լուսանկար. 1 - ստուգիչ ստանդարտ նմուշ, 2-6 - փորձնական նմուշներ (https://id.wikipedia.org/wiki/Berkas: Gel_electrophoresis_2.jpg):

Դետեկցիայի այս եղանակին բնորոշ են մի շարք թերություններ. պրոցեսը երկարատև է, կատարվում է առանձին փուլով, պահանջվում է տարածական մեկուսացում և հատուկ աշխատակից: Ստացված արդյունքները դժվար ճշգրտվող են և սուբյեկտիվ: Բացի դրանից՝ այս հետազոտությունը դժվար է ավտոմատացնել: 3.7.2. ՊՇՌ-ի դետեկցիայի քանակամրցակցային մեթոդ ԴՆԹ-ի քանակական որոշման համար կիրառվում են «ներքին ստուգիչներ»: Որպես ստուգիչ նմուշներ սովորաբար օգտագործվում են պլազմիդային ԴՆԹ-ներ: Օղակաձև պլազմիդները կտրտվում են, դառնում գծային, դրանց կազմ ներդրվում են նմուշ ԴՆԹ-ի պրայմերներին կոմպլեմենտար հատվածներ, փոփոխվում են նաև դրանց չափսերը. ստուգիչ նմուշը պետք է լինի հետազոտվող հատվածից մեծ և էլեկտրաֆորեզի պրոցեսում հեշտությամբ առաջացնի առանձին բիծ: Ստուգիչ նմուշները ենթարկվում են ՊՇՌ-ի փորձնական նմուշների հետ միասին: Քանի որ «ներքին ստուգիչներ»-ի քանակը հայտնի է փորձից առաջ, ապա, համեմատելով դրանց վերջնական քանակը

նմուշի վերջնական քանակի հետ, կարելի է մոտավոր որոշել փորձից առաջ ռեակցիոն խառնուրդ ներդրվող նմուշ ԴՆԹ-ի քանակը: Նշենք, որ ճշգրիտ արդյունքը ստացվում է այն դեպքում, երբ այդ քանակների հարաբերությունը մոտենում է 1:1-ի: Այս արդյունքին հասնելու համար ստուգիչ նմուշի և հետազոտվող նմուշի խտությունների հավասարեցման նպատակով փորձը կրկնվում է մի քանի անգամ՝ օգտագործելով ստուգիչ նմուշի տարբեր խտությունները: Ներկայացվող մեթոդի ճշգրտության աստիճանը պայմանավորված է նաև ստուգիչ և փորձնական նմուշների կրկնապատկումների հավասար արդյունավետությամբ: Ճշգրիտ արդյունքների հասնելու համար սովորաբար ձևավորում են մի շարք ստուգիչ նմուշներ, և ընտրվում է ամենահարմարը: 3.7.3. Հիբրիդացում ամպլիֆիկացիայից հետո Ամպլիֆիկացիայի արդյունքների դետեկցիայի մեկ այլ եղանակ է օլիգոնուկլեոտիդային զոնդերի օգտագործումը: Օլիգոնուկլեոտիդային զոնդը նշադրված ԴՆԹ-ի հատուկ սարքերով բացահայտվող շղթա է, որի հերթականությունը կոմպլեմենտար է նմուշ ԴՆԹ-ի որոշակի հատվածին: ՊՇՌ-ի արդյունքում առաջացող նյութի դետեկցիան կատարվում է ֆլուորեսցենցիայի դետեկտորի միջոցով: Ռեակցիոն խառնուրդում գտնվող նմուշները մշակվում են գրգռող ազդակով և արձակում ֆլուորեսցենտ լույս, որը և գրանցում է լուսային դետեկտորը: Ամեն մի փորձանոթի լուսային արձագանքը գրանցվում է առանձին, որոշակի դիրքում: Փորձանոթների անհրաժեշտ դիրքը ապահովվում է դետեկտորում փորձանոթները շարժող հատուկ սարքի օգնությամբ (նկ. 3.33): Ինչպես հետազոտվող ԴՆԹ-ի թիրախ հերթականությունների, այնպես էլ ներքին ստուգիչ նմուշների համար ընտրվում են հատուկ ֆլյուորոֆորներ: Դրանցով արձակվող լույսի ալիքներն ունեն տարբեր երկարություն և ֆիքսվում են առանձին: Նորագույն սարքերի օգտագործմամբ կատարվող դետեկցիան ՊՇՌ-ի անմիջական շարունակութ208

յունն է և իրականացվում է ՊՇՌ-ի համար օգտագործվող փակ փորձանոթներում, ուստի կոնտամինացիայի վտանգը բացառվում է, և դետեկցիան կարող է կատարվել նույն լաբորատորիայում: Նշենք նաև, որ դետեկցիան, ստացված արդյունքների վերլուծությունը և նմուշի պահպանումը կատարվում են ավտոմատ ռեժիմով:

Նկ. 3.33. Ֆլուորեսցենցիայի դետեկտոր սարքեր (https://dna-technology.ru/sites/default/files/gene-415.04.2020.pdf, http://www.spektronika.ru/):

Նմուշների հետազոտությունը ներկայացվող մեթոդով ավելի արագ է, իսկ ստացված արդյունքներն ավելի օբյեկտիվ են և ճշգրիտ: Բայց ներկայացված մեթոդը թույլ է տալիս ճշգրիտ կատարել միայն որակական վերլուծություն՝ որոշվում է ԴՆԹ-ի տեսակը, իսկ ԴՆԹ-ի քանակը նախնական նմուշում ճշգրիտ չի որոշվում: Իհարկե, փոփոխելով նմուշի խտությունը և համեմատելով ստացված արդյունքները ստուգիչ նմուշի արդյունքների հետ՝ ի վերջո հնարավոր է մոտավոր պատկերացում ստանալ ՊՇՌ-ի ենթարկվող նմուշ ԴՆԹ-ի քանակի մասին: Բայց այս եղանակը շատ աշխատատար է, մոտավոր և գրեթե չի կիրառվում լաբորատոր հետազոտություններում:

3.7.4. Դասական ՊՇՌ-ի թերությունները Ինչպես արդեն նշել ենք, դասական ՊՇՌ-ի պրոցեսում գրեթե անխուսափելի է կոնտամինացիան որի պատճառով ստացված արդյունքները շեղվում են իրականից: Ավելին, այն հանգամանքը, որ ստացված արդյունքների դետեկցիան կատարվում է առանձին փուլով, օրինակ՝ էլեկտրաֆորեզի միջոցով, ավելի է բարձրացնում առաջացած շեղումների գումարային մակարդակը: Դասական ՊՇՌ-ի եղանակը չի ապահովում նաև ստացված ամպլիկոնների կազմային բացարձակ նմանությունը, չի ապահովում մի քանի նուկլեոտիդով տարբերվող շղթաների տարբերակման հնարավորությունը, ուստի չի կարող օգտագործվել կետային մուտացիաների և քրոմոսոմային փոքր վերակառուցումների ախտորոշման համար: Ժամանակակից գիտական և առողջապահական հետազոտություններում մեծ է նմուշում ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի քանակական որոշման նշանակությունը: Հաճախ հետազոտման համար ընտրված նմուշը պարունակում է հարուցչի՝ վիրուսի կամ բակտերիայի գենոմի փոքր հատվածներ, և դրանց առկայության չափը նմուշում անմիջականորեն պայմանավորված է վարակվելիության և դեղամիջոցների ազդեցության աստիճանով: Ուստի քանակական հետազոտությունը մեծ նշանակություն ունի այդ պարագաների գնահատման համար: Քանակական որոշման մեթոդների բարելավումը այս պայմաններում դառնում է կարևորագույն խնդիր: Դասական ՊՇՌ-ի արդյունքների դետեկցիայի եղանակները չեն ապահովում նմուշի կազմում առկա նյութի ճշգրիտ քանակական որոշումը, այդ պատճառով ՊՇՌ հետազոտության արդյունավետությունը և օգտագործման բնագավառները մնում էին սահմանափակ, անբավարար: Հաշվի առնելով բոլոր նշված հանգամանքները, խնդիր դրվեց մշակել ՊՇՌ-ի այնպիսի տեխնոլոգիաներ, որոնք թույլ կտան դետեկցիան կատարել անմիջապես ԴՆԹ-ի կրկնապատկման պրոցեսում, որոշել ՆԹ-ների քանակը նմուշում, բացահայտել գենային և քրոմոսոմային միկրոմուտացիաները և, խուսափելով կոնտամինացիայի վտանգներից, ստանալ ճշգրիտ արդյունքներ:

3.8. ՊՇՌ ՌԵԱԼ ԺԱՄԱՆԱԿՈՒՄ՝ ՌԺՊՇՌ (REAL-TIME PCR)

ՊՇՌ-ի մեթոդի բարելավման նոր տեխնոլոգիան, որը ապահովում է որակական և քանակական դետեկցիայի բարձր մակարդակ և նվազեցնում

կոնտամինացիայի

ազդեցության

վտանգը,

դարձավ

ՊՇՌ-ն ռեալ ժամանակում՝ ՌՏՊՇՌ: Մեթոդի հայտնաբերումը կապված է R. Higuchi աշխատակիցներից մեկի՝ աշխատանքային պրոցեսի ընթացքում թույլ տրված վրիպումի հետ: Նա ՊՇՌ-ի կատարման ժամանակ ռեակցիոն լուծույթի կազմ էր ներմուծել բրոմէտիդիում: Ներկանյութը, ռեակցիոն խառնուրդում ակտիվ փոխազդելով նոր սինթեզվող երկշղթա ԴՆԹ-ի հատվածների հետ, արձակում էր լույս և կրկնապատկման փուլերը դարձնում տեսանելի: Այսպիսով՝ աշխատանքի ժամանակ կատարված սխալը դարձավ նոր տեխնոլոգիայի՝ ՌՏՊՇՌ-ի ստեղծման հիմք: ՌՏՊՇՌ-ի մեթոդի բարելավման համար առաջարկվեց կատարել ռեալ թայմ դետեկցիան ՊՇՌ-ի պրոցեսում ֆլուորեսցենտ ներկանյութերի օգտագործման միջոցով: Փորձի ընթացքում ֆլուորեսցենտ ներկանյութերի լուսային արձագանքները ըմբռնելու և գրանցելու համար ստեղծվեցին հատուկ ամպլիֆիկատորներ, և մշակվեցին նպատակային օպտիկական մոդուլներ: Հաշվի առնելով ԴՆԹ-ի շղթաների քանակի ավելացմանը զուգահեռ կատարվող ֆլուորեսցենտ արձագանքի ինտենսիվության աճը՝ հնարավոր դարձավ գրանցելով արձակվող լույսի ինտենսիվության մակարդակը ամեն ցիկլի վերջում, որոշել շղթաների քանակը ռեակցիոն խառնուրդում: ՊՇՌ ռեալ ժամանակում տարբերակը հնարավորություն է տալիս գրանցել կրկնապատկված ամպլիկոնների քանակը ռեալ ժամանակում փուլ առ փուլ: Այս հանգամանքի շնորհիվ ՊՇՌ ռեալ ժամանակում մեթոդը գիտահետազոտական և ախտորոշիչ հետազոտությունների ամենատարածված և ճշգրիտ եղանակն է: Մեթոդի կարևորագույն առավելությունն այն է, որ դրա կիրառմամբ հնարավոր է կատարել նմուշում առկա և ռեակցիայի ընթացքում առաջացող ՆԹ211

շղթաների անմիջական ուղիղ որակական և քանակական ախտորոշումը ՊՇՌ-ի պրոցեսում: Դետեկցիան կատարվում է առանց էլեկտրաֆորեզի փուլի, այսինքն՝ ախտորոշման համար չի պահանջում առանձին փուլ, ուստի կոնտամինացիայի ռիսկերը նվազեցվում են, իսկ ստացված արդյունքների ճշգրտության և զգայունության աստիճանը զգալիորեն բարձրանում է: Որպես նմուշ ռեալ ժամանակում ՊՇՌ-ի համար օգտագործվում են և ԴՆԹ-ն, և ՌՆԹ-ն, երկրորդ դեպքում նախ ՌՆԹ-ից ռևերտազ ֆերմենտի օգնությամբ սինթեզվում է կԴՆԹ, որը և օգտագործվում է ՊՇՌ-ում: ՊՇՌ ռեալ ժամանակում մեթոդի համար կիրառվող ռեակցիոն խառնուրդի կազմը տարբերվում է սովորականից. այս դեպքում ավելացվում է ֆլուորեսցենտ ներկանյութ, որն ամեն ցիկլի վերջում նոր սինթեզված երկշղթա ամպլիկոններին միանալուց հետո արձակում է լույս՝ ռեպորտային ֆլուորեսցենցիա: ՊՇՌ ռեալ ժամանակում մեթոդի բնութագրական առանձնահատկություններն են՝ 1) դետեկցիան կատարվում է ամեն փուլի վերջում և ոչ թե ռեակցիայի վերջնակետում, 2) դետեկցիան և քանակական վերլուծությունը կատարվում են անմիջապես ռեակցիայի պրոցեսում՝ ֆլուորեսցենտ ներկանյութերի օգտագործման եղանակով: 3.8.1. ՊՇՌ ռեակցիայի դինամիկան ՊՇՌ-ն օգտագործվում է նմուշում ՆԹ-ների քանակի ավելացման համար, քանի որ շատ հաճախ ՊՇՌ-ի համար օգտագործվող նմուշում դրա սկզբնական խտությունը ցածր է և բավարար չէ նպատակային խնդիրների լուծման համար: Համապատասխանաբար ՊՇՌ-ի սկզբնական փուլերում կապվող ներկանյութի քանակն էլ է նվազ, իսկ արձակված ազդակը՝ աննշան, խառնվում է, այսպես կոչված, ֆոնային ազդակի հետ: Ֆլուո212

րեսցենցիայի մակարդակը աճում է ցիկլից ցիկլ ամպլիկոնների քանակի աճին զուգահեռ՝ ամպլիկոնների քանակի ավելացմանը համապատասխան: Ամպլիֆիկացիայի ընթացքում ամեն տեսակի ԴՆԹ նմուշից ստացված ազդակներով կառուցվում է գրաֆիկ պատկեր՝ կինետիկ կոր: Դրանք կորաձև են, քանի որ համապատասխանում են ռեակցիայի պրոցեսում ամպլիկոնների կուտակման դինամիկ պատկերին: Ամպլիկոնների կուտակման դինամիկան գրաֆիկ պատկերի վրա բաժանվում է երեք փուլերի (նկ. 3.34). 1. Ներքևի սահմանային՝ ինիցիացիայի մակարդակի փուլ՝ Ct: 2. Էքսպոնենցիալ աճի փուլ: 3. Հարթակի մակարդակի փուլ: Uահllար..ա1'1ր.. ցj,lն Շt

կ1.11 1~1 յ

.:::S 1600

C- 1600

C.

Շյ

~

H-

3 1100 3 1200 ".:5 = 1= 3 = =~ 600

~ • Է

~'

+ I

T

:tլյարu

et

I'

... ա..

200 ..,-....

ա

-'Պ'

"

j +/ ,,~ r1

Pա ա1l 1I

գ t'

1կ00

-

~

աoo

=

/

a

' :/

+

5 ~ 0' 2

,A

VՎՎ Վ

C.

~ II

~

/ կ

8 10 12 1կ 16 18 20

2i

26 26

3)

32 3կ 36

կ0

-

կկ կծ կՑ 50 52

Ց 1'11.յlti հանա11□ Uահնանաiհն ցtil.յ1ե11Շ!

Նկ. 3.34. Գրաֆիկում ներկայացված են ռեալ ժամանակում թեստավորվող նմուշների ֆլուորեսցենցիայի կորերը: x առանցքի վրա նշված են ցիկլերի համարները, y-ի վրա՝ ֆլուորեսցենցիայի ինտենսիվության մակարդակները: Նարնջագույն գիծը նշում է առաջացվող պատճենների սահմանային խտությունը՝ Ct, որից հետո լուսային արձագանքը գրանցվում է (https://ppt-online.org/300043):

Ֆլուորեսցենցիայի ազդակը աննշան է ՊՇՌ-ի սկզբնական 3-15 ցիկլերում, երբ ԴՆԹ-ի շղթաների թիվը լուծույթում դեռևս նվազ է, ապա ամպլիֆիկացված նյութի քանակի աճին զուգահեռ ուժեղանում է և անջատվում ֆոնից. ֆլուորեսցենցտ ազդակի ինտենսիվությունը հասնում է ըմբռնելի մակարդակի: Ռեպորտային ֆլուորեսցենտ ազդակի աճող տվյալներով կառուցվում է ռեակցիայի կինետիկ կոր: Այսպիսով՝ առաջին ցիկլերի ընթացքում ֆլուորեսցենցիան բացակայում է, և այս փուլը կոչվում է բազային, իսկ ֆլուորեսցենցիան այս փուլում կոչվում է ֆոնային կամ պարզապես աղմուկ: Հաջորդ փուլի սկիզբը պայմանավորված է երկշղթա ամպլիկոնների նվազագույն սահմանային քանակի՝ Ct-ի սինթեզով: ԴՆԹ-ի ամպլիկոնների նվազագույն սահմանային քանակը առաջանում է յուրաքանչյուր նմուշի դեպքում կրկնապատկման որոշակի ցիկլում, որի համարը պայմանավորված է փորձնական նմուշում ԴՆԹ-ի պատճենների քանակով: Ինչքան ավելի բարձր է պատճենների խտությունը փորձնական նմուշում, այնքան ավելի շուտ՝ ՊՇՌ-ի ցիկլերի նվազ քանակից հետո է ձևավորվում ամպլիկոնի սահմանային խտությունը՝ Ct-ն: Ինչքան ավելի նվազ է նախնական նմուշում ԴՆԹ-ի շղթաների քանակը, այնքան ավելի շատ ցիկլեր են պետք նվազագույն սահմանային խտության մակարդակին հասնելու համար (նկ. 3.35): Նկար 3.35.1-ում ներկայացվում է ամպլիկոնների խտության և սահմանային քանակի՝ Ct-ի ձևավորման փոխկապվածության պատկերը և կինետիկական կորի կառուցման սկզբունքը: X առանցքի վրա ներկայացված են ՊՇՌ-ի ցիկլերի համարները, Y առանցքի վրա՝ ազդակի ինտենսիվության ցուցանիշները, այսինքն՝ ֆլուորեսցենտ ազդակի բացահայտման սահմանային մակարդակը: Ինչպես տեսնում ենք գրաֆիկում, տարբեր նմուշների համար Ct-ի մակարդակը ձևավորվում է տարբեր ցիկլերի վերջում:

Cյ

Ը:.

.I-'

..::,N ,.ooo

§-3,500

• 1(18 • 1(1/

Տ13,000

• 106

§i2,500

• 10!

10!i

~ 2.000

• 1()1

1 1.500

• lՀTՇ

0)

..::, 1,000 .I-'

ցi

.I-'

Ը:.

Շ,

C C

~

50-----------------~

Ը:5•5

i կ0 Շ:-35

Շ.

3 30

i 25

-::յ 20 ~

iթtրոol -3,36կ Y հաuոuol կ2 ,90

'-'որեlյ.Iյ!lt,uյյI>

£

0 --.-,--.,,---.,----,

::5

զոր6ակt,g 0.999

10 10"1o5րo 10

'l uԹ-ti tuոոզaiոuo ullո2ոul կ1ո110~ uljզրոll

Նկ. 3.35. Կինետիկ կորերի կառուցման և վերլուծման սխեման: 1 - կինետիկ կոր, որը կառուցվում է ՊՇՌ-ի ֆլուորեսցենտ եղանակով դետեկցիայի արդյունքներով: Ամենաբարձր խտությամբ՝ 108 նմուշը, հատում է Ct սահմանը 14-րդ ցիկլի վերջում՝ առաջին կարմիր կորը: Խտության նվազմանը զուգահեռ աճում է Ct սահմանը հատելու համար անհրաժեշտ ՊՇՌ ցիկլերի քանակը (http://www.iairas.ru/synopsises/petrov_disser.pdf): 2 - ստանդարտ կալիբրային կոր: ԴՆԹ-ի նախնական քանակի և Ct ցուցանիշների փոխկապվածության գրաֆիկ: Նմուշում ԴՆԹ-ի քանակի նվազումը պահանջում է ցիկլերի քանակի աճ Ct սահմանին հասնելու համար (http://www.iairas.ru/synopsises/petrov_disser.pdf, փոփոխված):

Նմուշի խտությունը փորձի սկզբում որոշելու համար նույն ԴՆԹի տարբեր, բայց նախապես հայտնի խտություններ պարունակող նմուշների ՊՇՌ-ի ցիկլերի դետեկցիայի արդյունքներով կառուցվում են դրանց կինետիկական կորերը: Ապա կինետիկական կորում ներկայացվող նմուշների խտության տվյալներով կառուցվում է գրաֆիկ պատկեր՝ ստանդարտ կալիբրային կոր, որը նկարագրում է նմուշում ԴՆԹ-ի խտության՝ X և Ct ցուցանիշների՝ Y փոխկապվածության պատկերը: Ստացված գիծը բացահայտում է Y ցուցանիշների փոփոխության չափը X-ի մեկ միավորով փոփոխման դեպքում: Գրաֆիկի թեքության անկյունը X առանցքի նկատմամբ կոչվում է՝ թեքում (նկ. 3.35.2): Նմուշի խտությունը նպատակային փորձում որոշվում է ստացված արդյունքների և կալիբրային կորի տվյալների համեմատման եղանակով: Ճշգրիտ կազմակերպված հետազոտության դեպքում, երբ ռեակցիոն խառնուրդում բացակայում են ամպլիֆիկացիան շեղող կամ դանդաղեցնող գործոնները, 1/10 խտությամբ տարբերվող նմուշների Ct ցուցանիշների տարբերությունը հավասար է մոտավորապես 3,3 ցիկլ: Նշենք, որ նկար 3.35.2-ում պատկերված գրաֆիկը արտացոլում է նմուշում ԴՆԹ-ի հատվածների խտության ցուցանիշների և համապատասխան Ct-ներ առաջացնող ցիկլերի ցուցանիշների փոխկապվածության բնույթը: Այս եղանակով կառուցված գրաֆիկ պատկերը կոչվում է ստանդարտ կալիբրային կոր և օգտագործվում է նմուշում ԴՆԹ-ի քանակի որոշման համար: Նշենք, որ ամեն առանձին ԴՆԹ նմուշի հետազոտման համար, օգտագործելով դրա տարբեր խտության լուծույթները, կառուցվում է կալիբրային ստանդարտ կորը: Ներկայացվող փորձի արդյունավետությունը հավասար է 99,9 % կամ 0,999 մաս: Կատարված հաշվարկները ցույց են տալիս, որ ճշգրիտ կազմակերպված ռեակցիայի արդյունավետությունը պետք է տատանվի 90-ից մինչև 110 % սահմաններում, իսկ 1/10 խտությամբ տարբերվող նմուշների Ct-ների ցուցանիշների տարբերությունը փոփոխվում է 3,58-3,1 սահմաններում:

ՊՇՌ-ի դինամիկան նկարագրող բանաձևը: ՊՇՌ պրոցեսի դինամիկան նկարագրվում է հիմնական բանաձևով, որի համաձայն՝ ԴՆԹ-ների շղթաների քանակի աճը ռեակցիոն լուծույթում պայմանավորված է նմուշում ԴՆԹ շղթաների քանակով, կատարված ցիկլերի քանակով և ռեակցիայի էֆեկտիվության մակարդակով. Pn = P0 · E n , (1) որտեղ Pn-ը ԴՆԹ շղթաների քանակն է n ցիկլի վերջում, n-ը՝ ՊՇՌ-ի ցիկլի համարը, P0-ն՝ ԴՆԹ շղթաների քանակը նմուշում փորձի սկզբում, E-ն՝ ռեակցիայի էֆեկտիվության մակարդակը, որը տեսականորեն հավասար է 2, քանի որ ռեակցիայի ճշգրիտ կազմակերպման պայմաններում յուրաքանչյուր փուլում ԴՆԹ-ի շղթաների քանակը պետք է կրկնապատկվի: Ինչպես տեսնում ենք ներկայացված բանաձևում, P0 ցուցանիշը նույն նմուշի դեպքում ազդում է Pn-ի մակարդակի վրա նույն չափով՝ անկախ ցիկլի համարից: Այսինքն՝ P0 ցուցանիշի ազդեցությունը Pn ցուցանիշի վրա անփոփոխ է և առաջացնում է սեփական խտությանը համապատասխանող փոփոխություն: Այսպիսով՝ բարձր P0-ն առաջացնում է խտության մեծ ավելացում ամեն ցիկլում և ԴՆԹ-ի անհրաժեշտ խտության նվազագույն սահմանը, և ռեպորտային ֆլուորեսցենցիան ձևավորվում է նվազ թվով ցիկլերի արդյունքում: P0-ի ցածր խտությունը առաջացնում է փոքր ավելացում և Pn ցուցանիշի դանդաղ աճ, ուստի խտության անհրաժեշտ նվազագույն սահմանը ձևավորվում է ցիկլերի ավելի մեծ համարի դեպքում: P0-ի բարձր խտության դեպքում ռեպորտային ֆլուորեսցենցիայի առաջացման համար անհրաժեշտ են նվազ թվով ցիկլեր, իսկ P0-ի ցածր ցուցանիշների դեպքում՝ մեծ քանակությամբ ցիկլեր: Ուստի ԴՆԹ-ի հատվածի P0-ի խտության մակարդակի և համապատասխան Ct-ի մակարդակի միջև առկա է ուղիղ բացասական կապ. P0-ի բարձր խտությանը համապատասխանում է Ct-ի ցածր համար:

Ռեալ թայմ ՊՇՌ-ի նմուշի բացարձակ քանակական գնահատում Բացարձակ քանակական գնահատման համար նախապես կատարվում է հետազոտվող ԴՆԹ նմուշի տարբեր հայտնի խտությունների ՊՇՌ, և ապա ստացված արդյունքներով կառուցվում է կինետիկական կալիբրային կոր: Հետազոտվող նմուշի ՊՇՌ-ի արդյունքում ստացված կորը համեմատվում է նախապես պատրաստված կալիբրային կորի հետ և որոշվում է ԴՆԹ-ի խտությունը նմուշում: Ռեալ թայմ ՊՇՌ-ի նմուշի համեմատական քանակական գնահատում Համեմատական քանակական գնահատման համար նախապես կատարվում է հետազոտվող ԴՆԹ պարունակող ստուգիչ լուծույթի խտության որոշում: Ապա հայտնի խտությամբ ստուգիչ լուծույթն ու հետազոտվող նմուշները ենթարկվում են ՊՇՌ-ի, և կառուցվում են կորեր: Համեմատելով փորձնական նմուշի և ստուգիչ լուծույթի կինետիկական կորերի պատկերները՝ որոշում են թիրախ ԴՆԹ-ի նախնական քանակը նմուշում: Անհրաժեշտ է նշել, որ հետազոտման արդյունավետ ընթացքի վրա մեծ ազդեցություն է գործնում նմուշի մաքրության աստիճանը. հնարավոր ինհիբիտորների ներկայությունը խոչընդոտում է ամպլիֆիկացիայի պրոցեսը: ԴՆԹ-ի երկշղթա մոլեկուլների քանակի ճշգրտման մեկ այլ մեթոդի դեպքում օգտագործվում են ԴՆԹ-ի տարբեր մոլեկուլների հալման ջերմաստիճանի ցուցանիշները: 3.8.2. Ֆլուորեսցենտ ներկանյութերը և դրանց օգտագործման եղանակները Ինչպես նշվել է, «ՊՇՌ ռեալ ժամանակում» մեթոդի երկրորդ առանձնահատկությունը ֆլուորեսցենտ ներկանյութերի՝ ֆլուորոքրոմների օգտագործումն է:

3.8.2.1. Ֆլուորոքրոմների բնութագիրը և տեսակները Ֆլուորեսցենցիան բնորոշ է ոչ բոլոր նյութերին: Օրինակ՝ սպիտակուցի կազմի 20 ամինաթթուներից միայն երեքն են ֆլուորոքրոմ՝ ֆենիլալանինը, տիրոզինը և տրիպտոֆանը: Նուկլեինաթթուների կազմի նուկլեոտիդները գրեթե չեն արձակում լուսային ազդակ: Վերջին տարիներին ստեղծվել են տարբեր ֆոտոֆիզիկական հատկանիշներ ունեցող բազմաթիվ արհեստական ֆլուորեսցենտ նյութեր: Ֆլուորեսցենցիայի հատկանիշով օժտված նյութերը պատկանում են չորս հիմնական խմբերին. փոքր օրգանական ներկանյութեր, լանտոնոիդների (Ln3+) համակարգող միացություններ, ֆլուորեսցենտ սպիտակուցներ և կիսահաղորդիչ նանոբյուրեղներ: Յուրաքանչյուր դասի նյութերին բնորոշ են որոշակի թերություններ և առավելություններ: Մենք կանդրադառնանք հետազոտություններում հաճախ օգտագործվող ֆլուորեսցենտ սպիտակուցների խմբի ֆլուորոքրոմների առանձնահատկություններին: Սպիտակուցային բնույթի առաջին բացահայտված ֆլուորոֆորը՝ կանաչ ֆլուորեսցենտ սպիտակուց (ԿՖՍ), անջատվել է կանաչ ջրիմուռներից՝ Aequoreavictoria (1962 թ.): ԿՖՍ-ն կլանում է լույսի կապույտ սպեկտրի ճառագայթները և արձակում կանաչ լույս: 1996 թ. ռենտգենային ճառագայթների դիֆրակցիայի եղանակով հետազոտվել է սպիտակուցի երրորդային կազմությունը: Սպիտակուցը ունի գլանաձև կազմություն, որի արտաքին շերտը կազմված է բետա-շերտերից: Ֆլուորոֆորը գտնվում է գլանի կենտրոնում և ձևավորվում է 3 ամինաթթուների մնացորդների՝ սերինի, տիրոզինի և գլիցինի քիմիական փոխազդեցության արդյունքում (նկ. 3.36): Հետազոտություններում բացահայտվել է, որ ֆլուորոքրոմի ձևավորման համար միակ անհրաժեշտ պայմանը բոլոր բազմաբջիջ օրգանիզմների բջիջների համար բնական թթվածնի ներկայությունն է: ԿՖՍ կոդավորող գենի միացումը որևէ այլ սպիտակուց կոդավորող գենի հետ թույլ է տալիս արտադրել հիբրիդային, ֆլուորեսցենտ հատկանիշներով օժտված սպիտակուց: Ավելի ուշ, կատարելով ֆլուո219

րոֆորի կազմի ամինաթթուների փոխարինումներ, ստեղծվեցին արհեստական մուտանտ ֆլուորեսցենտ ներկանյութեր: Դրանք ավելի երկար են արձակում լուսային ալիքը և ավելի ինտենսիվ, առաջացնում են կապույտ, դեղին, կարմիր և ինֆրակարմիր արձագանքներ:

Նկ. 3.36. Կանաչ ֆլուորեսցենտ սպիտակուց ԿՖՍ-ի մոլեկուլային կառուցվածքի սխեման (F. Yang, L. Moss, G. Phillips, 1996):

Արդեն ստեղծվել են ֆոտոակտիվացվող ֆլուորեսցենտ սպիտակուցներ (photoswitchable fluorescent proteins), որոնք միացվում կամ անջատվում են որոշակի գույնի լուսային ալիքներով: 2008 թ. մոլեկուլային կենսաբանության և կենսատեխնոլոգիայի զարգացման գործում ֆլուորեսցենտ սպիտակուցների աժդահա ազդեցության համար Սիմոմուրաին, Չալֆին և Թսիենին շնորհվեց Նոբելյան մրցանակ: Ֆլուորեսցենցիայի երևույթը պայմանավորված է մոլեկուլների էլեկտրոնների էներգետիկ մակարդակի փոփոխումով, որի պատճառ կարող են լինել լուսային՝ 300-400 նմ երկարությամբ կամ ՈՒՄ՝ 400800 նմ երկարությամբ ճառագայթները: Ֆլուորեսցենցիայի հատկանիշով օժտված նյութերը կոչվում են ֆլուորոքրոմներ: Ֆլուորոքրոմները կլանում են կվանտը և անցնում բարձր էներգեիկ մակարդակի վրա, ապա տեղի է ունենում ռելաքսացիա՝ վերադարձ նախնական մակարդակին, որի ժամանակ արձակվում է ավելի երկար ալիքով լուսային ազդակ: Լաբորատոր պայմաններում ֆլուորեսցենցիան ուսումնասիրում են սպեկտրոֆլուորիմետրերի օգնությամբ (նկ. 3.37): Արդեն ստեղծվել են սպեկտրոֆլուորիմետրերի բազմաթիվ տարատեսակներ:

Լl[աՄՄաՄ

'.!>ր1U111ե11

◊

=

c:.

U11aաljսաս '.տւrtlilflՇfl

լQ

+ .3s J,:, J,:,

c-

Նկ. 3.37. Հասարակ սպեկտրոֆլուորիմետրի կազմության սխեման: Սպեկտրոֆլուորիմետրը կազմված է լույսի աղբյուրից, կլանող և մոնոքրոմ լույս առաջացնող լուսային ֆիլտրից, նմուշ պարունակող խցիկից, արձակվող լույսը մշակող լուսային ֆիլտրից և դետեկտորից (https://A_scheme_of_fluorescence_detection.jpg):

Ֆլուորեսցենցիան բնութագրվում է մի շարք հատկանիշներով՝ ինտենսիվությամբ, որը պայմանավորված է կլանված կվանտերի քանակով, սպեկտրով՝ արձակված լույսի գույնով, երկարատևությամբ և արձագանքի կվանտային ելքով, որը բացահայտում է, թե ամբողջ կլանված կվանտերի որ մասն են կազմում արձակված կվանտերը: Հայտնի են առանձին նյութեր, որոնք արգելակում են ֆլուորեսցենցիան՝ հանգցնում այն: Այս նյութերը կոչվում են ֆլուորեսցենցիայի արգելակիչներ (quencher): Ֆլուորեսցենցիայի արգելակիչները օգտագործվում են ԴՆԹ-ի զոնդերի ձևավորման համար: Յուրահատուկ երևույթ է էներգիայի Ֆեստերյան ռեզոնանսային փոխանցումը (Ferster resonance energy transfer, FRET), որի ժամանակ երկու ֆլուորոքրոմների միջև կատարվում է էներգիայի փոխանցում դոնոր՝ D ֆլուորոքրոմից ակցեպտոր՝ A ֆլուորոֆորին: Այսպիսով, գրգռելով դոնոր ֆլուորոքրոմը, կարող ենք ստանալ ֆլուորեսցենտ ազդակ ակցեպտորից (նկ. 3.38):

թեsնD)

~

.m1A

eո(Ծ/

/c□

@ FԲԲT @ aւs(O( eոնOյ

•ւs(Ճյ

~

Նկ. 3.38. FRET-ի իրականացումը դոնորի լույսի արձակման D և ակցեպտորի կլանման A սպեկտրերի համընկման դեպքում (J.R. Lakowicz, 2006):

FRET-ի իրականացման կարևոր պայման են դոնորի արձակվող և ակցեպտորի կլանվող լույսի սպեկտրերի համընկնումը և դրանց մոտ հարևանությունը միջավայրում (նկ. 3.39):

~ /

L.L__

_ ~

____::,,._~ - ---1

L__- =_

__,t,__

____

Նկ. 3.39. FRET-ի իրականացումը պայմանավորված է դոնորի և ակցեպտորի տարածական հարևանությամբ (J.R. Lakowicz, 2006):

3.8.2.2. Ֆլուորեսցենտ ներկանյութով կատարվող դետեկցիայի առավելությունները Ֆլուորեսցենցիան որպես դետեկցիայի եղանակ զգալիորեն գերազանցում է այլ եղանակները զգայունության մակարդակով և հնարավորություն է տալիս բացահայտել նույնիսկ առանձին մոլեկուլներ: Մեթոդը կիրառվում է ինչպես ԴՆԹ-ների սեկվենացիայի, այնպես էլ գերբարձր թույլատվությամբ լուսային ֆլուորեսցենտ մանրադիտարկման համար: Տարբեր գունային ազդակ արձակող ֆլուորոքրոմների գոյության շնորհիվ հնարավոր է միաժամանակ կատարել մի քանի նյութերի դետեկցիա:

Ֆլուորոքրոմների անվտանգության շնորհիվ հետազոտությունները կարող են կատարվել առանձին կենդանի բջիջների կամ ամբողջական օրգանիզմների վրա: Տեսանելի ֆլուորեսցենտ լույսը չի կլանվում օրգանիզմի մակրոմոլեկուլներով, ջրով և այլ կենսական նյութերով և չի ազդում օրգանիզմի կենսագործունեության վրա: Վերջին տարիներին ստեղծվել են բազմաթիվ սպիտակուցային բնույթի ֆլուորոքրոմներ, որոնք, լինելով կենսահամատեղելի, կարող են միացվել օրգանիզմների տարբեր պրոտեիններին: Օրինակ՝ ստեղծվել են գենոմի կազմում eGFP ֆլուորոքրոմը կոդավորող գեն պարունակող և վառ կանաչ գույն արձակող լաբորատոր մկներ: Ֆլուորեսցենցիան արագ պրոցես է, որի շնորհիվ կարող է օգտագործվել արագ կատարվող փոփոխությունների՝ սպիտակուցի կոնֆորմացիայի փոփոխման հետազոտման համար: Ֆլուորեսցենցիան թույլ է տալիս բացահայտել և տարբերակել մի քանի տասնյակ նմ հեռավորության վրա գտնվող օբյեկտներ՝ ապահովելով մանրադիտակային հետազոտությունների բարձրագույն զգայունություն և ճշգրտություն (STED, PALM և այլն): 3.8.2.3. Ֆլուորեսցենտ նիշեր և զոնդեր Կենսաբանական հետազոտություններում օգտագործվող ֆլուորեսցենտ տարրերը դասվում են երկու խմբի՝ ֆլուորեսցենտ նիշեր և ֆլուորեսցենտ զոնդեր: Ֆլուորեսցենտ նիշերը օգտագործվում են նյութերի առկայությունը կամ տարածական դասավորությունը բացահայտելու համար: Այս պատճառով նիշերը պետք է ունենան երկարատև ֆլուորեսցենտ ազդակ, լինեն ստաբիլ և կայուն միջավայրի ազդեցությունների նկատմամբ: Այսինքն՝ նիշերը գործում են որպես մոլեկուլային փարոս և, մնալով կապված նշադրվող մոլեկուլի հետ, բացահայտում են դրա առկայությունը և տեղակայման վայրը: Ֆլուորեսցենտ զոնդերը ավելի բարդ կազմակերպված միավորներ են: Դրանք կարող են լինել միացված կամ անջատված վիճակում,

և վիճակին համապատասխան փոխվում է դրանց ֆլուորեսցենցիայի ինտենսիվությունը կամ երկարատևությունը: Ֆլուորեսցենտ զոնդը կազմված է ռեցեպտորից, որով կապվում է թիրախ մոլեկուլին՝ անալիտին, և ֆլուորոֆորից: Ֆլուորոֆորը, կապվելով անալիտի հետ, փոխում է ֆլուորեսցենտ ազդակի ձևը՝ կամ ուժեղացնում, կամ թուլացնում կամ փոխում լուսային ազդակի գույնը (նկ. 3.40):

Ճ

~ ~~

~ ~~

Շ

~ ~~

Նկ. 3.40. Ֆլուորոֆորի արձագանքի տեսակները անալիտի հետ կապի առաջացման վրա: А - արձագանքը ուժեղանում է, В - արձագանքը թուլանում է, С - փոխվում է լուսային ազդակի գույնը (J.R. Lakowicz, 2006):

Մեկ այլ խումբ են կազմում Ռեալ ժամանակում ՊՇՌ-ի դետեկցիայի համար մշակված զոնդերը: Դրանք հաճախ պարունակում են ֆլուորոֆոր և ֆլուորեսցենցիայի արգելակիչ: Ֆլուորեսցենցիայի արգելակչի մոլեկուլը կլանում է ֆլուորոֆորի ազդակի լուսային ալիքները: Ուստի էներգիան առանց արձակման տեղափոխվում է ֆլուորոֆորից արգելակչին և ցրվում: Զոնդերի օգտագործման կարևորագույն առավելությունն այն է, որ, կապվելով ԴՆԹ-ի շղթային միայն որոշակի հերթականության հետ, դրանք հնարավորություն են տալիս կատարել հետազոտվող շղթաների ինչպես որակական այնպես էլ քանակական դետեկցիան: 3.8.3. «Ռեալ ժամանակում ՊՇՌ»-ի կատարման կարգը Ինչպես նշվել է, «ՊՇՌ ռեալ ժամանակում» ռեակցիայի կատարման համար ռեակցիոն խառնուրդ են ներմուծվում ֆյուորեսցենտ ներկանյութ կամ ֆլուորեսցենտ նշադիր կրող օլիգոնուկլեոտիդներ՝ զոնդեր: Ռեալ ժամանակում ՊՇՌ կատարող ամպլիֆիկատորը պետք է ունենա դետեկցիայի օպտիկական մոդուլ և արդյունքների վերլուծման սարք: Այդ ֆունկցիաները կատարում են ամպլիֆիկատորի կազ224

մում առկա լույսի աղբյուրը և ֆլուորեսցենտ արձագանքը ըմբռնող և գրանցող հաշվիչ համակարգը: Ստացված արդյունքների գրանցումը և վերլուծությունը կատարվում է ավտոմատ եղանակով: Ֆլուորեսցենցիայի արձագանքը գրանցող սարքի կառուցվածքը և աշխատանքի մոդուսը ներկայացվում են 3.9.1 բաժնում: 3.8.3.1. Դետեկցիա նիշ բնույթի SYBR GreenI-ի օգտագործման եղանակով Ռեալ ժամանակում ՊՇՌ-ի կատարման համար օգտագործվում են մի քանի սկզբունքով գործող ֆլուորեսցենտ ներկանյութեր: Օրինակ՝ համապատասխան չափսի և քիմիական ակտիվությամբ մի խմբի ինտերկալացվող ֆլուորեսցենտ ներկանյութերի՝ ԻՆ մասնիկները գործում են որպես մոլեկուլային ներդիրներ և ունակ են ներմուծվել ԴՆԹ-ի երկու շղթաների նուկլեոտիդների միջև և նշադրել երկշղթա հատվածները (նկ. 3.41):

.

•

• • • • • • +-• Uրաշրնթա հաոL[ածնե17[1 Iեն

•

•

ՏՀBԲ Gրeeոl- LjաLկL[ոil t ե11Lյ211րթա '1նրթ-ti 211րթա1tiն

LjաLկL[ոil նե17Ljան1որթtiն

Նկ. 3.41. SYBR Green I ներկանյութի ազդեցության մեխանիզմի սխեման (https://m-hub.jp/wp-content/uploads/2019/09/img238-1_01.png):

SYBR GreenI-ի հաճախ օգտագործվող ներկանյութ է, որի մասնիկները, ներմուծվելով ԴՆԹ-ի շղթաների միջև, զսպանակի փոքր փոսիկի շրջանում կապվում են երկշղթա մոլեկուլի հետ: SYBR GreenIի ֆլուորեսցենցիան թեթևակի գրգռվում է 260 նմ լուսավորմամբ, իսկ հիմնական գրգռումը տեղի է ունենում 470 նմ և 495 նմ ճառագայթման պայմաններում, էմիսիայի կամ արձակվող լույսի ալիքի երկարությունը

հավասար է 520 նմ, արձագանքի ինտենսիվությունը գերազանցում է նախնական ազդակի ինտենսիվությունը 800-1000 անգամ (նկ. 3.42):

Ը Ը --=r

ii:.

ր

.Ը. .յ.յ

s

.Ը. .Ը. .:::1'

§:

2.

q

.. . . . . ... . . .. .. . . . LոնայրՇi աLP!lP t:երttա11որթյոՇiն Շio. x

3 ~"-"N••ո• • կ"~-ա•-~--~ ~ ~•~-կ~ --~ M9աM••~ -

.5

Նկ. 3.42. SYBR GreenI ներկանյութի ֆլուորեսցենցիայի տվյալները. Ա - լույսի առավելագույն կլանվող ալիքների երկարությունը՝ 260, 470 և 495, Բ - արձակվող լույսի ալիքների երկարությունը՝ 520 նմ (https://works.doklad.ru/view/kqYLIlNbfDc/all.html):

SYBRGreen ներկանյութը երկշղթա ԴՆԹ-ների շատ զգայուն ինդիկատոր է: Այն բացահայտում է արհեստական կարճ օլիգոնուկլեոտիդների 1-2 նգ և բնական երկշղթա ԴՆԹ-ների մինչև 20 պիկոգրամը: SYBR Green-ի յուրահատկության աստիճանը երկշղթա ԴՆԹների նկատմամբ ավելի բարձր է, քան ԻՆ խմբի այլ ներկանյութերինը, իսկ մուտագենության աստիճանը անհամեմատ ցածր է: Ներկայացվող մեթոդը ամենահասանելիներից է և հեշտ կատարվող: Բայց արդյունքների ճշգրտությունը պայմանավորված է նմուշի և միջավայրի ստերիլության աստիճանով, կոնտամինացիայի և դուպլեքսների առաջացման հնարավորության չեզոքացման արդյունավետությամբ:

3.8.3.2. Real Time ՊՇՌ-ի կատարման կարգը SYBR Green-ի օգտագործմամբ Հետազոտությունը կատարվում է կամ ռեակցիոն խառնուրդի ֆիրմային հավաքածուների օգտագործմամբ, կամ դրա ինքնուրույն պատրաստմամբ: Փորձի կատարման համար անհրաժեշտ է նախապատրաստել և ախտահանել բոլոր օգտագործվող սարքերը, լաբորատոր ամանեղենը և նյութերը, այդ թվում՝ - սովորական լաբորատոր սարքավորումներ, - թերմոցիկլերից, օպտիկական սարքից և համակարգիչից կազմված հատուկ ռեալ թայմ ՊՇՌ-ի ամպլիֆիկատորներ, - վորտեքս, - հատուկ փորձանոթներ, - միկրոպիպետներ: 50 մկլ ռեակցիոն խառնուրդի չափով անհրաժեշտ նյութեր՝ 1. ՊՇՌ բուֆեր՝ 5 մկլ 2. dATP, dGTP, dUTP, dCTP, յուրաքանչյուրը 0,2 մկլ չափով 3. Taq-պոլիմերազ ֆերմենտ 4. Ռեակցիոն խառնուրդի рН-ի մակարդակը ապահովող բուֆեր 5. MgCl2- Taq-պոլիմերազի կոֆերմենտ 6. Կրկնապատկվող ԴՆԹ հերթականության ծայրային հատվածների 20-40 նուկլեոտիդներին կոմպլեմենտար պրայմերներ 7. ԴՆԹ մատրիցաներ՝ կրկնապատկման ենթարկվող նմուշներ 8. Ապաիոնացված ջուր՝ խառնուրդի ծավալի ապահովման համար 9. SYBR Green ներկանյութ 10. ROX ներկանյութ Աշխատանքի փուլերը. 1. Բոլոր ռեագենտները նախապատրաստել: 2. Ստերիլ փորձանոթում խառնել բոլոր նյութերը աղյուսակում ներկայացվող չափաքանակներով:

tuոոզaյոtUլl 1ոu'lոյրaոo 1.յյորati յ?աUաl.jլl 5ն01.jլ. iոu'lո1ր;iոo lն5"lՇո րո:jlեfl I5 5 ol11. 100.l'ոfմATP, մՇTP, մUTP, մCTP 0.2 oM iոոարաu5iոոհ 1 .QUI. "lլlայLlՇլl 1 (5 olj M) 0.1 oljM 1 0կ1 "lլlայLlելl 2 (5 oljM) 0.1 olj M 1 0կ1. 5Y8RՇրeeո 0.1250111. RնX 0.26 ol.յ1. Taզ- 'luրa Lկո1tioliրiազ 1.25 oրաlլորi 0.5 ol.յ1. 25 oMMgC!i 5 oM 10 ou1. ն.l- l t11.jզ. "lայLlաUաLլորiLլա6 t 'luրa oաորitigա uoոշti tuոորaiո uոi.լ ULկարոuրզաglլա6 2որi otiu2L. 50 0կ1 . u յո Lio

3. Խառնել վորտեքսում և տեղադրել ամպլիֆիկատորում բոլոր պատրաստված փորձանոթները: 4. Ծրագրավորել ՊՇՌ-ի ընթացքը՝ ջերմաստիճանի փոփոխությունները, ցիկլերի քանակը և այլն, ապա սկսել ռեակցիան: Առաջնային բնափոխումը կատարել է 95 ºС պայմաններում, իսկ տևողությունը որոշել նմուշի չափսով: Ամեն ցիկլում բնափոխումը կատարել 95 ºС պայմաններում, 30 վրկ տևողությամբ: Պրայմերների վառոցքը կատարել 60-65 ºС պայմաններում, 20-30 վրկ տևողությամբ: Էլոնգացիան կատարել է 70-72 ºС պայմաններում, 1 րոպե տևողությամբ: Այնուհետև կատարել ֆլուորեսցենտ ազդակի դետեկցիա: Ամպլիֆիկացիայի ցիկլի՝ բ-ից ե կետերը կրկնել 30-40 անգամ: Հալեցման կորերը կառուցել 95-60 ºС սահմաններում, 0,2 վրկ ինտերվալով: Հիշեցում. 1. SYBR Green ներկանյութը լույսի տակ արագ քայքայվում է, այդ պատճառով բոլոր աշխատանքները պետք կատարել արագ մուգ փորձանոթներում: 2. Պրայմերների դուպլեքսների առաջացումը բացառելու համար պետք է սահմանափակել պրայմերների վառոցքի փուլը լիովին բավարար 15-20 վայրկյանով:

3. Քանի որ SYBR Green ներկանյութը ապահովում է ճշգրիտ արդյունքների ստացում, C(T)-ի 35-38 ցուցանիշի դեպքում ՊՇՌ-ի ցիկլերի քանակը կարող է սահմանափակվել 40-ով: 4. SYBR Green ներկանյութով դետեկցիայի կատարման համար անհրաժեշտ է կառուցել կալիբրային կինետիկ կոր և ստացված արդյունքները համեմատել կորի հետ (նկ. 3.34.2): Ներկայացվող մեթոդի կարևորագույն թերությունը դրա յուրահատկության ցածր մակարդակն է: Փաստորեն ռեակցիոն խառնուրդում առկա բոլոր երկշղթա ԴՆԹ-ի հատվածները, անկախ դրանց նուկլեոտիդային հերթականությունից, կապվում են ներկանյութով՝ ինչպես նպատակային ամպլիֆիկացվող նմուշները, այնպես էլ կոնտամինացիայի արդյունքում առաջացվողները կամ պրայմերների դուպլեքսները: Սկզբնական շրջանում ամենահաճախ օգտագործվող ինտերկալացվող ներկանյութը SYBR Green I-ն էր: Դրա արձակած լույսի ալիքի երկարությունը հավասար է 520 նմ է, իսկ արձակման ինտենսիվությունը երկշղթա ԴՆԹ-ի ներկայությամբ բարձրանում է մոտ 100 անգամ: Բայց պարզվեց, որ SYBR Green I ներկանյութի բարձր խտությունները ԴՆԹ պոլիմերազ ֆերմենտի ակտիվության ինհիբիտորներ են և կարող են առաջացնել դետեկցիայի կեղծ բացասական արդյունք: Այս պատճառով վերջին տարիներին Ռեալ ժամանակում ՊՇՌ-ի համար օգտագործվում են նույն հատկանիշներ ունեցող, բայց ԴՆԹ պոլիմերազի ակտիվությունը չարգելակող SYTO 9, LC Green և Eva Green ներկանյութերը: Ինչպես նշվել է, ինտերկալացող ներկանյութերը, լինելով ոչ յուրահատուկ, հավասար փոխազդում են ռեակցիոն խառնուրդում առկա բոլոր երկշղթա ԴՆԹ-ների հետ: Ուստի դետեկցիայի արդյունքները կարող են շեղված լինել և ճշգրիտ պատասխան ստանալու համար անհրաժեշտ է կատարել լրացուցիչ հետազոտություն, օրինակ՝ շղթաների հալեցում: Ինտերկալացվող ներկանյութերի՝ ԻՆ-ների յուրահատկության ցածր աստիճանը խնդիր դրեց մշակել դետեկցիայի ավելի ճշգրիտ և

յուրահատուկ մեթոդներ: Օրինակ՝ դետեկցիա մոդիֆիկացված ֆլուորեսցենտ դեզօքսիռիբոնուկլեոտիդային զոնդերի օգտագործմամբ, որը ապահովում է և որակական դետեկցիայի բարձր մակարդակ, և ճշգրիտ քանակական ախտորոշման հնարավորություն: 3.8.3.3. Օլիգոնուկլեոտիդային զոնդերի նշադրման համար օգտագործվող ֆլուորոքրոմները և արգելակիչները Զոնդը Ռեալ թայմ ՊՇՌ-ի կարևոր գործոնն է, որը, լինելով կոմպլեմենտար երկու պրայմերի միջև գտնվող թիրախ ԴՆԹ-ի նուկլեոտիդային հերթականությանը, կատարում է թիրախ մոլեկուլների ընտրություն և նշադրում է դրանց կրկնապատկման պրոցեսը:

Նկ. 3.43. Զոնդի կազմում ներկանյութերը կարող են դասավորվել տարբեր եղանակով: Նկարում FAM - BHQ1 ներկանյութերը դասավորված են կամ զոնդի ծայրերում, կամ երկար զոնդերում արգելակիչը գտնվում է զոնդի միջին հատվածում և կապված է շղթայի թիմիդինի կան ցիտոդինի հետ (www.syntol.ru/catalog/zondy-dlya-ptsr-v-realnom-vremeni/):

Զոնդի կազմում առկա ֆլուորոֆորը և ֆլուորեսցենցիայի արգելակիչը կարող են գտնվել զոնդի ծայրերում կամ այլ կերպ դասավորվեն դրա կազմում (նկ. 3.43): Զոնդերի կազմում հաճախ են օգտագործվում մի շարք լավ հետազոտված ներկանյութեր: Դրանց կլանման և արձակման լուսային ալիքների տվյալները ներկայացվում են աղյուսակներ 3.1 և 3.2-ում:

Աղյուսակ 3.1 Սինտոլ ֆիրմայի ֆլուորեսցենտ ներկանյութերի կլանվող և արձակվող լույսի տվյալները

lրtոորitնցtնոո CյtրկաCյյոր

l կ1ui11lաCյ ll~u. Cյll

FAM

կ90

Aալl ն~~ա(յ ~~u. Cյll.

R6Շ

TAMRA

RնX

6 10

Cy5

6կ5

Cy5.5ոeա

Աղյուսակ 3.2 Սինտոլ ֆիրմայի ֆլուորեսցենցիայի արգելակչի կլանող և արձակող լույսի տվյալները

l>1ոորil:iugեCյg~այ~ ալlզl:iլակ~l RTQ-lոeա

l. կ1 աCյ.:iաCյ

նill.

կ70-570 կ80-580

8HQ-1

llակu. Uրiզl:i1 ակ.:iաCյ uահllաCյCյl:iրio նill

8HQ-2

550-650

RTQ-2ոeա

53 ~

580-670

8HQ-3

620-730

New՝ նշված են և նոր ստեղծված, և արտադրվող տարբերակները:

ՊՇՌ-ի արդյունավետ կատարման համար անհրաժեշտ է, որ ֆլուորոֆորի արձակվող լուսային ազդակի սպեկտրը վերածածկվի արգելակիչի կլանման սպեկտրով, այսինքն՝ ֆլուորոֆորի և արգելակիչի փոխազդեցությունը պետք է ապահովի արձակվող ազդակի ամբողջական կլանում: Ֆլուորոֆոր-արգելակիչ զույգի ընտրության համար օգտագործվում է ստորև բերվող արձակման և կլանման սպեկտրների գրաֆիկները (նկ. 3.44):

FՃM

կ50

Բ66

Շy5

ԲOX

Շy5.5

Նկ. 3.44. Գրաֆիկում գծով նշված են ֆլուորոֆորների լուսային ազդակի սպեկտրները, կորերով՝ համապատասխան արգելակիչների կլանման սպեկտրի սահմանները (www.syntol.ru/catalog/zondy-dlyaptsr-v-realnom-vremeni/):

RTQ1, RTQ2 (Real Time Quencher) արգելակիչները նոր են և ստեղծվել են վերջին տարիներին: Դրանք բնութագրվում են FAM և ROX ֆլուորոֆորների ազդակների կլանման՝ 1,5-2,0 անգամ բարձր արդյունավետությամբ: Ըստ ներկայացվող տվյալների՝ ֆլուորոֆոր-արգելակիչ զույգերի փոխազդեցության գնահատման համար կազմվել է աղյուսակ (նկ. 3.45):

+ +

+ + + +

+ + + +

Նկ. 3.45. Ֆլուորոֆոր-արգելակիչ զույգերի փոխազդեցության գնահատման աղյուսակ: «+» նշանը դրվում է տողերի և սյունակների խաչընկման վանդակում, եթե դրանց համապատասխանող ներկանյութերի փոխազդեցությունը արդյունավետ է (www.syntol.ru/catalog/zondy-dlya-ptsr-v-realnom-vremeni/):

Սինթեզվող զոնդերի մաքրության բարձր աստիճանը արդյունավետ ՌԹ-ՊՇՌ-ի կատարման կարևոր պայման է: Զոնդերի մաքրումը կատարվում է երկու եղանակով՝ էլեկտրաֆորեզ ՊԱԱԴ-ում և բարձր արդյունավետ հեղուկային քրոմատոգրաֆիա:

Զոնդերի մաքրության բարձր աստիճանը թույլ է տալիս խուսա պրոցեսում թերի զոնդերից և մնացորդային ֆլուորոֆորներից ստացվող կեղծ ազդակների ազդեցություններից, դրանով իսկ ապահովելով ստացված արդյունքների ճշգրտության բարձր աստիճան: 3.8.3.4. «ՊՇՌ ռեալ ժամանակում» ֆլուորեսցենտ հիբրիդացնող զոնդերի կիրառման եղանակով Ռադիոակտիվ տարրերով նշադրված օլիգոնուկլեոտիդները ՊՇՌ-ի դետեկցիայի համար առաջին անգամ օգտագործվել են ԱՄՆում: Ռադիոակտիվ ճառագայթն արձակվում էր Taq պոլիմերազի 5՛-3՛ ազդող էնդոնուկլեազային ակտիվության շնորհիվ, որի ազդեցությամբ օլիգոնուկլեոտիդի նշադիրը անջատվում էր: Բայց 32Р դետեկցիան կատարվում էր ՊՇՌ-ի ավարտից հետո՝ առանձին փուլով, բավականին բարդ մեթոդով (Holland, Abramson, Watson, Gelfand, 1991): Չնայած մեթոդին բնորոշ բազմաթիվ թերություններին՝ այն դարձավ առաջին հիմնաքարը ֆլուորեսցենտ նշադրված օլիգոնուկլեոտիդային զոնդերի տեխնոլոգիայի մշակման համար: Հիբրիդացնող զոնդերի կարևոր առանձնահատկությունն է դրանց կոմպլեմենտառությունը ամպլիֆացվող նպատակային ԴՆԹ-ի նուկլեոտիդային հերթականություններին: Դրա շնորհիվ զոնդերը կապվում են նպատակային շղթաների հետ և նշում դրանք: Մյուս առանձնահատկությունն այն է, որ զոնդերի օգտագործման շնորհիվ շղթաների քանակական ախտորոշումը կատարվում է ՊՇՌ-ի պրոցեսում: Զոնդերը լինում են տարբեր տեսակի և պարունակում են մեկ կամ երկու նշադիր՝ ֆլուորոֆոր և ֆլուորեսցենցիայի արգելակիչ: Որոշ դեպքերում ֆլուորոֆորը միացվում է առաջին զոնդին, իսկ արգելակիչը՝ երկրորդ: Ընդհանուր առմամբ արդեն իսկ մշակվել են զոնդերի և տարբեր ներկանյութերի օգտագործմամբ կատարվող Ռեալ թայմ ՊՇՌ-ի դետեկցիայի բազմազան եղանակներ: Ֆլուորեսցենտ ներկանյութով նշված հիբրիդացվող զոնդերի կիրառման մեթոդը թույլ է տալիս ՊՇՌ-ի ընթացքում կատարել հետա233

զոտվող նմուշի որակական և քանակական դետեկցիա: Արդյունքների գրանցումը կատարվում է հատուկ սարքերի միջոցով (նկ. 3.46):

Նկ. 3.46. 1 - Ռեալ ժամանակում ՊՇՌ-ի կատարման ամպլիֆիկատոր (m.stroy-union.ru, pobedpix.com): 2 - Ռեալ ժամանակում ՊՇՌ-ի կատարման ամպլիֆիկատոր АНК-32-М (pobedpix.com):

Ռեալ ժամանակում ԴՆԹ հատվածների ՊՇՌռեակցիային բնորոշ են մի շարք դրական առանձնահատկություններ. 1. Ամպլիֆիկացիան և դետեկցիան կատարվում են զուգահեռ` նույն ժամանակում, նույն փորձանոթում: 2. Առկա է ներքին կոմպլեմենտար զոնդ: 3. Հնարավոր է որոշել ֆլուորեսցենցիայի ինտենսիվությյունը: 4. Հնարավոր է որոշել ԴՆԹ նմուշի նախնական քանակը: 5. Հնարավոր է բացահայտել փոփոխված մոլեկուլները և որոշել դրանց խտությունը: 6. Հնարավոր է միասնական, նույն փորձանոթում կատարել տարբեր նմուշների զուգահեռ դետեկցիա: Տարբեր զոնդերում ֆլուորեսցենտ ներկանյութերի քանակը և կազմը տարբեր են, ընտրվում են փորձի նպատակների և կատարման այլ պարագաների համապատասխան: Դետեկցիայի կատարման յուրահատկության աստիճանը տարբեր դեպքերում տարբեր է և կատարում է որոշիչ դեր հետազոտության մեթոդի և կիրառվող զոնդերի ընտրության հարցում (աղ. 3.3): Անդրադառնանք դրանցից մի քանիսին:

Աղյուսակ 3.3 ՊՇՌ-ի նյութի դետեկցիայի եղանակները ՌԹ ՊՇՌ-ի պրոցեսում Ցածր սպեցիֆիկ Մեկական Ինտերկալացնող պրայմերների ներկանյութեր՝ օգտագործմամբ ԻՆ համակարգեր EtBr Amplifluor SYBR Green I LUX SYBR Gold Plexor LCGreen DzyNA SYTO 9 Cyclicon YO-PRO AEGIS BEBO Three-STAR

UFA (УФА)

FRET primers

Բարձր սպեցիֆիկ Հիբրիդացնող ԻՆ և ՀԶ-ի զոնդերի համատեղ օգտագործմամբ օգտագործմամբ համակարգեր՝ ՀԶ համակարգեր TaqMan ResonSense TaqMan/MGB Angler Molecular Beacon iFRET Scorpion Duplex Scorpion HyBeacon HybProbes Light-up probe MagiProbe PriProET

Ֆլուորեսցենտ նշադրված զոնդերի օգտագործմամբ կատարվում են բազմազան գենետիկական, բժշկական, անասնաբուժական և այլ հետազոտություններ. 1. Բացահայտվում են SNP-ները: 2. Բացահայտվում են հարուցիչների ՆԹ-ները: 3. Կատարվում է մուլտիպլեքսային ՊՇՌ: 4. Որոշվում է վիրուսների խտությունը նմուշում: 5. Կատարվում է գեների էքսպրեսիայի վերլուծություն: 6. Բացահայտվում է ալելային կազմը՝ գենոտիպը: 7. Նախապատրաստվում են մաքուր նմուշներ հետագա սեկվենացիայի համար:

3.8.3.5. Հիբրիդացում ամպլիֆիկացիայի պրոցեսում (Fluorescent Amplification based Specific Hybridization, FLASH) ֆլուորեսցենտ ներկանյութերի կիրառմամբ կամ ՊՇՌ վերջնակետի որոշման եղանակով (Real-Time End-point PCR) ՊՇՌ վերջնակետի որոշման եղանակով մեթոդը օգտագործվող սարքավորումների հասանելիության շնորհիվ լայնորեն կիրառվում է բազմաթիվ լաբորատորիաներում: Այսպես ՊՇՌ-ն կատարվում է սովորական ամպլիֆիկատորների օգտագործմամբ, իսկ ֆլուորեսցենցիան գրանցվում է հասարակ սպեկտրոմետրով: Ֆլուորեսցենցիայի մակարդակը որոշվում է ՊՇՌ-ի ավարտից հետո նույն փորձանոթում: Ուստի մեթոդը բավականին հեշտ կատարվող է և նյութապես հասանելի: Մեթոդի առավելություններից են դետեկցիայի արագ ընթացքը՝ ընդամենը 2-3 ժամ տևողությունը և հնարավորությունը կատարել դետեկցիան նույն փորձանոթում շրջանցելով կոնտամինացիայի վտանգը: Նշենք, որ նույն ժամանակում կատարվում է Real-Time ՊՇՌ-ն SYBR Green I օգտագործմամբ: «ՊՇՌ վերջնակետի որոշման եղանակով» մեթոդով ճշգրիտ արդյունքներ ստանալու համար օգտագործվում են ֆլուորեսցենցիայի շատ թույլ ֆոնային ազդակ ունեցող մոլեկուլային փարոս տիպի զոնդերը: Real-Time End-point PCR կատարման համար օգտագործվող սարքավորումները կոմպակտ են, էլեկտրականության պահանջը՝ համեստ և դետեկցիան կատարվում է առանց էլեկտրաֆորեզի փուլի, որի շնորհիվ մեթոդը ճշգրիտ է և հարմար փոքր մոբիլ լաբորատորիաներում օգտագործելու համար:

3.8.3.6. Real-Time PCR Taq Man արձանագրության եղանակով Real-Time PCR այս մեթոդը հիմնվում է Taq պոլիմերազ ֆերմենտի 5՛-3՛ ուղղված էնդոնուկլեազային ակտիվության վրա: ՊՇՌ-ի համար պատրաստված ռեակցիոն խառնուրդ ավելացվում են 18-ից 40 նուկլեոտիդներից կազմված ԴՆԹ-ի զոնդեր, որոնց 5՛ ծայրին միացված է ֆլուորեսցենտ նշադիրը՝ ֆլուորոֆորը, իսկ 3՛ ծայրին՝ ֆլուորեսցենցիայի արգելակիչը և զոնդի ծայրը փակող ֆոսֆատային խումբը: Ֆոսֆատային խումբը սահմանափակում է ծայրային նուկլեոտիդը և արգելակում զոնդի մասնակցությունը ռեդուպլիկացիային: Զոնդերը կարճ են. ֆլուորոֆորը ու արգելակիչը մոտ են մեկը մյուսին, ուստի արգելակիչը կլանում է ֆլուորոֆորի լույսը: Զոնդերը կոմպլեմենտար են նմուշ ԴՆԹ-ի միջին հատվածի հերթականությանը և կապվում են միայն դրան երկու պրայմերների միջև գտնվող հատվածում՝ ապահովելով ԴՆԹ շղթայի նպատակային նշադրումը և դետեկցիայի ճշգրտության բարձր աստիճանը: ՊՇՌ-ի ընթացքում վառոցքի փուլում միաշղթա ԴՆԹ-ին միանում են և պրայմերները, և զոնդերը: Ինչքան ավելի շատ են սինթեզին մասնակցող մատրիցաները, այնքան ավելի մեծ քանակությամբ զոնդեր են կապվում դրանց: Ամպլիֆիկացիայի էլոնգացիա փուլում ԴՆԹ պոլիմերազը հասնում է զոնդի 5՛ ծայրին և առկա էնդոնուկլեազային ակտիվության շնորհիվ քայքայում այն: Առաջին հերթին անջատվում է ֆլուորոֆորը, որը, հեռանալով արգելակչից, սկսում է ինտենսիվ լույս արձակել: Բոլոր կրկնապատկվող մատրիցաներից անջատվող զոնդերի ֆլուորոֆորների արձակված լուսային ազդակը ըմբռնում է համապատասխան սարքը: Ամեն հերթական ցիկլի վերջում ԴՆԹ-ի քանակը կրկնապատկվում է և հաջորդ ցիկլին մասնակցող միաշղթա մատրիցաների քանակը և կապված զոնդերի թիվը նույնպես կրկնապատկվում են: Զոնդերի ազդակների գումարային ինտենսիվությունը պայմանավորված է տվյալ պահին խառնուրդում առկա միաշղթա ԴՆԹ-ների քանակով (նկ. 3.47):

R

IT)ոtt,Litր,t,գացոնl

-~1ոո11ո~ո11

a - ա(1QՇլակ1ll

ո;ti'.::ր== t ltl=l1=ա ::յll=t:i=11===~Q-· __զ_ո_ս_ո_ զl _•_,_կ_ _ _

•

5 ' - - - - - - - - - -~---_-_-_-_-_-_-_-_-_--;;:, Հակաuակ ltl(1այնt:i(1

5•------~ L___զ,3'

ն2ոu11ti աU2աU1ոLն

* * --

3'- - - - - - - - - ' - - - - - - - - - - 5'

sկ- - - - - - - - - -'----_-_-_-_-_-_-_-_-_--;;:, Uզ11ակi, ա11oակո 5' l' 6'

•

"lո11lllti(11lզաgtiա11l աLjա(1U1 5' 3'

, ,

9),.

'

,\

5'

3' 5'

յ ,. 5' :I' 5'

6'

Նկ. 3.47. Taq Man պրոտոկոլի եղանակով կատարվող ՊՇՌ-ի պրոցեսի որակական և քանակական դետեկցիաի սխեման (https://www.researchgate.net /publication/266247148_Investigating_candidate_genes):

Առաջին գրանցվող լուսային արձագանքը տալիս են այն նմուշները, որոնցում փորձի սկզբում ներմուծված ԴՆԹ շղթաների խտությունը ամենաբարձրն է, քանի որ դրանց խտությունը խառնուրդում ավելի արագ է ավելանում և հասնում սահմանային խտության Ct մակարդակին: Նշենք, որ բոլոր փուլերում անջատված ֆլուորոֆորները, կուտակվելով լուծույթում, շարունակ լույս են արձակում, և դրա ինտենսիվությունը աճում է ցիկլից ցիկլ՝ ԴՆԹ-ի շղթաների խտությանը զուգահեռ: Ֆլուորոֆորների ազդակները գրանցվում են թերմոցիկլերի հատուկ սպեկտրոմետրային սարքով և գրանցվում: Ստացված արդյունքները մշակվում են համակարգչային ծրագրերի կիրառմամբ:

Միակ լրացուցիչ պայմանը, որը կարևոր է պահպանել զոնդի ձևավորման փուլում, ֆլուորոֆորի հարևանությամբ ԴՆԹ-ի շղթայում գուանինային մնացորդի բացակայությունն է: Պարզվել է, որ գուանինը արգելակում է ֆլուորոֆորի ակտիվությունը և դրանով իսկ շեղում դետեկցիայի արդյունքները: Այսպիսով՝ Real-Time PCR Taq Man արձանագրության եղանակով կատարման հիմքում ընկած են մի շարք օրինաչափություններ և հատկանիշներ՝ ֆլուորեսցենցիայի արգելակումը որոշակի պայմաններում, զոնդերի կոմպլեմենտար միացման հանգամանքը և ԴՆԹպոլիմերազ ֆերմենտի 5՛-3՛ ուղղված էնդոնուկլեազային ակտիվությունը: 3.8.3.7. Դետեկցիա Tag Man MGB տիպի զոնդերի միջոցով Tag Man զոնդերի յուրահատկության բարձրացման և դրանց օլիգոնուկլեոտիդային հատվածիը կարճացնելու նպատակով Tag Man MGB զոնդերը (Minor Groove Binders - MGB) կատարելագործվեցին: Դրանց կազմ 3՛ ծայրին ներդրվեցին ԴՆԹ-ի փոքր ակոսիկի հետ կոնյուգացվող կարճ լիգանդներ (Kutyavin, Afonina, Mills, Gorn, et al.): Լիգանդի ինտերկալյացիան ԴՆԹ-ի շղթայի և զոնդի միջև զգալիորեն ամրացնում է այդ կապը և թույլ է տալիս կարճացնել զոնդը: Լիգանդի առկայության շնորհիվ արգելակվում է նաև զոնդի երկարացումը պոլիմերիզացման պրոցեսում: ԴՆԹ-ի թիրախ հատվածի հետ Tag Man MGB զոնդերի միացման մոդուսի սխեման ներկայացվում է նկար 3.48-ում: Մոդիֆիկացված Tag Man MGB զոնդերին բնորոշ է հալեցման (T (m)) ավելի բարձր ջերմաստիճան, քան նույն չափսի Tag Man զոնդերին, և սպեցիֆիկանության ավելի բարձր աստիճան: Այսպես՝ Tag ManMGB զոնդերի կիրառմամբ բացահայտվում են միանուկլեոտիդային փոխարինումները, որոնք գրեթե անորսալի են Tag Man զոնդերի միջոցով: Ավելին, Tag Man MGB զոնդերով արձակված ազդակի ինտենսիվությունը զգալիորեն գերազանցում է Tag Man զոնդերինը:

1հզաC,րiC,եո

Նկ. 3.48. Tag Man MGB տիպի զոնդերի կազմության և մատրիցայի հետ կոմպլեմենտար կապի սխեման (https://www.elitechgroup.com /benelux/product/elitechgroup-real-time-pcr-proprietary-technologies/):

Թվարկված առանձնահատկությունների շնորհիվ Tag Man MGB զոնդերը կազմված են 12-15 նուկլեոտիդներից և, լինելով գրեթե երկու անգամ կարճ Tag Man զոնդերից, ապահովում են կետային մուտացիաների բացահայտման բարձրագույն հնարավորություն: Միանուկլեոտիդային փոխարինումների՝ SNP-ների բացահայտման համար սովորաբար ստեղծվում են զույգ Tag Man MGB զոնդեր, որոնցից մեկը պոլիմորֆ լոկուսում պարունակում է նորմալ նուկլեոտիդ, իսկ երկրորդը՝ փոփոխված: Տարբեր նուկլեոտիդներ պարունակող զոնդերը նշադրվում են տարեր ֆլուորեսցենտ ներկանյութերով, օրինակ՝ նորմալը VIC-ով, իսկ փոփոխվածը՝ FAM-ով: Եթե թիրախ հատվածում առկա է նորմալ կամ «վայրի» նուկլեոտիդը, հատվածի հետ կապվում է դրան կոմպլեմենտար առաջին զոնդը, իսկ եթե երկրորդ՝ փոփոխված նուկլեոտիդը, ապա կապվում է երկրորդ զոնդը, և կրկնապատկման պրոցեսում պոլիմերազը, հասնելով զոնդին, անջատում է կամ առաջինի ներկանյութը (արձակվում է 555 նմ երկարությամբ ալիք), կամ երկրորդի (արձակվում է 510 նմ երկարությամբ ալիք): Համապատասխանաբար արձակվող ազդակը լինում է կամ նարնջագույն՝ VIC-ի դեպքում, կամ վառ կանաչ՝ FAM-ի դեպքում (նկ. 3.49): Tag Man MGB մեթոդը լայնորեն կիրառվում է ինչպես գիտական հետազոտություններում, այնպես էլ բժշկագիտությունում՝ իմունիտետի և իմունային համակարգի, հարուցիչների շտամերի, ուռուցքային հիվանդությունների գենետիկական նշադիրների բացահայտման բնագավառներում:

~

~

Մ

ԼԲ6ԲND

Շ

A

~

r-a .

~

MiոօrՇrօօv. Biոd.r

~-Հll"l~ilերազ ..,._,. ,.,,.. ՃորllTaa6օkl

ONAPօlyrոօra•

')

:Ը.,ոu~

~

Teորlate

Uաtոր~gա ~

Բxttf"li»dՔriոer

"lրա1ilեր

Նկ. 3.49. Tag Man MGB զոնդերի փոխազդեցությունը միանուկլեոտիդային փոխարինումներ պարունակող մատրիցաների հետ (file:///C:/Users/09032020/ Desktop/Investigating_candidate_genes_identified_by_genome.pdf):

3.8.3.8. Կոմպլեմենտար ծայրային հատվածներ պարունակող զոնդերի կիրառման մեթոդը՝ Molecular Beacons Մոլեկուլային բիկոններ (Molecular Beacons) տիպի զոնդերը կազմված են 25 նուկլեոտիդային մնացորդներից: Զոնդի ծայրերում գտնվող հինգական նուկլեոտիդները կոմպլեմենտար են իրար և միանալով առաջացնում են ծամկալանման մարմին: Ծայրերից մեկին ամրացվում է ֆլուորոֆորը, իսկ երկրորդին՝ ֆլուորեսցենցիայի արգելակիչ: Միջին՝ 15 նուկլեոտիդներից կազմված հատվածը կոմպլեմենտար է կրկնապատկման համար նախատեսված ԴՆԹ-ի շղթայի միջին մասում գտնվող նուկլեոտիդային հերթականությանը: Սովորական պայմաններում զոնդի կոմպլեմենտար ծայրերի նուկլեոտիդները կապված են ջրածնային կապերով, և ֆլուորոֆորն ու արգելակիչը գտնվում են նեղ հարևանության մեջ: Անմիջական հարևանությամբ գտնվող արգելակիչը ամբողջովին կլանում է ֆլուորոֆորի ազդակը ապահովում ֆոնային ֆլուորեսցենցիայի նվազագույն դրսևորում: Զոնդի ներքին հատվածի կոմպլեմենտարությունը հետազոտվող ԴՆԹ-ին

շատ կարևոր է և ապահովում է զոնդի բարձրագույն յուրահատկությունը որոշակի ԴՆԹ հատվածի նկատմամբ: Մեթոդի թերություններից է հատուկ զոնդեր ձևավորելու անհրաժեշտությունը և ՊՇՌ-ի կատարման պարագաների օպտիմիզացման անհրաժեշտությունը: ՊՇՌ-ի պրոցեսում՝ բնափոխման փուլում միջավայրի ջերմաստիճանի բարձրացման արդյունքում զոնդի ծայրերը հեռանում են, և վառոցքի փուլում զոնդը կոմպլեմենտար միանում է նմուշ ԴՆԹ-ների համապատասխան նուկլեոտիդային հերթականությանը: Ֆլուորոֆորը հեռանում է արգելակիչից և սկսում լույս արձակել: Այսպիսով՝ ամպլիկոնների հետ կապված զոնդերը լույս են արձակում, իսկ չկապված զոնդերի ծայրերը մնում են միացած՝ զոնդը չեզոք է (նկ. 3.50):

tlllltlllll ~

'luրa 2րuaա

~

Նկ. 3.50. Մոլեկուլային բիկոնի երկու տարածական կոնֆիգուրացիաների սխեման (Su-Xia Han, Xi Jia, Jin-lu Ma, Qing Zhu, 2009):

Ավելի ուշ բիկոն տիպի զոնդերը ձևափոխվեցին՝ դրանց կազմ ներմուծելով երկրորդ ֆլուորոֆոր: Երկու ֆլուորոֆորների ալիքների կլանման և արձակման սպեկտրները ընտրվում են այնպես, որ առաջինի արձակման սպեկտրը համապատասխանի երկրորդի կլանման սպեկտրին, որի շնորհիվ դրանց փոխազդեցությունը առաջացնում է FRET-էֆեկտ (նկ. 3.51): Ազատ վիճակում 1-ին ֆլուորոֆորի ազդակը կլանվում է հարևանությամբ գտնվող արգելակչով և ֆլուորեսցենցիա չի առաջանում: Երբ զոնդը կապվում է ԴՆԹ-ի կոմպլեմենտար հատվածին, 1-ին ֆլուորոֆորը հեռանում է արգելակչից և արձակում ազդակ, որը կլանվում է 2րդ ֆլուորոֆորով՝ կատարվում է էներգիայի փոխանցում և 2-րդ ֆլուորոֆորը արձակում է իրեն բնորոշ ազդակ:

2-f1'1 :Plոորո:Pոր

I 1-tiU :PLոորո:Pոր

.)e::: /

uրզt.Lաl1~!

FԲԲT e:!,

Նկ. 3.51. Ձևափոխված մոլեկուլային բիկոն զոնդերի ակտիվացման սխեման (Su-Xia Han, Xi Jia ,Jin-lu Ma, Qing Zhu, 2009. փոփոխված)

3.8.3.9. Կարիճ տիպի զոնդեր Կարիճ տիպի զոնդերի կազմության և ազդեցության մոդուսը մշակել է 2000 թ. Թելվելը աշխատակիցների հետ միասին: Կարիճ տիպի զոնդը, ինչպես և մոլեկուլային փարոսը, կազմված է ծամկալի ձևով՝ պարունակում է կոմպլեմենտար ծայրային հատվածներ, և ներքին՝ թիրախ ԴՆԹ-ի շղթայի միջին հատվածին կոմպլեմենտար հերթականություն: Ծամկալի 5՛ ծայրին ամրացված է ֆլուորոֆորը, 3՛ ծայրին արգելակիչը: Զոնդը միացվում է պրայմերի 5՛ ծայրին: Պրայմերի և զոնդի միջև գտնվում է զոնդի կրկնապատկումը արգելակող ՊՇՌ ռեակցիայի բլոկատորը՝ էթիլենգլիկոլային սպեյսեր: Կարիճ տիպի զոնդի ազդեցության մեխանիզմը ներկայացվում է նկար 3.52ում: Ինչպես ներկայացված է նկար 3.52-ում, ՊՇՌ-ի սկզբում՝ բնափոխման 1-ին փուլում, ռեակցիոն լուծույթում առկա բոլոր երկշղթա հատվածները բնափոխվում են, դառնում միաշղթա: Անջատվում են նաև զոնդի ծայրային նուկլեոտիդների ջրածնային կապերը (2): Հաջորդ՝ վառոցքի 3-րդ փուլում, զոնդի պրայմերային հատվածը միանում է միաշղթա թիրախ ԴՆԹ-ին, և 4-րդ՝ էլոնգացիայի փուլում կատարվում է նոր շղթայի սինթեզ: ՊՇՌ-ի 1-ին ցիկլը ավարտվում է: 2-րդ ցիկլի սկզբում (5) բնափոխման փուլում նորից կատարվում է բնափոխում, և շղթաները կապող ջրածնային կապերը անջատվում են: Հաջորդ (6) փուլում զոնդի՝ ազատ արձակված 5՛ ծայրը միանում է

ջրածնային կապերով թիրախ ԴՆԹ-ի ներքին կոմպլեմենտար հատվածին և ֆլուորոֆորի ու արգելակչի միջև առաջացած հեռավորության շնորհիվ լույս արձակում: Արձակված ֆլուորեսցենտ ազդակը ընկալվում է հատուկ սարքերով և գրանցվում:

·L 3,

~

iii ill ' lliiijjii

e 1e ,1ոոոո.1ոոո- "::..-" ltfl UյPայUեր O Uրզելա~Ծ! -

Պltրl-հ uո,~1-հերրա~աuորյոu -=- uullltհ~ոu ~ր,ո~աuոո

=

utlո2 'luԹ

Նկ. 3.52. Կարիճ տիպի զոնդի կազմության և ազդեցության սխեման (Солинас и др., 2001, https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11600715/):

Զոնդի և պրայմերի միացման կետում գտնվող բլոկատորը արգելակում է զոնդի կրկնապատկումը: Այն դեպքում, երբ կրկնապատկվող ԴՆԹ-ի հատվածում բացակայում է զոնդին կոմպլեմենտար հերթականություն և բլոկատորի շնորհիվ զոնդը չի ընթերցվում ու մնում է ծամկալի վիճակում, լույս չի արձակվում:

Ներկայացվող մեթոդի հիմնական առավելությունն այն է, որ պրայմերը և զոնդը կազմում են միասնական մարմին, և երկու առանձին գործոնի օգտագործում չի պահանջվում: Ավելի ուշ ձևավորվեցին կարիճ զոնդի կատարելագործված՝ Duplex Scorpion տիպի տարբերակներ (նկ. 3.53): Llոllllj[tlltնոարi հաUllոաO

/

1. :Բtոորiո:Բորi 1 2. :Բtոորiո:Բորi 2 3. ա[lQt[ակրl!

''

Բնաl'7որնոi_Q աUjա

lրlրiայllt~

' '

Ulllկttil.յոն

կաոilցթ ~

,'

'lնրժ UաUl[lրiցա ՒRET ~ՃM¢ROX

Նկ. 3.53. Duplex Scorpion տիպի զոնդի կազմության և ակտիվության սխեման: Մեր օրինակում 1-ին ֆլուորոֆորը FAM է, երկրորդը՝ ROX (Солинас и др., 2001, https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11600715/):

Duplex Scorpion զոնդի կազմում միավորված են կարճ ԴՆԹ շղթայով բաժանված երկու ֆլուորոֆորներ, որոնցից առաջինի ազդակի սպեկտրը համապատասխանում է երկրորդի կլանման սպեկտրին: Այն պահին, երբ զոնդը կոմպլեմենտար կապվում է ամպլիկոնի համապատասխան հատվածին, տեղի է ունենում 1-ին ֆլուորոֆոր-արգելակիչ զույգի բաժանում և ֆլուորեսցենտ ազդակի արձակում: Արձակված ազդակի էներգիան կլանում է 2-րդ ֆլուորոֆորը և FRET-էֆեկտի շնորհիվ արձակում ազդակ: Արձակվող ազդակը գրանցվում է, և յուրաքանչյուր նոր սինթեզված ամպլիկոն հաշվառվում է: Ինչպես և սովորական կարիճ զոնդի դեպքում, դետեկցիան Duplex Scorpion-ի միջոցով կատարվում է ամպլիկոնի սինթեզի ավարտից հետո՝ նոր ցիկլի սկզբում:

3.8.3.10. Էներգիայի ռեզոնանսային փոխանցման եղանակով աշխատող Light Cycler զոնդեր Էներգիայի ռեզոնանսային FRET եղանակով փոխանցումը երկու հիբրիդացվող զոնդերի միջև կատարվում է Light Cycler մեթոդով: Դետեկցիայի այս եղանակը ավելի ճշգրիտ է, քանի որ այս դեպքում կրկնապատկվող հատվածը կոմպլեմենտար կապվում է երկու հիբրիդացվող զոնդերի հետ, և պատահական կապի առաջացումը գործնականում բացառվում է: Առաջին զոնդի 3՛ ծայրում գտնվում է առաջին ֆլուորոֆորը՝ դոնորը, իսկ երկրորդ զոնդի 5՛ ծայրում երկրորդը՝ ակցեպտորը: Ակցեպտոր զոնդի 3՛ ծայրի կրկնապատկումից խուսափելու նպատակով կապվում է ֆոսֆատային խմբով՝ P: Երկու զոնդերը վառոցքի փուլում կապվում են թիրախ ԴՆԹ-ի նպատակային շղթային միջին հատվածում մոտ հարևանությամբ՝ 1-ից 5 նուկլեոտիդի հեռավորության վրա: Այս դիրքում լազերային ճառագայթման ազդեցությամբ դոնոր ֆլուորոֆորը արձակում է ազդակ, որը կլանում է ակցեպտորը: Կլանված էներգիայի շնորհիվ ակցեպտորի ազդակը ստացվում է ավելի ինտենսիվ և հեշտ է գրանցվում համապատասխան սարքերով (նկ. 3.54):

Qոն111

5' ա~ցեLկl1lոր1 ~1ոո11ո~ո11 FՃ _ ,.,..-

1'. ...,/"'0 Qոնյ'l 2

Նկ. 3.54. Էներգիայի ռեզոնանսային փոխանցում FRET-եղանակով երկու հիբրիդիզացիոն զոնդերի միջև (http://molbiol.ru/protocol/12_07_02.html):

Կրկնապատկվող յուրաքանչյուր շղթայից ստացված ազդակները գրանցվում և հաշվառվում են: Այսպիսով՝ ԴՆԹ-ի պատճենների քանակը որոշվում է ՊՇՌ-ի յուրաքանչյուր ցիկլում: Ցիկլից ցիկլ ֆլուորեսցենտ ազդակների քանակը և ինտենսիվությունը աճում են մոտ երկու անգամ:

Ռեալ ժամանակում դետեկցիայի այս եղանակը կիրառվում է ինչպես գիտական հետազոտություններում, այնպես էլ բժշկագիտական լաբորտորիաներում՝ ախտորոշիչ աշխատանքներում (հարուցիչների ախտորոշում, մուտացիաների բացահայտում, դեղանյութերի թեստավորում, բուժման պրոցեսի գնահատում): 3.8.3.11. ՊՇՌ-ի օգտագործմամբ փոքր կորիզային փկՌՆԹ-ների՝ miRNA-ների կրկնապատկման և դետեկցիայի մեթոդ Ներկայումս մարդու գենոմում բացահայտվել են 3000-ից ավելի miՌՆԹ-ներ կոդավորող գեներ: miRNA-ների ընտանիքի անդամների ընդհանուր քանակը բջջում կարող է հասնել մինչև 50 000: Տարբեր տեսակների գենոմի նուկլեոտիդային հերթականությունները շատ տարբեր են, բայց մեծ մասի 5՛ ծայրում գտնվում է ուրիդին նուկլեոտիդը: Հայտնի է, որ mi-ՌՆԹ-ները շատ կոնսերվատիվ են և չեն ենթարկվում պատահական մուտացիաների: miRNA-ների չափսերը տատանվում են 21-ից 24 նուկլեոտիդի սահմաններում: mi-ՌՆԹ-ները հետտրանսկրիպցիոն փուլում ազդող կարգավորիչ գործոններ են: Դրանց ազդեցությունը դրսևորվում է երկու եղանակներով՝ որոշակի ի-ՌՆԹ-ների տրանսլյացիան կամ ամբողջովին արգելակվում է, կամ խիստ սահմանափակվում: Ազդեցության եղանակը պայմանավորված է mi-ՌՆԹ-ի և թիրախ ի-ՌՆԹ-ի շղթաների կոմպլեմենտարության աստիճանով: Այսպիսով՝ miRNA-ների նշանակությունը բջջի գործունեության և կենսունակության հարցում դժվար է գերագնահատել, ուստի բջջում դրանց կազմի և քանակի, ինչպես նաև դրանց փոփոխականության հետազոտությունները դարձել են վերջին տասնամյակների կարևոր գիտական և կիրառական խնդիր: miRNA-ների փոքր չափսերը՝ ընդամենը 22-24 նուկլեոտիդ, դժվարացնում են դրանց կրկնապատկումը և դետեկցիան ՌԹ ՊՇՌ-ի եղանակով, քանի որ սովորական պրայմերները և զոնդերը մեծ են և դրանց օգտագործումը այս դեպքում բացառվում է:

miRNA-ների կրկնապատկման և դետեկցիայի համար առաջարկվել է օգտագործել հատուկ, երկու հատվածներից կամված, ցողուն-հանգույց տիպի Stem-loop պրայմերներ (նկ. 3.55): Stem-loop պրայմերների օգտագործումը նպաստում է փկՌՆԹ-ների կրկնապատկմանը: փկՌՆԹ-ների ամպլիկոնների դետեկցիայի համար օգտագործվում են Tag Man մեթոդի յուրահատուկ զոնդեր, որոնք ապահովում են լիարժեք դետեկցիա: Տteո-looր

~ լlայUելl

----lկHյԹ-'1 արiա2'1(յ 211.րaայti uր(յրal::iզ

t

111111

j"j'j'j'j'j'j'"')

lկHյԹ

~ Հl>ո'1ոtulլա6 llոitոա(յtո llոtl::iկոLլ ոt:.ալ լՀlայll 'l)Gո ~ \ ոtրi.tvi ~f1այUեր

\ ոtրi.tvi. ~լlայUեր

111111111iրi

111111111iրi 1111 11 1

~ Uut111l:t>llll

~

~ ~

Հաljաllաlj

Հաljա llաlj ~f1այUեf1

ո,ut,llt.րiuաi

~րաiut:.11

TaզMaո գոն11

TaզMaո գոն11

Նկ. 3.55. ՄիկրոՌՆԹ-ների կրկնապատկման և դետեկցիայի կատարումը RT տիպի պրայմերների միջոցով (В.Ю. Овчинников, 2017):

Stem-loop պրայմերները կազմված են հանգույցից և երկշղթա պոչից, որի շղթաներից մեկին միացված է թիրախ միկրո-ՌՆԹ-ի 5՛ ծայրի մի քանի նուկլեոտիդներին կոմպլեմենտար հատված: ՊՇՌ-ի առաջին փուլում ռեակցիոն լուծույթում գտնվում են ԴՆԹ-նուկլեոտիդները, Stem-loop պրայմերները, ռեվերտազ ֆերմենտը, որը ՌՆԹ-ի վրա սինթեզում է կոմպլեմենտար կԴՆԹ: Վառոցքի փուլում միկրո ՌՆԹ-ի շղթան կոմպլեմենտար միանում է պրայմերի ԴՆԹ նուկլեոտիդներին և առաջացնում երկշղթա հատված: Էլոնգացիայի փուլում պրայմերը երկարում է փկՌՆԹ-ի կազմին կոմպլեմենտար նուկլեոտիդներով:

Առաջին ցիկլի վերջում ռեակցիոն լուծույթում առաջանում են փկՌՆԹ-ին կոմպլեմենտար կԴՆԹ շղթաներ: Երկրորդ ցիկլից առաջ լուծույթ են ավելացվում հատուկ ուղիղ ու հետադարձ պրայմերներ և Tag Man զոնդեր: Ամեն մի թիրախ փկՌՆԹ-ի դեպքում պրայմերները և զոնդերը սինթեզվում են հատուկ հետազոտվող միկրոՌՆԹ-ի նուկլեոտիդային կազմին համապատասխան: Tag Man զոնդերի տեսակը պայմանավորված է հետազոտություն խնդիրներով: Եթե հետազոտության խնդիրն է բացահայտել որևէ փկՌՆԹ-ի առկայությունը, Tag Man զոնդը պետք է լինի կոմպլեմենտար թիրախ մոլեկուլի միջին հատվածի մի քանի նուկլեոտիդներին: Այս դեպքում, Tag Man մեթոդի համաձայն, էլոնգացիայի փուլում ԴՆԹ պոլիմերազ ֆերմենտը կանջատի ֆլուորոֆորը, և դա կարձակի գրանցվող ազդակ՝ միջավայրում առկա է փկՌՆԹ: Իսկ այն դեպքում, երբ անհրաժեշտ է բացահայտել որոշակի փկՌՆԹ-ի առկայությունը, զոնդը պետք է պարունակի և պրայմերի, և փկՌՆԹ-ի նուկլեոտիդները՝ համապատասխան դրանց միացման հատվածին, և սինթեզվի ամեն մի թիրախ փկՌՆԹ-ի համար հատուկ: Ունիվերսալ զոնդերի կիրառությունը ավելի հարմար է տնտեսական տեսակետից և ապահովում է փորձի ճշգրտության ու լիարժեք կատարման բարձր մակարդակ: 3.8.3.12. Real Time ՊՇՌ-դետեկցիա կատալիտիկ ԴՆԹ-ի օգտագործման եղանակով Այս մեթոդի հիմքում ընկած է մոլեկուլային բիկոնների կազմ ԴՆԹ էնզիմների՝ ԴՆԹ zyme ներմուծման մեթոդը: Զոնդի կազմ ներմուծվում է ԴՆԹ zyme-ը կոդավորող հերթականության կոմպլեմենտար շղթան, որը ՊՇՌ-ի ժամանակ կրկնապատկվելով առաջացնում է ակտիվ ֆերմենտային ԴՆԹ: Ռեակցիայում օգտագործվող երկրորդ Tag Man տիպի զոնդը ունի ծայրային ֆլուորոֆոր և արգելակիչ: Զոնդի միջին հատված ներդրվում է ռիբոնուկլեոտիդ: Այս զոնդը կոմպլեմենտար է ԴՆԹ zyme-ը կոդավորող հատվածին և կարող է կապվել դրան: Երկրորդ զոնդը անվանում են սուբստրատ

և ենթարկվում է քայքայման, որի արդյունքում ֆլուորոֆորը անջատվում է արգելակչից և արձակում ազդակ, որի շնորհիվ ֆլուորեսցենցիայի մակարդակը աճում է: Դետեկցիայի այս մեթոդը ունիվերսալ է՝ բոլոր տիպի շղթաների համար օգտագործվում է նույն զույգը՝ ԴՆԹ zyme և սուբստրատ զոնդերը: Այսպիսով, երբ միջավայրում առկա է նպատակային՝ թիրախ շղթան, բնափոխման փուլում մոլեկուլային բիկոնի կոմպլեմենտար հատվածները հեռանում են միմյանցից և վառոցքի փուլում կապվում թիրախին: Կատարվում է կրկնապատկում, և սինթեզվում է ակտիվ ԴՆԹ zyme: Վառոցքի փուլում սուբստրատ զոնդը միանում է դրան կոմպլեմենտար ԴՆԹ zyme հարևանությամբ գտնվող հատվածին: Սինթեզված էնզիմը կտրում է սուբստրատ զոնդը ռիբոնուկլեոտիիդի կետում, ֆլուորոֆորը հեռանում է արգելակչից և արձակում ազդակ: Ազդակները բարձրացնում են ֆլուորեսցենցիայի մակարդակը և գրանցվում: Պետք է նշել, որ դետեկցիան կարող է կատարվել նաև առանց ՊՇՌ-ի փուլի միայն նպատակային՝ թիրախ շղթայի ավելացման միջոցով: Այսպես՝ եթե միջավայր է ներմուծվում թիրախ շղթան, բիկոնի պոչային հատվածները հեռանում են և միջին հատվածը կոմպլեմենտար միանում թիրախին: ԴՆԹ zyme բացվում է և կապվում երկրորդ զոնդին, որի արդյունքում ֆերմենտը քայքայում է երկրորդ զոնդը ռիբոնուկլեոտիդի սայտում: Երկրորդ զոնդի ծայրերում գտնվող ֆլուորոֆորը հեռանում է արգելակչից և արձակում ազդակ: Երկրորդ զոնդի մնացորդները անջատվում են բիկոնից, բիկոնի ծայրերը կապվում են կոմպլեմենտար և պատրաստ են ճանաչել հաջորդ նպատակային մոլեկուլը (նկ. 3.56):

uորuո աո zyme

llաոա1~ո~ ot,րոլո,կ1 Ըոt,րi

Հtiրրtiրiաgո~ ULկաԸոակա1~u 2~~ա1ti հtԸո

ljոu qոuri

UIյ.1աlllաljայtiu 21"\Fյա Uրզt1ակt,1

/

~ :եյոոյlliugt.uո ազրiաltti~ QյlաUgոu~

t

/ ~t.~

tոյlոզt.u uաuutit-1ti !)այl)այոLU

:ե1ոորո'.րոր

UIյ.1~ա

Նկ. 3.56. ԴՆԹ zyme զոնդի ազդեցության սխեման (В.Ю. Овчинников, 2017):

3.8.3.13. Real Time ՊՇՌ-ի կատարման կարգը TaqMan զոնդերի օգտագործմամբ 1. Նախապատրաստել ՊՇՌ-ի կատարման համար անհրաժեշտ բոլոր որոշակի պարամետրերին համապատասխանող ռեագենտները: Ռեակցիայի ճշգրիտ կատարման համար շատ մեծ նշանակություն ունի զոնդերի և պրայմերների ճգրիտ ընտրությունը: Taq Man զոնդերը պետք է՝ - պարունակեն 20-80 % GC նուկլեոտիդներ, -

-

ունենան 68-70 ºC հալման ջերմաստիճան, նույն նուկլեոտիդի կրկնողությունների թիվը չի կարող գերազանցել 4-ը, առանձնապես վտանգավոր են G նուկլեոտիդի կրկնողությունները, զոնդի համար գերադասելի է ընտրել այն շղթան, որում շատ են C նուկլեոտիդները, զոնդի 5՛ ծայրում G գուանինի առկայությունը բացառվում է, որպես ֆլուորոֆոր գերադասելի է ընտրել FAM-ը կամ VIC-ը,

-

որպես ֆլուորեսցենցիայի արգելակիչ գերադասելի է ընտրել TAMRA-ն կամ BHQ1 (Blackhole): ՊՇՌ պրայմերները պետք է՝

-

լինեն մոտ 50 ն, ունենան 58-60 ºC հալման ջերմաստիճան, պարունակեն 20-80 % GC նուկլեոտիդներ, ունենան նվազագույն երկրորդային կազմություն, չառաջացնեն երկմերներ, պրայմերի ծայրերում չունենան 3-ից ավելի G/C նուկլեոտիդներ: Հավելված.

ա) զոնդի հալման ջերմաստիճանը պետք է լինի 10 ºC-ով բարձր, քան պրայմերինը, բ) եթե օգտագործվում է երկու զոնդ, առավել արդյունավետ է FAM/BHQ1 + VIC/BHQ1 զույգերի կազմը:

2. Ստերիլ փորձանոթներում խառնել բոլոր անհրաժեշտ նյութերը՝ աղյուսակ 3.4-ում ներկայացվող քանակություններով: Աղյուսակ 3.4 Taq man զոնդերի օգտագործմամբ կատարվող Real Time ՊՇՌ-ի ռեակցիոն խառնուրդի կազմը tնոորթյոնյo tոծոյրթոն.l նյոգթր1 րանյաlj[l 50i.llj[. 1ոծոoթոi.l Ix IOxՊlո րո:jրt:.11 5 i.llն. I 01.llvրԸյՃTԲ, ժGTԲ, ժUTԲ, Ը!ՇTԲ 0.2 i.lM ոոաoանյsոոհ I i.ll11 . Պlրlայi.lGրl I ն5 i.llj M) 0.1 i.lljM I i.lljt Պl[lայi.lG[l 2 ն5 i.lljM) 0.1 i.llj M I i.llj[. 0.25 i.llj[. 1 i.llj[. T թգոթո գո նյ11t:.11 Lill!ար1ո [յր1գացl[ ած 2ո րl 50 i.ll..11. Taզ- ն)l,ԹUjոtր1i.lt:.11ագ 1.25 i.lր1աL[ո11 0.5 i.ll..11. 25 i.lM MgCI, 3.5 1.lM 7 i.ll..11. Պlա1i.lանյաL[ո11L[ած t 0.1- 1 նljգ. ն)l,Թ i.lաո11ր1ցա նյi.lո2'1 jնոո րթյոնյոL[ ն յոգթ

ա. Աշխատանքի ճշգրիտ և անսխալ կատարման համար խորհուրդ է տրվում օգտագործել փորձարկված և հաճախ օգտագործվող պիպետները և դրանց ծայրերը:

բ. Աշխատանքի համար ընտրել նմուշ առնվազն 2 մլ ծավալով, ռեակցիոն լուծույթի ծավալը ստանալ 30 մլ ոչ պակաս: գ. Աշխատանքը կատարել ավտոմատացված շարժումներով, սովորական ռեժիմում՝ պահպանելով ազդեցության նույն ուժը և շարժումների մոդուսն ու ընթացքը: 3. Խառնել վորտեքսի վրա, տեղադրել ամպլիֆիկատորի մեջ և միացնել ծրագիրը.

-

Փուլ

Ժամանակ

Ջերմաստիճան

10 րոպ

94 ºC

15 վրկ

94 ºC

1 րոպ

60 ºC

Դետեկցիա

Կրկնել 2-ից 4-րդ փուլը 39-45 անգամ

Պահել

10 ºC

Հավելված. 1. Ամպլիֆիկացիայի ռեալ թայմ տարբերակի համար օգտագործվում են հատուկ՝ Pfu, Pwo և այլ տիպի պոլիմերազ ֆերմենտներ, որոնց ակտիվությունը դրսևորվում է 60-72 ºС պայմաններում: 2. Որոշ ֆիրմաներ ավելացնում են բուֆերի կազմ ուրացիլ-N-գլիկոզիլազ և dTTP փոխարեն օգտագործում են dUTP, որը պահպանում է ՊՇՌ-ի ռեակցիան աղտոտումից: ՈՒրացիլ- N-գլիկոզիլազան ակտիվացվում է 2 րոպե 50 ºC պայմաններում կատարվող ինկուբացիայի միջոցով:

3.8.4. Քանակական դետեկցիա Real Time ՊՇՌ-ի եղանակով Ինչպես արդեն ասվել է, ՊՇՌ ռեալ ժամանակում (ՌԺՊՇՌ) մեթոդը թույլ է տալիս որոշել նմուշներում ԴՆԹ-ի քանակը՝ օգտագործելով ֆլուորեսցենցիայի ինտենսիվության մակարդակի որոշման եղանակը: Գնահատման հիմքում ընկած է ֆլուորեսցենցիայի գրանցվող CT մակարդակին հասնելու համար անհրաժեշտ ցիկլերի քանակի որոշումը: Դետեկցիայի կատարումը նախատեսում է ֆլուորեսցենցիայի երկու մակարդակների որոշում:

Առաջին մակարդակը՝ բազային (baseline level), դրսևորվում է ռեակցիայի բոլոր սկզբնական փուլերում որպես զոնդերի ինքնաբերաբար քայքայման արդյունք: Այս մակարդակը կարող է փոփոխվել օտար ազդեցությունների ներքո ռեակցիայի սկզբնական ցիկլերում և հասնել որոշակի հավասարակշռության: Որպես բազային կարող է որոշվել ֆլուորեսցենցիայի միջին մակարդակը սկզբնական ցիկլերում (average over cycle range) կամ ամենացածր գրանցված մակարդակը (minimum over all data): Վնասված զոնդերի ֆլուորեսցենցիան սկզբնական 3-ից 7 ցիկլերի ընթացքում սովորաբար վերանում է, և այսուհետև բազային ֆլուորեսցենցիան հասնում է նվազագույն մակարդակի, որը և կարող է համարվել բազային: Հայտնի են գնահատման և այլ մոտեցումներ: Ֆլուորեսցենցիայի բազային մակարդակի սխալ ընտրությունը կարող է առաջացնել կինետիկական կորի դեֆորմացիաներ և հետագա գնահատման պրոցեսի շեղումներ: Երկրորդ մակարդակը՝ սահմանային՝ CT (threshold) որոշվում է C(T) = - (1/log E) * log P0 + log PC(T)/log E բանաձևով և թույլ է տալիս համեմատել տարբեր փորձերի արդյունքները միայն այն դեպքում, երբ PC(T)= const-ը, այսինքն՝ երբ փորձնական նմուշի և կինետիկական կորի կառուցման համար ընտրվող նմուշի նույն խտությամբ լուծույթների PC(T) ցուցանիշները նույնն են: Նշենք, որ ռեպորտային ֆլուորեսցենցիայի մակարդակը լիովին համապատասխանում է բանաձևում ներկայացվող օրինաչափությանը միայն կինետիկական կորի էքսպոնենցիալ փուլի սկզբում: Ավելի ուշ առաջանում և ուժեղանում են կողմնակի՝ ստոխաստիկ ազդեցություններ որոնք փոխում են կորի ձևը: Այդ պատճառով CT-ն ընտրվում է էքսպոնենցիալ փուլի սկզբնական ցիկլերի թվից: Սովորաբար ֆլուորեսցենցիայի սահմանային մակարդակը հավասար է 0,05-ից 0,1 միավոր մակարդակին: Այն դեպքում, երբ բոլոր նմուշների հետազոտումը կատարվում է նույն պայմաններում, նույն նյութերի և սարքերի օգտագործմամբ CT-ի ընտրության այս եղանակը ամենահուսալին է:

3.8.4.1. Ռեակցիայի որակի գնահատում ՊՇՌ ռեակցիայի գնահատումը կատարվում է մի շարք պարագաներով. ա) ՊՇՌ-ի կինետիկական կորի ձևով, բ) ամպլիֆիկացիայի արդյունավետության մակարդակով, գ) քանակական գնահատականի հավաստելիության մակարդակով: SYBR Green ներկանյութի օգտագործման դեպքում կինետիկական կորի շեղումների պատճառ կարող է լինել, օրինակ, պրայմերների դուպլեքսների առաջացումը, որը փոխում է ռեակցիայի դինամիկան, կամ բազային մակարդակի սխալ ընտրությունը: Շտկելով նման շեղումները՝ կարող ենք հասնել ռեակցիայի գնահատման եղանակի բարելավման: Taq Man զոնդերի օգտագործման դեպքում նույն պատկերը առաջացնում են աղտոտող նյութերը: Կինետիկական կորի շեղումներ է առաջացնում նաև սուբստրատի գերփոքր խտությունը լուծույթում, կամ հակառակը՝ պրայմերների և զոնդերի անբավարար քանակը, որի արդյունքում ռեակցիայի բնականոն ընթացքը շեղվում է: Նշանակություն կարող է ունենալ նաև ռեակցիայի արդյունավետության ցածր մակարդակը: Կինետիկական կորի վերլուծությունը Եթե նմուշի ՊՇՌ-ի տվյալներով կառուցված կորը ունի մեկից ավելի գագաթներ, հնարավոր է, որ նմուշի կազմում առկա են մեկից ավելի տեսակի ԴՆԹ-հատվածներ: Այս խնդիրը կարող է լուծվել կամ պրայմերների փոփոխման միջոցով, կամ թորամասերի բաժանման՝ հալեցման եղանակով: Քանակական գնահատման հավաստելիության որոշում Ըստ արդեն ներկայացված բանաձևի՝ C(T) = - (1/log E) * log P0 + log PC(T)/log E , (3) կարող է կառուցվել կալիբրային գրաֆիկ, որի առանցքների վրա նշվում են С(T) և logP0 կոորդինատները: Գրաֆիկ գծի թեքությամբ որոշվում է ռեակցիայի արդյունավետությունը՝ E-ն: Որպես logP0

հաշվարկներում կարող է ընդունվել և լուծույթների հարաբերական խտությունը: Օրինակ՝ ամենացածր խտությամբ լուծույթի ցուցանիշը կարող է հավասարեցվել 1-ի: Սովորաբար հաշվարկները կատարում է հատուկ՝ real-time PCR համակարգչային ծրագիրը: Քանակական գնահատման հավաստելիության աստիճանը անթերի ռեակցիայի արդյունք է R2 >0,99 դեպքում: Սակայն այն դեպքերում, երբ սկզբնական նմուշում ամպլիֆիկացնող նմուշի խտությունը շատ ցածր է, այսպիսի արդյունք չի ստացվում և 0,975-0,98 միջակայքում գտնվող արդյունքը կարող է ընդունվել որպես բավարար: Այս պայմաններում արդյունքների ստուգման համար ընդունված է կրկնել փորձը 2-3 անգամ: Ռեակցիայի արդյունավետության որոշումը Ռեակցիայի արդյունավետության մակարդակը որոշվում է բանաձև (3)-ի ձևափոխված տարբերակով. E = 10-1/k, որտեղ k-ն վերցվում է C(T) = kxlog P0 + b բանաձևից ստացված արդյունքների հաշվարկով: Էֆեկտիվության առավելագույն ցուցանիշի՝ E=2-ի դեպքում k ~ -3,32: Եթե k < -3,32 փոքր է այս սահմանից, էֆեկտիվությունը փոքր է 2-ից (k մեծ կամ հավասար -4 — -4,2): Ճշգրիտ կազմակերպված և կատարված ռեակցիայի k-ն պետք է լինի ~1.7, 1,8 սահմաններում: Հիշենք, որ k-ի -3,32 < k < -2,8 տատանումների լայնույթը լիովին բացատրելի է և կարող է պայմանավորված լինել փորձի հաշվարկային համակարգի շեղումներով: Հավելված. Ռեակցիայի էֆեկտիվությունը կարող է հաշվարկվել առանց կալիբրային կորի կառուցման կինետիկական կորի վերլուծության եղանակով (Tichopad et al., NAR, 2003): Ռեակցիայի արդյունքների հավաստելիությունը բարձրանում է էֆեկտիվության մակարդակի բարձրացմանը զուգահեռ (Tichopad et al., Biotechnol. Lett, 2002):

3.8.4.2. Ստացված արդյունքների մշակում Հետազոտություններում կատարված հաշվարկները ցույց են տալիս, որ CT-ին հասնելու համար անհրաժեշտ ցիկլերի թիվը հակառակ համամասնական է հետազոտվող նմուշում ԴՆԹ-ի քանակի լոգարիթմին: Այսպիսով՝ ցիկլերի անհրաժեշտ քանակի ցուցանիշը կարող է օգտագործվել նմուշում ԴՆԹ-ի քանակի հաշվարկման համար: Հաշվարկի համար անհրաժեշտ է նախապես կառուցել կինետիկական կոր և որոշել ֆլուորեսցենցիայի մակարդակի այն սահմանը՝ CT, որից հետո ազդակը, անջատվելով ֆոնային մակարդակից, տեսանելի է դառնում ու գրանցվում: Ապա որոշվում է ամեն մի նմուշի համար CT՝ սահմանային ցիկլերի թիվը: Սովորաբար

տարբեր

խտությամբ

նմուշների

տվյալներով

կառուցվում է կալիբրային գրաֆիկ, որը բացահայտում է սահմանային կամ CT ցիկլերի համարի և նմուշում ԴՆԹ-ի խտության լոգարիթմի փոխկապվածությունը (տես բաժին 3.8.1): Եթե հայտնի խտության նմուշների և հետազոտվող նմուշի խտությունները չեն համընկնում, հաշվարկը կարող է կատարվել կալիբրային կորից բխող հարևան խտությունների ցուցանիշների տարբերությամբ՝ CT – ΔCT, կամ կալիբրային կորի թեքությամբ X առանցքի նկատմամբ: Այժմ արդեն մշակված են բազմաթիվ համակարգչային ծրագրեր, որոնք գեներացնում են նմուշի բացարձակ քանակի ստանդարտ կորեր նախնական կինետիկական կորերի տվյալներով: Ծրագրերը կատարում են նաև ΔCT հաշվարկը և գնահատում ռեակցիայի էֆեկտիվությունը: Ռեալ թայմ ՊՇՌ-ի արդյունքները մշակվում են 2 եղանակով՝ կալիբրային գրաֆիկների և տվյալների ուղակի համեմատման մեթոդներով:

Կալիբրային գրաֆիկի մեթոդ Դետեկցիայի արդյունքների մշակման այս եղանակը հիմնվում է կալիբրային գրաֆիկների կառուցման վրա: Գրաֆիկի X և Y առանցքները համապատասխանում են log P0-ին և C(T)-ին, որտեղ՝ log P0-ն նմուշում ԴՆԹ-ի խտության լոգարիթմն է, C(T)-ն՝ ֆլուորեսցենտ ազդակի բացահայտման սահմանային ցիկլի համարը: Ստացված արդյունքների ճշգրտության աստիճանը պայմանավորված է նպատակային հետազոտության համար կատարվող ՊՇՌների պայմանների նույնությամբ: Ինչքան ավելի մոտ են պայմանները, այնքան ավելի մեծ հավանականությամբ ստացված արդյունքները կհամապատասխանեն իրական ցուցանիշներին: Ճշգրիտ արդյունքների ստացման հավանականության բարձրացման համար պետք է պահպանվեն հետևյալ պայմանները. 1. Բոլոր օգտագործվող նմուշներում խառնուրդների քանակը պետք է լինի նույնը: 2. ԴՆԹ-ի մասը ռեակցիոն լուծույթում պետք է լինի նույնը: 3. Կինետիկական կորի կառուցման համար ԴՆԹ-ի լուծույթների խտությունները պետք է փոփոխվեն լայն սահմաններում և ապահովեն ստացված ցուցանիշների բավարար քանակ: ԴՆԹ-ի տարբեր կազմ ունեցող նմուշների համար սովորաբար կառուցում են անհատական՝ ամեն նմուշին համապատասխանող կինետիկական կորեր: Այն դեպքում, երբ անհրաժեշտ է որոշել հետազոտվող նմուշում ԴՆԹ-ի հարաբերական խտությունը, կալիբրային գրաֆիկը կարող է կառուցվել

հետազոտվող

նմուշներից

մեկի

տարբեր

խտության

լուծույթների տվյալներով: Սակայն միշտ չէ, որ ստացված կորը կարող է օգտագործվել բոլոր նմուշների համար: Դրա պատճառներն են՝ նմուշներում հետազոտվող նյութի շատ ցածր խտությունները և ստացված արդյունքների բազմաթիվ անճշտություններ առաջացնող նմուշներում առկա աղտոտող նյութերի քանակի և որակի տարբերություն258

ները: Նշանակություն ունի նաև այն հանգամանքը, որ տարբեր խտության լուծույթներում նույնիսկ աղտոտող նյութերի նոսր քանակի ազդեցությունը ռեակցիայի էֆեկտիվության վրա տարբեր է: Այս դժվարությունների հաղթահարման համար խորհուրդ է տրվում կատարել հետազոտությունը մեծ ծավալի վրա, կամ սկսել փորձերը լուծույթների նոսրացման բարձր մակարդակից: Նույն պայմանները պետք է կիրառվեն և ստանդարտ, և փորձնական նմուշների դեպքում: Այն դեպքում, երբ անհրաժեշտ է որոշել հետազոտվող հերթականության բացարձակ քանակը նմուշում, խնդիրը բարդանում է, և կալիբրային կորի կառուցման համար կարող են օգտագործվել՝ 1) RT-PCR-ի մաքրված նյութը, 2) Ռեկոմբինանատ ԴՆԹ, 3) Ռեկոմբինանտ ՌՆԹ, որը ենթարկվում է հետադարձ տրանսկրիպցիայի, 4) Հետազոտվող հերթականությունը պարունակող արհեստական օլիգոնուկլեոտիդ: RT-PCR-ի մաքրված նյութի օգտագործման դեպքում սովորաբար ռեակցիոն խառնուրդ են ավելացվում տարբեր ՌՆԹ-ներ՝ բակտերիաների ԴՆԹ-ի տրանսկրիպտներ, փՌՆԹ-ներ, polyA- ՌՆԹ-ներ և այլն: Իվերջո, անկախ նրանից, թե ինչքան են փորձնական պայմանները համապատասխանում ստանդարտի որոշման պայմաններին, բացարձակ քանակը որոշվում է հաշվարկային եղանակով: Այս դեպքում՝ R=E

Eref– С(T)ref :

(4)

– С(T)/

Քանակական դետեկցիա տվյալների ուղիղ համեմատման եղանակով Բանաձև 3-ից ստացվում է, որ եթե երկու 1-ին և 2-րդ ռեակցիաների էֆեկտիվության աստիճանները հավասար են, ուստի սուբստրատի հարաբերական խտությունը հաշվարկվում է՝ R = P1/P2 = E

– (C(T

)1–C(T)2) = E

-△С(T)

բանաձևով:

(3)

Կատարենք ամպլիֆիկացիայի արդյունքների նորմալիզացում ստուգիչ REF հերթականության հետ (որը համապատասխանում է housekeeping gene-ին): Ենթադրենք, որ երկու ռեակցիաների էֆեկտիվությունը հավասար է Eref: Եթե ստուգիչ և հետազոտվող ռեակցիաների էֆեկտիվության մակարդակները մոտ են, բանաձևը կընդունի հետևյալ տեսքը. R=E

-△С(T)

/E

-△С(T)

ref = E

△С(T)ref-△С(T)

:

(5)

Իսկ եթե ռեակցիաների էֆեկտիվությունը մոտ է 2-ի, բանաձևն ընդունում է հետևյալ տեսքը. R= E

△С(T)ref - △С(T)

~ 2 △С(T)ref - △С(T) = 2-△△С(T) :

(6)

Հավելված. 1. Սովորաբար հաշվարկները կատարվում են հասանելի REST ծրագրով՝ 4-րդ բանաձևով: 2. Պետք է հիշել, որ հաշվարկները կարող են կատարվել 6-րդ բանաձևով միայն այն դեպքում, երբ առկա է պահանջվող հավասարությունը:

,_

l6Iնն

,a,:1()1) 3 10000

j .օօօ

Iց- =

1 2000

__..................._...._....~~.....-._.._....._......................

0 2 -4 6 8 տ0 12 14 l6տ8Xւ2:2242£28))323,1 l6 38«l4244

8/1~1~ հաilարQ

Նկ. 3.57. RT-PCR-ի ցուցանիշների հաշվարկ ուղղակի համեմատման եղանակով (ΔΔСТմեթոդ): Գրաֆիկում ներկայացվում են մի շարք նմուշների կինետիկական կորեր և դրանցով հաշվարկված սահմանային ցիկլերի փոփոխականության պատկերը (А.Т. Епринцев и др., 2008):

RT-PCR-ի դետեկցիայի համար որպես REF օգտագործվում է որևէ «տան տնտեսության» գենին համապատասխանող նուկլեոտիդային հերթականություն: Բայց պետք է հաշվի առնել, որ այդ գեների էքսպրեսիայի մակարդակը տարբեր հյուսվածքներում կարող է լինել շատ տարբեր: Այդ պատճառով նորմալիզացիան պետք է կատարել մի շարք housekeeping gene-երի համար հաշվակված միջին ցուցանիշներով (նկ. 3.57): 3.9.

-

ՄՈՒԼՏԻՊԼԵՔՍԱՅԻՆ ՊՇՌ (MULTIPLEX PCR, MULTIPLEX

POLYMERASE CHAIN REACTION)

Մոլեկուլային մեթոդների բարելավման և գենային թեստավոր-

ման մեթոդի կիրառման հնարավորության ընդլայնման նպատակով մշակվեց ԴՆԹ-ի բազմաթիվ նմուշների կրկնապատկման համատեղման եղանակ: Այս եղանակը ստացավ Multiplex polymerase chain reaction կամ MULTI PRIMER PCR անվանումը: Անվանմանը համապատասխան համատեղված ռեակցիայում օգտագործվում են բոլոր

-

շղթաների կրկնապատկման համար անհրաժեշտ բազմակի պրայմերները: Մուլտիպլեքսային ՊՇՌ մեթոդով նույն փորձանոթում, օգտա-

գործելով մի քանի թիրախ հերթականությունների համար պատրաստված պրայմերները, կատարվում է այդ հերթականությունների ամպլիֆիկացիա: Այսինքն՝ այս դեպքում նույն փորձանոթում զուգահեռաբար կատարվում են տարբեր շղթաների ամպլիֆիկացիաներ (նկ. 3.58): Առաջին անգամ այս եղանակը կիրառվել է 1988 թ. դիստրոֆինի գենում դելեցիաների բացահայտման համար: Ավելի ուշ նույն եղանակը կիրառվել է նաև ստերոիդային սուլֆատազի գենի հետազոտություններում: 2008 թ. multiplex PCR օգտագործվել է միկրոսատելիտների և SNP-ների հետազոտման համար: 2020 թ. կորոնավիրուսի թեստավորման հնարավորությունների ընդլայնման նպատակով մշակվեց ՀՏ մուլտիպլեքսային ռեակցիայի տարբերակ, որտեղ նույն ռեակցիայի կազմում միավորվել են մի քանի գենային թիրախներ, և

այսուհետ և SARS-CoV-2 թեստավորումը կատարվում է այս պրոտոկոլով: Multiplex PCR-ի կիրառման շնորհիվ հաջողվում է մեկ ռեակցիայում ավելի կարճ ժամանակում ստանալ ավելի շատ ինֆորմացիա՝ ծախսելով ավելի քիչ ռեագենտներ:

uuոշ 3

uuոշ կ

ee e~ ee e +

+

eո կ զոյզ U.րրlայUերներր-i ոագործնանր

Uոան llա(lU1

I ,j,

կ22 31Ց

1Ց1

-

1կ1

Նկ. 3.58. Մուլտիպլեքսային ՊՇՌ կատարման սխեման: Չորս նմուշները և դրանց ֆլուորեսցենտ նյութով նշադրված պրայմերները միասին ներմուծվում են ռեակցիոն լուծույթի կազմ և համատեղ ենթարկվում ամպլիֆիկացիայի: Փորձում ստացված ամպլիկոնների խառնուրդը բաժանվում է թորամասերի էլեկտրաֆորեզի եղանակով և վերլուծվում (Livak K.J., Schmitten T.D.,2001):

Multiplex PCR-ի բոլոր զուգահեռ կատարվող ռեակցիաների արդյունավետ ընթացքի ապահովման համար անհրաժեշտ է ընտրել

պրայմերներ, որոնց վառոցքի ջերմաստիճանները հնարավորինս մոտ են, բայց նմուշները հեշտ տարբերակման համար պետք է լինեն տարբեր երկարությամբ: Այս պայմանը կարևոր է այն դեպքում, երբ դետեկցիայի համար ընտրվում է էլեկտրաֆորեզի եղանակը: Եթե ստացված ամպլիկոնների դետեկցիան կատարում են էլեկտրաֆորեզի եղանակով, օգտագործում են հորիզոնական և ուղղահայաց էլեկտրաֆորեզի տարբերակները: Դոնդողը կարող է լինել կամ ագարոզային, կամ պոլիակրիլամիդային: Ֆորեգրամը ներկվում է բրոմէտիդիում ներկանյութով և համեմատվում ստանդարտ նշադիրների հետ: Տարբեր երկարությամբ նմուշների բաժանման արդյունքում ֆորեգրամի վրա հստակ բացահայտվում են տարբեր բծեր: Եթե հետազոտությունում օգտագործվում են ֆլուորեսցենտ ներկանյութով նշադրված պրայմերներ, լրացուցիչ ներկման անհրաժեշտություն չի առաջանում (նկ. 3.59), և նմուշների երկարության տարբերություններն այլևս կարևոր չեն: ՊՇՌ-ի արդյունքների դետեկցիայի և գրանցման համար օգտագործվում են հատուկ համակարգչային ծրագրեր՝ Typhoon Scanner Control (Molecular Dynamics) կամ Typhoon8600 (Molecular Dynamics) և 532 նմ երկարությամբ գրգռման ալիք գեներացնող լազերային սարք:

,

Ը::յ , .

-2Շ 111 1':

·~

Շ ,_. .c.

-:r

5 ,. .c. .D

.c. ·~

.5~ 1.21

..

..

.. ..

;::,._~= ,. -.

,. +---~...L~~~..!..._~_.:::;:.... ն1)

Պ

,.

"'

..

Նկ. 3.59. Ֆլուորեսցենտ ներկանյութով նշադրված պրայմերների օգտագործմամբ մուլտիպլեքսային ՊՇՌ-ի կատարման արդյունքների գրաֆիկ պատկերը (https://ppt-online.org/151176):

Դետեկցիան կարող է կատարվել նաև կաթիլային էլեկտրաֆորեզի եղանակով: ՊՇՌ-ից ստացված նյութը 10 անգամ նոսրացվում է ջրով, ապա ավելացվում է 1 մկլ ներքին ստանդարտ՝ ET400-R (AmershamBioscienses) և 14 մկլ HiDi ֆորմամիդ (Applied Biosystems): Ստացված լուծույթը ԴՆԹ-ի բնափոխում առաջացնելու համար 3 րոպե տաքացվում է մինչև 95 ºС աստիճան: Անմիջապես բնափոխումից հետո նյութը սառեցվում է մինչև -20 ºС: Նախապատրաստված նմուշը ABI PRIZM 3100 սարքի օգնությամբ ենթարկվում է կաթիլային էլեկտրաֆորեզի: Հետազոտման արդյունքները մշակվում են «GeneMarker» (SoftGenetics LLC.) համակարգչային ծրագրով: Մշակման արդյունքները ներկայացվում են գրաֆիկների և աղյուսակների ձևով: Աղյուսակում գրանցվում են հետազոտվող հատվածների հաշվարկված չափսերը (նկ. 3.60):

Aa.0185

Nօ

Dr•

51•

Blս.

186 . 5

Blս. Blս. B1i.

194 . 1 215 . l

Gr♦t n

15-0. l

Y.l lօv

172. l

Y♦llow

U18. 5

•

U0. 6

Yillեա 192. 5

Y.llօv 294.l

.., .... lt.i.91t

կ90'1

ie• 3կ3

lat8

384? 27U

Muk•r Afսg 41 Afսg 41

Afսg 41 i\f1.»9 41 M 20 ՃօxD 165

ՃօxD 165

AօxO Hi~ Ճ.tuց 51

All•l• 29կ

Oit'f♦Nft~

Օաt.lity

5օօN

0. 3 0. 2 0. 2 0. 2 0. 1

PU$

65 . 2 3-1 . 8

P,U5

Քass Ք<t1u

45 ,0 17. 3 63 , 4 24 . ,

o.,

Ք~,s

0. 5 0. 5 0. 1

Pսa

2s.օ

PUտ

51. 3 4. 9

Pսs

Paս

Շ:Շ-.ft1

I<ՇօոfitMdւ 2

Նկ. 3.60. An-20, AoxD165, AfuG41, AfuG51 միկրոսատելիտային լոկուսների ֆորեգրամի համակարգչային մշակման արդյունքները: Աղյուսակում ներկայացվում են օգտագործվող պրայմերների գույնը, ամպլիկոնի չափսերի վերաբերյալ տվյալներ, ալելի համարը: Կարմիր գույնով նշված է ներքին ստանդարտի հատվածը՝ 165 ն (www.litceysel.ru/amd/1):

Մուլտիպլեքսային ՊՇՌ-ն լայնորեն օգտագործվում է գենային դելեցիաների և ՌՆԹ-ների բացահայտման, ԴՆԹ-ի քանակական հետազոտման բնագավառներում: Մեթոդը շատ արդյունավետ է նաև վիրուսների, բակտերիաների և սնկայինների ախտորոշման գործում: Մուլտիպլեքսային ՊՇՌ-ի մեթոդը հեռանկարային է, բայց պահանջում է օպտիմիզացման ավելի բարձր մակարդակ: Այս դեպքում անհրաժեշտ է ավելի խիստ մոտենալ ռեագենտների քանակի ընտրությանը և ռեակցիայի ռեժիմի պահպանմանը, ինչը թույլ կտա բոլոր պրայմերներին լիարժեք կապվել թիրախ հերթականություններին և կատարել զուգահեռ ամպլիֆիկացիան: Մեծ նշանակություն ունի նաև պրայմերների, ֆերմենտների և բուֆերների ընտրությունը: Մուլտիպլեքսային մեթոդի կիրառման ժամանակակից եղանակներից մեկը բիոչիպերն են: Բիոչիպը կազմված է նույն տախտակի վրա գտնվող բազմաթիվ խորշերից, որոնցից յուրաքանչյուրը առանձին ռեակցիայի կատարման կետ է: Տարբեր խորշերում միաժամանակ կատարվում են առանձին ամպլիֆիկացիաներ, բայց զուգահեռ կատարվող պրոցեսի արդյունքները ֆիքսվում և գնահատվում են առանձին՝ հատուկ սարքերի օգնությամբ: Ստացված արդյունքները մշակում և վերլուծում է համակարգիչը՝ հատուկ ծրագրերով: Նման կազմություն ունեցող բիոչիպում միաժամանակ կարող են հետազոտվել հարուցիչների մեծ խմբեր և ախտորոշվել վիրուսների, բակտերիաների, օնկոգենների բազմաթիվ տարբերակներ: Բիոչիպերը պատրաստվում են որոշակի խմբի ԴՆԹ-ների բացահայտման և համապատասխանաբար հարուցիչների կամ այլ թիրախ ԴՆԹ տարբերակների ախտորոշման համար (https://www.pinterest.ru/pin/286752701254535826/): Մուլտիպլեքսային ՊՇՌ-ի առավելություններից է նմուշի կոնտամինացիայի վտանգի նվազեցումը, կեղծ բացասական արդյունքների բացահայտումը, բարձր յուրահատկությունը, ռեագենտների ծախսի սահմանափակումը, արագությունը, ունիվերսալությունը և կատարման ընտրությունը:

Թերություններն են նմուշների տարբեր խտության պատճառով առաջացող արդյունքների շեղումները և ռեակցիայի բազմաթիրախային բնույթով պայմանավորված բուֆերների ոչ յուրահատուկ կազմը: 3.9.1. Ֆլուորեսցենցիայի մակարդակը գրանցող սարքերը և դրանց կիրառությունը մուլտիպլեքսային ՊՇՌ-ի համար Ռեալ ժամանակում ՊՇՌ-ի դետեկցիայի և ԴՆԹ-ի պատճենների քանակի որոշման համար օգտագործվում են օպտիկական հանգույց պարունակող ամպլիֆիկատորներ, որոնք կատարում են դետեկցիան ՊՇՌ-ի ընթացքում՝ փակ փորձանոթներում: Օպտիկական հանգույցը կազմված է լույսի աղբյուրից, ֆիլտրերից, ֆլուորեսցենտ ազդակը ուժեղացնող սարքից և ֆլուորեսցենցիայի մակարդակը գրանցող հանգույցից (նկ. 3.61):

Նկ. 3.61. Ֆլուորեսցենցիայի մակարդակը որոշող ֆլուորոմետրի կազմության և գործունեության սխեման. 1 - լույսի աղբյուր, 2a և 2b - 400-700 նմ ֆիլտրեր, 3 - ազդակի լույսի ուժի ինտենսիվության բարձրացման սարք, 4 - 96 նմուշներից ստացված ազդակների գրանցում, 5 - լուսային ազդակի գրանցման սարք (http://www.ramld.ru/userfiles/file/perm/popova.pdf):

Դետեկցիայի այս եղանակը թույլ է տալիս, հաշվի առնելով վերջին տարիներին սինթեզված տարբեր գունավորում ունեցող ֆլուորեսցենտ ներկանյութերի բազմազանությունը, կատարել բազմակի ՊՇՌ ամպլիֆիկացիան նույն փորձանոթում` օգտագործելով տարբեր նիշերով նշված յուրահատուկ պրայմերներ, կրկնապատկել ԴՆԹ-ի տար266

բեր շղթաներ (նկ. 3.62): Այդպիսի ՊՇՌ-ն ստացել է մուլտիպլեքսային, այսինքն՝ բազմապրայմերային անվանումը: Եթե պրայմերները կապվեն ֆլուորեսցենցիա առաջացնող նշադիրների հետ, նույն տեսակի շղթաները կարձակեն նույն գույնի լույս, և բազմախողովակային դետեկցիայի սարքի շնորհիվ միաժամանակ հնարավոր կլինի ախտորոշել մի քանի տարբեր շղթաների խտությունը և որակը:

~ Tսեսllrt

~

\\

•

FՃM 1 ր BEY

Ill

, TIլոll)

. . Շy5 Նկ. 3.62. Լույսի աղբյուրը արձակում է ալիքների ամբողջ սպեկտրը. հատուկ ֆիլտրերի միջոցով առաջացվում են միայն որոշակի երկարությամբ լուսային ազդակներ, որոնք և գրգռում են համապատասխան ներկանյութերը: Այս համակարգը ապահովում է յուրաքանչյուր ֆլուորոֆորի առանձին գրգռում և դրան համապատասխանող ազդակի արձակում (http://www.ramld.ru/userfiles/file/perm/popova.pdf):

Օգտագործվող ներկանյութերի ֆիզիկական բնութագրերը ներկայացվում են նկար 3.63-ում:

PազllաluորiոtաlյաitiԾ րiեuiեljgt,ա t. llո1uitiuuեյ?UայհԾ tlեո1ոoոզa1ոԾ

նհոlյ աԾյորfl uiեuաlj

նո(lllոul

llր6աljոtl

3ծ5

կ70

կ70

f.ՃM"' ՏՀ~6sօօո 1, 1-Մ'l((t';(աI t--Հl:16i8tlll'... N&ica յ-lxd)-188

lր30

55ծ

յOE~, \llC'". 10Հ~, TET'Պ, Yokl!lo YOIIOաIր, QIIՒ-GoiO~O

5կ5

m

-

-"11lklօ••,Mօmօlllսօ9,Bօl1.llltdl,-Ւm9350

5ծ5

TՃMRՃ. Շy3

ծ10

ROX'Պ. Cy3.5®. Reժոoոժ Re®. Ճlexթ ՒlՊ'Պ® 5ծՑ

.~

-.ii'll"' ~ - - CվՈ. Ճa"'Բlld

Նկ. 3.63. Ներկանյութերի գրգռման և արձակման ազդակի ցուցանիշները. արձակվող ազդակի գույնը նշված է ներկանյութին բնորոշ գույնով (http://www.ramld.ru/userfiles/file/perm/popova.pdf):

3.9.2. Ալելյուրահատուկ ռեալ ժամանակում ՊՇՌ՝ Allele-specific real-time PCR Նոր, real-time տեխնոլոգիաների ստեղծմանը համապատասխան մշակվեցին ալելյուրահատուկ ռեալ ժամանակում ՊՇՌ-ի մեթոդներ: Առաջին մեթոդի համաձայն՝ ռեակցիայում օգտագործվում են երեք պրայմերներ, որոնցից առաջինը կոմպլեմենտար է մուտանտ ալելին, երկրորդը՝ նորմալ, սովորական ալելին իսկ երրորդը՝ ընդհանուր է, կապվում է երկու ալելների հետ: Ընդհանրապես ալելյուրահատուկ պրայմերները տարբերվում են միայն 3՛ ծայրի 1-2 նուկլեոտիդներով: Պրայմերները նշադրվում են ֆլուորեսցենտ ներկանյութերով, և ամեն փուլում առաջացող նմուշ/պրայմեր դուպլեքսների քանակը գրանցվում է ՊՇՌ ռեակցիայի ամեն ցիկլում և բացահայտվում ֆլուորեսցենցիայի ինտենսիվության աճի միջոցով: Պրայմերները կապվում են միայն համապատասխան կոմպլեմենտար ալելներին, և այսպիսով անմիջականորեն բացահայտվում են ինչպես հետազոտվող նմուշի որակական կազմը, այնպես էլ դրա

խտությունը: Հետերոզիգոտ գենոտիպում նույն խտությամբ բացահայտվում են երկու ալելները, հոմոզիգոտ նորմալ գենոտիպի դեպքում առկա ալելը բացահայտվում է բարձր ինտենսիվությամբ, իսկ երկրորդը կարող է դրսևորվել որպես ցածր խտությամբ ազդակ, որն առաջանում է ոչ յուրահատուկ ամպլիֆիկացիայի արդյունքում և պայմանավորված է զոնդերի միջև առաջացվող դուպլեքսների առկայությամբ (նկ. 3.64):

..

i:b Պ' ..

1...

11 Iր 11 lllilllllրIղղղղղW iii1 i1 jIII Ii [I յ Umlllաlilll

~ jոii

~ 100

'f-- l,որuա1 ա1ե1

I

~

Պ' i: ...

lրրl1րitlt1րill

b

! 'Պ•

ա1ե1

a..

.. .... ..... f"...

,. ~

O l•61Wlll•~~~D~~~-~ ~ ~-~~~~-~~~

..

; .! .. ~

. .. Պ

~

uiր~ա1 ա1ե1

.. .

...օz • ••~ս1• ~a~a~~•»~~»•~զ ~ ~զ~g~

Նկ. 3.64. Հակառակ ալելների բացահայտում մուլտիպլեքսային ռեալ թայմ ժամանակում ՊՇՌ-ի մեթոդով: 1 - երկու տարբեր ալել կրող հետերոզիգոտ, 2 - նորմալ ալելով հոմոզիգոտ, երկրորդ մուտանտ ալելի ուշացած կորի ձևավորումը պայմանավորված է համապատասխան պրայմերներից առաջացող դուպլեքսների ցածր խտությամբ (https://triptonkosti.ru/25-foto/pcr-v-realnom-vremeni-shema.html):

Ալելյուրահատուկ ռեալ ժամանակում ՊՇՌ-ն կատարվում է նաև Taq Man զոնդերի օգտագործման եղանակով: Այս դեպքում ալելյուրահատուկ զոնդերի կազմում առկա են ֆլուորոֆոր և արգելակիչ: Յուրաքանչյուր ալելի համար ընտրվում է հատուկ ֆլուորոֆոր-արգելակիչ զույգ: Ֆլուորոֆորը կապվում է զոնդի 5՛ ծայրում, իսկ արգելակիչը՝ 3՛ (նկ. 3.65): Ալելյուրահատուկ զոնդը կապվում է ԴՆԹ-ի միաշղթային կոմպլեմենտար ալելի հատվածում: Ամպլիֆիկացիայի փուլում Taq Man էնդոնուկլեազային ակտիվությամբ ԴՆԹ պոլիմերազը սկսում է զույգ շղթայի կենսասինթեզը և, հասնելով զոնդի 5՛ ծայրին, անջատում է ֆլուորոֆորը: Ազատված ֆլուորոֆորը սկսում է ազդակ արձակել:

Q- ա11գt..1աLtti2

Ւ- :Բ1ոո11ո.'րո[l

Նկ. 3.65. Taq Man էնդոնուկլեազը ամպլիֆիկացիայի փուլում անջատում է ֆլուորոֆորը զոնդից և առաջացնում համապատասխան գույնի ֆլուորեսցենտ ազդակ (https://forpcr.ru/projects/design/PCR/):

Ինչքան ավելի շատ անջատված ֆլուորոֆորներ են կուտակվում փորձանոթում, այնքան ավելի ինտենսիվ է ազդակների գումարային ֆլուորեսցենցիայի ինտենսիվությունը: Եթե նմուշում առկա են նորմալ և մուտանտ ալելները, գրանցվում են երկու ֆլուորոֆորների ազդակները, եթե միայն մեկը՝ գրանցվում է մեկ որոշակի ազդակ (նկ. 3.66): ԲացահUյյlillոոն'i

t

ԲացահUյյlillոոն'i

ԲOX գ ոնաlոորոն

t

ԲացահUյlil~ոll t..li ԲOX

FՃM գոնաlոորոն t.. ՒAM ագրlաltlil:iր

\[ Z] l ~[Z]l[ E .

•

♦

Վ

•

•

•

.

•

■

•

I

.

•

■

•

•

•

■

I

■

■

■

■

■

Նկ. 3.66. Տարբեր ֆլուորոֆորների արձագանքը կատարվում է համապատասխան գունային սպեկտրում և գրանցվում որպես առանձին գույն: Ստացված արդյունքները մշակվում են և ներկայացվում գրաֆիկների ձևով (http://forpcr.ru/projects/design/PCR/):

Կրկնապատկման յուրաքանչյուր փուլից հետո կրկնապատկված պատճենների թվի աճին զուգահեռ ավելանում է անջատված ֆլուորոֆորների թվաքանակը և համապատասխանաբար լուսային ազդակի ինտենսիվությունը:

3.9.3. Լիգազպայմանավորված մուլտիպլեքսային ՊՇՌ (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification, MLPA) Այն դեպքերում, երբ անհրաժեշտություն է առաջանում ախտորոշել ԴՆԹ-ի փոքր դելեցիաները, դուպլիկացիաները, առանձին էկզոնների բացակայությունը, միա- կամ երկնուկլեոտիդային փոխարինումները, այսինքն՝ նուկլեինաթթվի կառուցվածքային փոքր փոփոխությունները, կիրառվում է Հոլանդի և աշխատակիցների կողմից առաջարկված լիգազպայմանավորված մուլտիպլեքսային ՊՇՌ մեթոդը (Holland, Abramson, Watson, Gelfand, 1991): Մեթոդի հետագա զարգացումը և բարելավումը կատարել են մի խումբ հոլանդացի գիտնականներ (Дж.П. Схоутен и др., 2002): Մեթոդը կիսաքանակական է և թույլ է տալիս բացահայտել էկզոնի ամպլիկոնների խտությունը ռեակցիայի ավարտից հետո: Մեթոդի առանձնահատկություններն են ամբողջական զոնդի ձևավորումը լիգազ ֆերմենտի օգտագործմամբ, բոլոր ամպլիֆիկացման ռեակցիաներում նույն պրայմերի օգտագործումը, միայն զոնդերի միացված հատվածների մասնակցությունը ռեակցիային, ամպլիֆիկացման պրոցեսում միայն զոնդերի կրկնապատկումը: Այս առանձնահատկությունները պայմանավորված են զոնդերի ձևավորման եղանակով և ռեակցիայի համար ընտրված ջերմաստիճանային և այլ պարագաներով: Նշենք, որ նման հետազոտությունների կատարումը այլ մեթոդներով գրեթե անհնար է: Հետազոտման համար ընտրվում են կասկած առաջացնող ԴՆԹ-ի հատվածներ, որոնք, մեծ հավանականությամբ, պայմանավորում են այս կամ այն հիվանդության զարգացում: Հետազոտության կատարման համար առողջ անձի ԴՆԹ-ից անջատում են թիրախ հատվածը և դրա կազմի կարճ՝ մի քանի տասնյակ նուկլեոտիդից կազմված հերթականությունը բաժանում երկու մասի: Առաջին մասը դառնում է պատրաստվող զոնդի X հատվածը և միացվում է ուղիղ պրայմերի հետ հիբրիդացվող շղթային: Զոնդի X հատվածի հետ հիբրիդացվող պրայմերի 5՛ ծայրում միացվում է ֆլուորոֆոր: Զոնդի երկրորդ հատվածը՝ Y միացվում է հակառակ

ուղղված պրայմերի հետ հիբրիդացվող շղթային: Զոնդի Y հատվածի կազմում պրայմերին կոմպլեմենտար շղթայից առաջ միացվում է յուրաքանչյուր հետազոտվող լոկուսի համար ընտրված հատուկ նշադիր՝ յուրահատուկ լրացնող հերթականություն, հետո արդեն բուն հակառակ պրայմերին կոմպլեմենտար նուկլեոտիդների հերթականությունը (նկ. 3.67): Զոնդի միացած երկու հատվածների ընդհանուր երկարությունը տատանվում 130-ից մինչև 480 նուկլեոտիդ: Մեկ փորձի ընթացքում նույն փորցանորում կարող են հետազոտվել մինչև 50 տարբեր լոկուսներ: Յուրաքանչյուր հետազոտվող կասկած հարուցող լոկուսի համար պատրաստվում են առողջ մարդկանց ԴՆԹ-ի համապատասխան հատվածներից կազմված յուրահատուկ զոնդեր: Բուն պրայմերների նուկլեոտիդային հերթականությունները կարող են մնալ նույնը բոլոր լոկուսների դեպքում, բայց ամեն դեպքի համար օգտագործվող զոնդը պարունակում է դրան յուրահատուկ լրացնող հերթականություն (նկ. 3.67): Հետազոտությունը կատարվում է հիվանդ անձի թիրախ կասկածելի լոկուսների օգտագործմամբ: Հետազոտությունը կատարվում է 5 փուլերով: 1-ին փուլում կատարվում է հետազոտվող շղթաների բնափոխում: 2-րդ փուլում թիրախ շղթայի հիբրիդացում զոնդի X և Y հատվածների հետ: Հիբրիդացումը կարող է տևել բավականին երկար՝ մինչև 10 ժամ: 3-րդ լիգավորման փուլում զոնդի մոտ հարևանությամբ գտնվող X և Y հատվածների կոպլեմենտար շղթայի հետ կապված ծայրերը լիգազ ֆերմենտի ազդեցությամբ կարվում, միացվում են, և ձևավորվում է լիարժեք, ամպլիֆիկացվող զոնդ: Եթե մուտացիայի կամ այլ պատճառով զոնդի նուկլեոտիդները կոմպլեմենտար չեն կապվում հետազոտվող շղթային, լիգազ ֆերմենտը չի կպցնում՝ կարում X և Y շղթաները, դրանք մնում են առանձնացված: Կրկնապատկվող զոնդ չի ձևավորվում: 4-րդ փուլում կատարվում է կարված, ամբողջացված զոնդերի ամպլիֆիկացիա: Զոնդերը այնպես են կազմված, որ ամպլիֆիկացվում են միայն դրանց շղթաները և միջավայրում կուտակվում են զոնդերի ամպլիկոնները: Առանձին մնացած X և Y շղթաները չեն կրկնապատկ272

վում և ամպլիկոններ չեն առաջացնում: Ամեն նոր կրկնապատկման փուլում նշադրված պրայմերների ամպլիֆիկացիայի արդյունքում ֆլյուորոֆորները արձակում են ազդակներ, որոնք և գրանցում են հատուկ սարքերը: Մ uilուlltriti <lt.աtlոriոil "IՇո-ti X ն.ոա1iit:.ր),..,,.

Lրացtj_որi_ 2'1.ր¼ա* _/կcո-ti Հ ~ ~այiit:iր

յաtն հt,ր~Lj_որi_ հաոtj_աo

P ոtաlոtiաiti 111riոցtu[! 1 _'ltllաոորացtiա t. հ t i ր ~ ո~ lթt,րiաtն հաոtj_աo B

2_Մtiացոil' 1tiqաqորոil

~

U2 հt,րրt,ցացtj_որi_ հաոtj_աo -......_ _ /

~Jօ

A

lթt,րաtն հաոtj_աo Շ

lթt,րաtն հաոiyio A

lot,րաtն հաոlj_աo B id~աfu հաոկru6Շ 3_li[ոորt:iնցt:iնո ն2արiրt:iրոկ X t. Y Lljրlայiit:iրնt:iրt, ՊIՇո

5 _ uilուtiց uոացt!ա<'յ աqriաllti t. t!tfllո6ոյi1յոll -::ե,:ե · /· .• · uոոqti1 .Ը. .Ը.-:: ոt:iuոti ~~ աfl'lյոԼl.lրlltրti §] l ~ - - - - - - - - - - -հաiitiiաոոul ::::l .Ը. 2'1.ր¼այt, t:.րiLiարiոր}յոtն

4_ Մillllttillոlllltրti

Ո

'llրայi'iերiնiերiti հե[lնՀ}ականiոնՀ}յոնio նiոյնi t րոlորl Lոկոննt:.րiti հաiiարi *Ui'iենi Lոljոնti Lljրlայl'iերlti Ljագi'iti l[lացկո11 Zրtր.lայti երiljարlոtնՀ}յոնio յորiահաոոlj t

Նկ. 3.67. Նմուշների լիգազպայմանավորված մուլտիպլեքսային ՊՇՌ-ի կատարման ընթացքը. Ա - պրայմերների ընտրության և զոնդերի ձևավորման փուլ: Բ - ՊՇՌ-ի կատարման փուլ: «*»-ով նշված են զոնդերի կազմի տարբեր երկարության յուրահատուկ լրացնող հատվածները: A, B և C տարբեր հետազոտվող լոկուսների թիրախ շղթաներ: Ստացված ամպլիկոնների վերլուծությունը կատրվում է կաթիլային էլեկտրոֆորեզի միջոցով: Որոշվում են առանձին ամպլիկոնների խտությունը և երկարությունը ու կառուցվում են գրաֆիիկ պատկերներ (www.mrmarker.ru):

Այսպիսով՝ ռեակցիոն խառնուրդում կուտակվում են այն ամպլիկոնները, որոնք բացահայտում են թիրախ նմուշում առկա անթերի հերթականությունները: Մուտացիա պարունակող լոկուսներից զոնդերի կրկնապատկում չի կատարվում: Ամպլիֆիկացիան կատարվում է դասական եղանակով: Ռեակցիոն խառնուրդը, բացի սովորական ռեագենտներից և եռանուկլեոտիդներից, պարունակում է հետազոտվող լոկուսների թվով յուրահա273

տուկ նախապատրաստված զոնդեր և ունիվերսալ, ֆլուորոֆորով նշադրված բոլոր զոնդերի համար նույն պրայմեր: ՊՇՌ-ն կատարվում է աղյուսակ 3.5-ում ներկայացվող սխեմայով: Աղյուսակ 3.5 ՊՇՌ-ի կատարման սխեման 1. Բնյան,ոlնոնl 9s•Ը 5 11ոlյ.lե 2s·Ը '1ա11ա11 2. Հt,րր,t,րiացոնl 9s•Ը 111ոlյ.lե 5o•Ը '1արiաո 3. Lt,գաL[որ,ոնl

Ց1il.յL

'1ա11ա11 5կ•Ը 5կ•Ը 15 11ոlյ.lե 9s•Ը Տ 11ոlյ.lե '1ա11ա11 2o·Ը Uillյ.lLliկ'11կ ացt,ա 9s•Ը 30 L[այ[ll.jյաU 5o•Ը 30 L[այ[ll.jյաU n2c 60 L[այրlկյաU n2c 20 ր,ոlյ.lե 1s·Ը '1ա11ա11

Ամպլիֆիկացիայի ավարտից հետո 5-րդ փուլում կաթիլային էլեկտրաֆորեզի եղանակով ամպլիկոնները բաժանվում են թորամասերի ըստ դրանց երկարության, և որոշվում է դրանց խտությունը: Ստացված արդյունքները համակարգչային եղանակով վերլուծվում են և ներկայացվում գրաֆիկ պատկերների ձևով (նկ. 3.68): Վերջին՝ 5-րդ փուլում, համեմատվում են փորձնական նմուշների և ստուգիչ նմուշներիի գրաֆիկները (նկ. 3.68Ա): Ներկայացվող դեպքում գրաֆիկների համեմատման միջոցով բացահայտվում են 3 լոկուսներ, որոնցում ամպլիկոնների խտությունը նվազել է մոտ երկու անգամ (նշված են սլաքով): Դա նշանակում է, որ հետազովող գենոմներում երկպլոիդ լոկուսներից երեքի խտությունը հավասար է կես դոզայի: Այսպիսով՝ հետազոտվող էկզոններից երեքը ամբողջովին կամ

մասամբ բացակայում են կամ փոփոխված են: Ապա կատարվում է վնասված լոկուսների քարտեզավորում (նկ. 3.68Բ): uորllա LIկ1ոկ1ոtut1աo '11.յfo-o ullո2 ul:iրtյ Պltո ա11111ոuրul:i11ti զրա:)>til!

u

!

I

Lոկոuut11ti րաշtuոulo I?11ոllոuոllt, t11կա11որaյաllր Նկ. 3.68. MLPA հետազոտության արդյունքների վերլուծության փուլերը: Ա - ստացված ամպլիկոնների խտության որոշումը ստուգիչ կորերի հետ համեմատման եղանակով: Հետզոտվող նմուշում սլաքով նշված 3 ամպլիկոնների խտությունը նվազել է: Բ - փոխված խտությամբ լոկուսների որոշումը քրոմոսոմի կազմում (MLPA DNA protocol version MDP-v002; last update 23-01-2012):

Ինչպես արդեն նշվել է, MLPA մեթոդը ճշգրիտ է, արդյունավետ և գերզգայուն: Ապահովում է մեծ ծավալի արդյունքների ստացում կարճ ժամկետներում՝ ընդամենը 24 ժամում, և որոշակի փոփոխությունների շնորհիվ կարող է օգտագործվել ոչ միայն սովորական գենետիկական հետազոտություններում՝ կետային մուտացիաներ, դելեցիաներ և այլ փոքրածավալ վերակառուցումներ այլ և ԴՆԹ մեթիլավորման պատկերի հետազոտման համար:

Հետազոտությունների կատարման համար սարքավորումներ, ռեագենտների հավաքածուներ և համակարգչային ծրագրեր արտադրում են բազմաթիվ կազմակերպություններ, այդ թվում և հոլանդական MRC-Holland կազմակերպությունը: 3.9.4. RT-MLPA՝ լիգազպայմանավորված մուլտիպլեքսային ՊՇՌ հետադարձ տրանսկրիպցիայի մեթոդով Հետազոտվող մեթոդի տարբերակներից մեկը օգտագործվում է գեների կազմի և էքսպրեսիայի մակարդակի հետազոտման համար, և այս դեպքում հետազոտության թիրախը մՌՆԹ-ներն են: Փորձի սկզբում իրականացվում է ՌՆԹ-ի հետադարձ տրանսկրիպցիա, ապա դասական MLPA մեթոդով հետազոտվում է ստացված ԴՆԹ հերթականությունը: RT-MLPA մեթոդի փուլերը ներկայացվում են նկար 3.69ում:

ն _

..(եlյlաflալlՇ UlflաUUկfltH.LIQPա

•

նո.11թ-ti 21յ.iթա- - - - - - - -MMNՄՄՀ կ'1նtթ-ti 21յ.iթա - - - - - - • 1ոոահաtյ1ոկ ll.յոայilt:iո ՒՃM ն2արiոti նtiացilան կt:եո Բո1ոո նilո2նt:iոti ՊlՇո- ti հա'lաո oգtյ1ագոոoա.ո1յ. TR Շյ2արiոti il[lացilան Lit:i~ 2~

ր •

րiացոlյ. _, - l1յոայilt:iո աՇյերl ...._Տաորt:iո t:iոկաոոiթ1ան __,-- ~ հt:iո1oականոiթյոՇյնt:iո liilո2հ oաlն հաl11lj_աo liilո28 ա2 հաl11lj_աo Պlոայilt:iոնt:iոti կ'1նtթ-ti կոilll.յtt:iilt:iնtյ1աո հաl11lj_աoնt:iոti tiացոil

Lնl նlժ-հ Շ հա1ո.tաo •

..

il[lացոil /

ո.

[j'lնlժ-հ D հաtյ1lj_աo

... ..

Uո1ո'1ll.յ[GI)Uայ'1U ՊlՇո աi'ill.յtհ:Բհlյացհա

..

._ ::t:

ՒAM Li2արlոlոաo ոաորեո եոllաոո1թ1ան 2րlրթաUGյl

._

TԲ Li2արlյlկաO ոայ1րեյ1 եոlյայ1ոiթյան 2րlրթաUt:i)l

Նկ. 3.69. RT-MLPA ռեակցիայի փուլերը. Ա - մՌՆԹ-ից կԴՆԹ-ի սինթեզ և զոնդերի ձևավորում, Բ - ՊՇՌ-ի կատարում (Rotman et al., 2011):

ՊՇՌ-ի ավարտից հետո ստացված ամպլիկոնները բաժանվում են թորամասերի կաթիլային էլեկտրաֆորեզի միջոցով և վերլուծվում հատուկ ծրագրերի կիրառությամբ: Կատարված հետազոտության արդյունքներով բացահայտվում է թիրախ իՌՆԹ-ը կոդավորող գենի կառուցվածքային անթերիությունը կամ շեղումը որոշակի հետազոտվող լոկուսի շրջանում և ախտորոշվում է սպիտակուցի անոմալիաների առաջացման պատճառը:

3.10. ԴՆԹ-Ի ՀԱԼԵՑՄԱՆ ԿՈՐԵՐԻ ՎԵՐԼՈՒԾՈՒԹՅԱՆ HRM

ՄԵԹՈԴ (Highresolutionmelting - ԳԵՐԲԱՐՁՐ ԶԳԱՅՈՒՆՈՒԹՅԱՄԲ

ՀԱԼԵՑՈՒՄ)

ԴՆԹ-ի հալեցման կորերի վերլուծության գերզգայուն եղանակը վերջին տարիներին, շնորհիվ ստեղծված նոր սարքավորումների և նորագույն «հագեցնող» ներկանյութերի, դարձել է հետազոտությունների կարևորագույն մեթոդ: Մեթոդի հիմքում ընկած է ԴՆԹ-ի նուկլեոտիդային հերթականությունների աննշան շեղումներով շղթաների հալեցման գործընթացի և դրա օպտիմալ ջերմաստիճանի տարբերությունների բացահայտումը: Հալեցում գերբարձր զգայունությամբ մեթոդը թույլ է տալիս բացահայտել հետազոտվող ԴՆԹ շղթաներում նուկլեոտիդային հերթականության մանրագույն՝ նույնիսկ 1-2 նուկլեոտիդների փոխարինումները, կորուստները կամ ավելացումները: Մեթոդը չի պահանջում թանկարժեք ֆլուորեսցենտ զոնդեր, չի քայքայում հետազտվող նյութը և, լինելով գերզգայուն և գերյուրահատուկ, ապահովում է ստացված արդյունքների բարձրագույն՝ մոտ 100 % ճշգրտություն: HRM մեթոդը լայնորեն կիրառվում է ԴՆԹ-ի նմուշների գենոտիպավորման և մուտացիաների բացահայտման համար: HRM մեթոդը մշակվել է 2002 թվականին Կ. Վիտվերի կողմից: Ավելի ուշ մեթոդի գերզգայունության աստիճանի բարձրացման ուղղությամբ տարվող աշխատանքներում կատարելագործվել են հալման ջերմաստիճանը գրանցող և վերլուծող սարքերը, և մշակվել ՊՇՌ-ի

պրոցեսի վրա չազդող ու կարճ շղթաների հալեցումից հետո երկար շղթաների վրա չտեղափոխվող ներկանյութերը (նկ. 3.70): HRM մեթոդի եղանակով ամպլիկոնների հալեցման փուլը և ստացված տվյալներով կորերի կառուցումը կատարվում են անմիջապես ՊՇՌ-ի ավարտից հետո նույն փորձանոթում: Ստացված կորերը վերլուծվում են համակարգչային ծրագրով, և կատարվում է շղթաների նուկլեոտիդային կազմի տարբերությունների դետեկցիա:

.• ~

Նկ. 3.70. HRM Rotor-Gene Q 5plex թերմոցիկլերը կազմված է ՊՇՌ բլոկից, գերբարձր զգայունության հալեցման 5-խողովակային սարքից, համակարգչային ծրագրից (https://www.qiagen.com/gb/products/discovery-and-translational):

HRM (High Resolution Melting) տեխնոլոգիան հիմնվում է հետերոդուպլեքսային վերլուծության մեթոդի վրա: ՊՇՌ-ի ավարտից հետո փորձանոթում գտնվող պատճենները ջերմաստիճանի դանդաղ բարձրացման միջոցով հալեցվում են: Հագեցնող ֆլուորեսցենտ ներկանյութը, լինելով ունակ կապվել միայն երկշղթա մոլեկուլների հետ և ինտենսիվ արձակել լույս, հալեցումից հետո անջատվում է ԴՆԹ-ի մոլեկուլներից, այսինքն՝ լույսի արձակումը դադարում է: Ֆլուորեսցենցիայի մակարդակի փոփոխման արդյունքները գրանցվում են ֆլուորոմետր սարքով: Հալեցումը շարունակվում է ջերմաստիճանի բարձրացմանը զուգահեռ, և երկշղթա ամպլիկոնները հերթով հալեցվում են՝ փոփոխելով ֆլուորեսցենցիայի ինտենսիվությունը: Ստացված արդյունքներով կառուցվում են գրաֆիկական կորեր:

Պրոցեսների ինտենսիվության վրա ազդում են շղթաների երկարությունը, դրանցում ԳՑ-ների խտությունը և ԴՆԹ շղթայի ընդհանուր կազմը: Եթե փորձի պարամետրները ճշգրիտ են որոշվել, ապա հետազոտության այս եղանակով հնարավոր է բացահայտել նույնիսկ մեկ նուկլեոտիդի փոխարինումով առաջացվող տարբերությունը: ԴՆԹ-ի հալեցման կորերի վերլուծության HRM մեթոդը կատարվում է երկու փուլերով. Առաջին փուլում հետազոտվող վայրի կամ նորմալ հերթականություն և փոխարինում (SNP) պարունակող հատվածները ենթարկվում են սովորական ՊՇՌ-ի և կրկնապատկման արդյունքում միջավայրում կուտակվում են ամպլիկոններ: Միջավայրում առկա է ինտերկալացնող որևէ ներկանյութ՝ LCGreen, Resolight կամ Syto-9, որի մասնիկները էլոնգացիայի ամեն հերթական փուլում ներգրավվում են նոր սինթեզվող երկշղթա ԴՆԹ-ի հատվածների կազմ և արձակում լյումինեսցենտ լույս: Հաջորդ բնափոխման փուլում ներկանյութի մասնիկները անջատվում են, և լույսի արձակումն ընդհատվում է (նկ. 3.71): Երկրորդ փուլի սկզբում՝ ՊՇՌ-ի ավարտից հետո, լուծույթի ջերմաստիճանը իջեցվում է մինչև 25-50 0C: Այս պայմաններում առանձնացված ԴՆԹ շղթաները սկսում են միավորվել՝ առաջացնելով հոմո- կամ հետերոդուպլեքսներ: Հոմոդուպլեքսները կազմված են կոմպլեմենտար նուկլեոտիդային կազմ ունեցող շղթաներից՝ միայն վայրի կամ միայն SNP-ներով: Հետերոդուպլեքսներում շղթաներից մեկը վայրի է, երկրորդը՝ SNP-ներով: Ներկանյութը ներմուծվում է շղթաների կազմ և սկսում արձակել լույս: Այս փուլից սկսած ռեակցիոն խառնուրդի ջերմաստիճանը դանդաղ բարձրացվում է, որոշակի սահմանից սկսվում է երկշղթա հատվածների բնափոխում, և գրանցվում են լուսային արձակները: HRM մեթոդի կարևոր առավելությունն այն է, որ ջերմաստիճանի բարձրացումը կատարվում է փոքր քայլերով՝ 0,1-0,3 0C, որի շնորհիվ բոլոր տիպի փոխարինումներ պարունակող շղթաների հալման ջերմաստիճանի շեղումները անմիջապես բացահայտվում են:

ՏNԲ ն.iարiոնա ~որt 'Yl.1Թ հաU1կ ած

11 1J 11 1 .ա. .••..• •.

11~•11 -. +

• •• • Tթգ-ն.iոt~lltրiագ Պl րlայUե[l 1 Պl[lայUե[l 2 lոL~tեոU1. ~ tնարiնո1111

,-

1-հն Lt,ո1 ITlՇր1 lոայրlո I., ՏNՔ lկարlոOակորi անա ոկոOOերlո կոոակոն

,, ,-rո ,,,

ՏՀBԲ Gրeeո

i

11 11 2-րlll

•,~,~,"mM,~,~,...-

l. Lt,ո1

-lil, 11 11

9.ե[lUաUUl~IՏան~ ~2եցոն U~Uil.i 25 °Ը, 11ո ն.itե,EUUե[1~ ծliակո11ոն

Նկ. 3.71. HRM (High Resolution Melting) տեխնոլոգիայի կատարման կարգը և փուլերը (Основы полимеразной цепной реакции ПЦР методическое пособие, версия 083-4.):

Բայց այդպիսի մանրամասն հետազոտությունը չի կարող գնահատվել դիտարկման եղանակով, քանի որ մուտանտ շղթաների հալեցման պայմանները աննշան են տարբերվում մեկը մյուսից, և արդյունքների գնահատումն ու դետեկցիան կատարվում են մաթեմատիկական վերլուծության եղանակով՝ համապատասխան սարքերի միջոցով (նկ. 3.72):

<աԼtiցllաՇt Լtոriti կ.tiriԼո6ոqaյոՇt

(ոeltiոց curve) Mօlt Շնրve

Melt Շնրve D,կfi

A -=Ը

ց

1.0

,.ս •• ս ...,

~

~~

Պ=րՊԸ:.

0.3

-'-' -Պ--

սs

~ _§.

~

~Շ.4

D

Ը:.

Պ'

.2_

Շ

._, L---~~տտտտiտտiiil- -.J

10.0 rs.օ 80.Ծ a:1.0 ,օ,օ !IՏ.օ 9.ե11~աuu1!1Հ!աu ("C)

ր F., ..----··..... :: :F- ~ .9

-

3 g "' Cյ. 5 es.օ

d;

:Բ.8 ,., Պ'3 Ըii: 0.15 .§..fր

լԾ-82,կ :

~

le սs

o.,

~ 0.5

:s

B

0.կ

I

0.1

7Ո

•' •'

,, ,.

Մե

0.5 fl.5.O

70,0

7$.0

\

80.0

:A➔ 76,1 :

,\

15..0

տ2Շl,0

15.j

Տերt11նյUU1~ծ1նր, րe)

Նկ. 3.72. Հալեցման կորի վերլուծության գրաֆիկական եղանակը: 1-ին կորի վրա ներկայացված են տարբեր դուպլեքսների բնափոխման տվյալները: 2-րդ գրաֆիկը բացահայտում է տարբեր դուպլեքսների քայքայման ինտենսիվության կապը ջերմաստիճանի որոշակի մակարդակի հետ (https://kpfu.ru/portal/docs/F1203376391/6..Metody.issledovaniya.NK..II.pdf):

Հալեցման կորի վերլուծությունը թույլ է տալիս բացահայտել կորի փոփոխման ձևին համապատասխանող և գենոտիպով պայմանավորված միանուկլեոտիդային փոխարինումները կամ նույն գենի տարբեր՝ մեկ նուկլեոտիդով տարբերվող ալելները (նկ. 3.73Ա): Եթե այս կորերի վրա տարբերությունները դժվար են ըմբռնվում, ապա վերլուծությունը կարելի է կատարել հալման ջերմաստիճանի գրաֆիկների բարձրակետերով (նկ. 3.73Բ): Ինչպես տեսնում ենք ներկայացված գրաֆիկներում, հետերոզիգոտ գենոտիպի դեպքում հալեցման կորը գրավում է միջին դիրք հոմոզիգոտների կորերի նկատմամբ (նկ. 3.73Գ): Հալման ջերմաստիճանի բարձրակետերի կորերով հնարավոր է ստանալ տարբեր գենոտիպերին բնորոշ կորերի առավել ճշգրիտ պատկեր:

Նկ. 3.73. ԴՆԹ-ի շղթաների հալեցման գրաֆիկները: X առանցքի վրա նշվում են ջերմաստիճանի, իսկ Y-ի վրա՝ ֆլուորեսցենցիայի ինտենսիվության ցուցանիշները: Ա - MTRR գենի մեկ նուկլեոտիդով տարբերվող շղթաների հալեցման կորեր, Բ - ԴՆԹ-ի նորմալացված հալման ջերմաստիճանի բարձրկետերի կորեր, Գ - հետերոզիտ գենոտիպով ձևավորվող կորեր: AA - հոմոզիգոտ դոմինանտ գենոտիպ, GG - հոմոզիգոտ ռեցեսիվ, AG - հետերոզիգոտ (Д.И.Никитина, 2017):

HRM-ի ճշգրիտ, արդյունավետ կատարման համար մեծ նշանակություն ունի հետազոտվող շղթայի երկարությունը: Oպտիմալ է համարվում 300 նուկլեոտիդներից կազմված շղթաների օգտագործումը: Վերլուծության արդյունքների վրա զգալի ազդեցություն ունեն նաև ՊՇՌ-ի յուրահատկության աստիճանը, սարքավորումների բարձրագույն ճշգրտությունը և օգտագործվող ներկանյութերի առանձնահատկությունները: Պարզվել է, որ հաճախ օգտագործվող SYBR Green I ներկանյութը դժվարությամբ է ճանաչում հետերոդուպլեքսները, այդ պատճառով առաջարկվում է հետազոտության ժամանակ օգտագործել հագեցնող

ներկանյութերի այլ տեսակներ՝ LCGreen, Reso light և Sy to-9: Կարևոր գործոն է նաև ՊՇՌ-ում օգտագործվող պրայմերների յուրահատկության մակարդակը և ջերմաստիճանային ռեժիմի օպտիմալացումը: HRM մեթոդը կարող է լինել մեծ ուսումնասիրության բաղկացուցիչ մաս՝ կիրառվել որպես հետազոտության որոշակի փուլ: Մեթոդի կիրառման եղանակները բազմազան են՝ արդեն հայտնի կետային մուտացիաների և դելեցիաների, նոր կետային մուտացիաների բացահայտման նպատակով, ԴՆԹ-ի մեթիլավորման մակարդակի որոշման, ժառանգական հիվանդությունների ախտորոշման, բարդ բազմաէկզոնային գեների ուսումնասիրման, տեսակների գենոտիպավորման, գենային մոդիֆիկացիաների հայտնաբերման համար: Տեսակների գենոտիպավորումը սովորաբար կատարվում է SNP (Single Nucleotide Polymorphism) հասարակ միանուկլեոտիդային պոլիմորֆիզմի ախտորոշման եղանակով: Ամփոփում. Այժմ ռեալ ժամանակում մուլտիպլեքսային ՊՇՌ-ի մեթոդը կիրառվում է նաև վարակիչ և ուռուցքային հիվանդությունների ախտորոշման համար: Ստեղծվել են մուլտիպլեքսային ախտորոշման միկրոչիպային մեթոդներ, որոնք թույլ են տալիս միաժամանակ ախտորոշել մինչև մի քանի հարյուր հերթականություններ, ստանալ հիվանդություն առաջացնող հարուցիչների գենոմի ամբողջական պատկերը (Белов Д.А., Белов Ю.В., Курочкин В.Е. Новая методика обработки флуоресцентного отклика плавления ДНК, 2018, Кондратова В.Н., Ботезату И.В., Шелепов В.П., Лихтенштейн А.В. Выявление мутаций в горячих участках генома, 2017, Курбаков К.А., Минаев М.Ю. Применение метода анализа плавления высокого разрешения (HRM) для видовой идентификации и дифференциации SAKEI L. И CURVATUS L., 2016): Մեթոդի օպտիմալացման եղանակներից մեկը МегаПлекс մոտեցումն է, որի հիմքում ընկած է պրայմերների ֆիքսման սկզբունքը: Ռեալ ժամանակում ՊՇՌ-ի միջոցով ԴՆԹ-ի քանակի որոշման համար օգտագործվում են նմուշի քանակի փոփոխությունը գրանցող մի շարք սարքեր՝ ДТ-96 (ДТпрайм) և ДТ 48 (ДТ лайт) (НПФ «ДНК-Технология, Ռուսաստան) « «iQ5» և CFX (Bio Rad, ԱՄՆ), «COBASAmplicor» (Roche, ԱՄՆ), «АВIPRISM 7400» (ABI, ԱՄՆ), «RotorGene» (Qiagen, GmbH, Գերմանիա), Smart Cycler (Cepheid, ԱՄՆ) և այլն:

Ռեալ ժամանակում կատարվող մուլտիպլեքսային ՊՇՌ-ի մեթոդի կիրառությունն ունի որոշ առավելություններ. 1. Ամպլիֆիկացիայի և դետեկցիայի փուլերի միավորում: 2. Յուրահատուկ

ԴՆԹ-ի

մոլեկուլների

քանակի

որոշում

խտության

տարբեր ցուցանիշների դեպքում: 3. Մի քանի տեսակի ԴՆԹ-ների խտության որոշում նույն փորձանոթում, նույն ռեակցիայի պրոցեսում: 4. Փոփոխված ԴՆԹ-ների բացահայտում և քանակական դետեկցիա: 5. ՊՇՌ-ի ավտոմատացում և ստանդարտացում: 6. Ստացված արդյունքների հստակ գրանցում և մշակում: Վերջերս հետազոտություններում յուրահատուկ խնդիրների լուծման համար օգտագործվում են ՊՇՌ ռեակցիայի նոր մոդիֆիկացիաներ՝ «կենսաՊՇՌ» (BIO-PCR), «իզոթերմալ հանգուցային ՊՇՌ» (Loop-mediated isothermal amplification - LAMP) և «Միկրոարրեյ վերլուծություն» (Microarray), որոնց միջոցով միանգամից, նույն փորձում թեստավորվում են պաթոգենների բազմաթիվ տեսակներ և որոշվում դրանց առկայությունը:

3.11. ԹՎԱՅԻՆ ՊՇՌ՝ DIGITAL PCR (DPCR)

1985 թվականից սկսած ՊՇՌ մեթոդը տարիների ընթացքում գործնական լայն կիրառություն ստացավ և դարձավ արդյունավետ հետազոտական տեխնոլոգիա: Ստեղծվեցին ՊՇՌ-ի նորանոր տարբերակներ, բարելավվեցին դետեկցիայի եղանակները, մշակվեցին քանակական դետեկցիայի բազմազան մեթոդներ: Այսպիսով ձևավորվեց նաև քանակական ՊՇՌ-ի մեթոդ: Բայց քանակական ՊՇՌ-ի մեթոդը որոշ օբյեկտիվ պատճառներով ունի հետագա կատարելագործման սահմանափակումներ: Դրանք պայմանավորված են օբյեկտիվ գործոններով և խոչընդոտում են հետագա զարգացումն ու բարելավումը, ճշգրտության և յուրահատկության մակարդակի բարձրացումը: Գործոնների այս շարքից են սկզբնական նմուշների խտության տարբերությունները, դրանց կրկնապատկման արագության և ինտենսիվության առանձնահատկությունները, ՊՇՌ-ի պրոցեսում գործող օժանդակ գործոնների փոխազդեցության յուրահատկությունները և

այլն (Bartlettand Stirling, 2003, Р.К. Сайки, 1985, Дж.М. Руйтер, К. Рамакерс, В. Хугаарс, 2009, Т.Д. Шмитген, К.Я. Ливак, 2008): Ուստի ավելի ճշգրիտ քանակական դետեկցիայի եղանակների ստեղծման անհրաժեշտությունը դարձավ նոր մոտեցումների առաջադրման և նոր մեթոդների մշակման նախապատճառ: Այսպես առաջարկվեց և մշակվեց թվային քանակական ՊՇՌ-ի մեթոդը՝ թՊՇՌ-ն: Վերջին տարիներին մշակված թվային ՊՇՌ-ի մեթոդը բարձր ճշգրտության արդյունքների ստացման եղանակ է, որի կիրառումը արդյունավետ է նուկլեինաթթուներին բնորոշ ցածրագույն խտությունների բացահայտման համար (Huggett, Nolan and

Bustin, 2013,

Фогельштейн, Кинзлер, 1999): Ինչպիսին է թվային մոտեցման սկզբունքը, և ինչ հիմքերի վրա է հիմնվում նոր մոտեցումը: Թվային անվանումը օգտագործվում է հակառակ երևույթներ նշելու համար, օրինակ՝ նմուշը առկա է/նմուշը բացակայում է, ռեակցիան ընթանում է/ռեակցիան բացակայում է, նշադրում կա/նշադրում չկա և այլն: Այսպիսով՝ նման իրավիճակի ստեղծման համար պետք է ձևավորվեն այո/ոչ պարագաներ: Քանի որ դետեկցիայի ճշգրտության աստիճանը

հիմնականում պայմանավորված

է

նմուշում

ԴՆԹ-ի

խտության փոփոխականության մեծ լայնույթով խնդիր է դրվում հաղթահարել այս գործոնը՝ շրջանցել այն: Այդ նպատակով փորձից առաջ հետազոտվող նմուշների խտությունը նոսրացվում է մի քանի հարյուրից մինչև մի քանի հազար պատճեն 1 մկլ-ում, ապա լուծույթները օգտագործվում են հետազոտման համար (Н. Маджумдар, Т. Вессель, Дж. Маркс, 2015): Հետազոտությունը կատարվում է բազմաքանակ խցիկներից կազմված փորձնական տախտակների վրա, և ամեն մի խցիկի մեջ ներմուծվում են նոսրացված լուծույթի առանձին կաթիլներ: Նմուշի բաժանման այս եղանակը թույլ է տալիս տեսականորեն համարել, որ ամեն խցիկում հայտնվում է հետազոտվող հերթականության միայն մեկ պատճեն: Այսօրինակ եղանակով կազմակերպ285

ված փորձի արդյունքները բացահայտվում են կամ որպես ռեակցիայի առկայություն՝ գրանցվում է 1 նիշով, կամ բացակայություն՝ 0 նիշ: Հաշվարկը կատարվում է երկնիշ համակարգով: Քանի որ նախատեսված խցիկների քանակը գերազանցում է սպասվող պատճենների քանակը մի քանի անգամ խոսքը գնում է Պուասոնի բաշխման տեսական օրինաչափության մասին, որն կարող է շեղվել իրական բաշխման պատկերից: Նշված պատճառով իրական երևույթների վերջնական հաշվարկներում ներմուծվում են այս դեպքի համար որոշված շեղումների շտկումներ (P.R. Debski, P. Garstecki, 2015, X. Dong, B. Milholland, 2016, Н. Маджумдар, Т. Вессель, Дж. Маркс, 2015): Վերջին տարիներին ավելի հաճախ հաշվարկներում կիրառվում են հակառակ բինոմիալ բաշխման օրինաչափությունների հաշվարկային մեթոդները (Дж.Э. Кройц, Т. Мансон, Т. Хьюн, Шен Фэн и др., 2011): Հայտնի է, որ ՊՇՌ ռեակցիայի պրոցեսում տեսականորեն սպասվում է 100 % կրկնապատկում, բայց իրականում կրկնապատկվող նմուշների տոկոսն ավելի ցածր է: Մեծ նշանակություն ունի այն հանգամանքը, որ ՊՇՌ-ի յուրաքանչյուր հերթական ցիկլում կրկնապատկվող շղթաների քանակը նվազում է: Այդ պատճառով ստանալ փորձանոթում դետեկցիայի համար բավարար պատճենների խտություն սովորական ՊՇՌ-ի ժամանակ հաջողվում է միայն 40 և ավելի ցիկլերի արդյունքում: Սակայն հետազոտությունները ցույց տվեցին, որ փոքր ծավալներում նոսրացված լուծույթում ամեն շղթայի կրկնապատկման հավանականությունը ավելի բարձր է, քան սովորական փորձանոթներում, որտեղ հավանականության մակարդակի բարձրացման համար պահանջվում են հատուկ պայմաններ, օրինակ՝ նպատակային պրայմերների գերմեծ քանակներ: Բանն այն է, որ սովորական պայմաններում նույն փորձանոթում գտնվում են մեծ քանակությամբ տարբեր հերթականություններ, որոնք կարող են շեղել նպատակային ամպլիֆիկացիան, ուստի մեծ ծավալնե286

րի դեպքում նմուշ/պրայմեր հանդիպման հավանականությունը ցածր է, իսկ փոքր ծավալում նախատեսվում է հետազոտվող նմուշի ցածրագույն խտություն՝ 1 մոլեկուլ և ամպլիֆիկացիայի հաճախականությունը բարձրանում է: Այսպիսով՝ ռեակցիոն ծավալի փոքրացումը և նմուշի խտության նվազումը նպաստում են ռեակցիայի արդյունավետության բարձրացմանը: Առանձին խցիկներում կատարվում է սովորական ՊՇՌ-ռեակցիան: Նշադրման համար օգտագործվում են ֆլուորեսցենտ ներկանյութեր: Ֆլուորեսցենցիայի արտառոց բարձր մակարդակը առանձին խցիկում բացահայտում է դրանում մեկից ավելի շղթաների առկայություն, որը շտկվում է հաշվարկներում: Յուրաքանչյուր ֆլուորեսցենտ արձագանք տվող խցիկ հանդիսանում է մեկ նմուշի առկայության նշան, և լույս արձակող խցիկների քանակը համապատասխանում է նախնական լուծույթում առկա նմուշների քանակին: Քանակական ՊՇՌ-ների այլ եղանակների համեմատ՝ թՊՇՌ-ի եղանակը ավելի ճշգրիտ է և, լինելով կրկնելի, ավելի հուսալի: Վերջնական արդյունքի վրա չեն ազդում առանձին խցիկում կատարվող ամպլիֆիկացիաների ընթացքի առանձնահատկությունները և ազդակ/ֆոնային աղմուկ հարաբերակցության փոփոխությունները (Ф.Р. Бельмонте, Дж.Л. Мартин, Дж.Л. Кристин Фрескура, Дж. Дамас, И. Свободова, Е. Пазуркова, А. Хоржинек и др., 2015): Այսօր արդեն հետաքրքրությունը թՊՇՌ մեթոդի նկատմամբ զգալիորեն աճել է, ընդլայնվում են դրա օգտագործման բնագավառները (А.Н. Барретт, Л.С. Читти, 2014, J. Huggett, T. Nolan and S.A. Bustin, 2013, https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22373922/): Վերջին տարիներին մշակվել և ներկայացվել են մի շարք կազմակերպություններում արտադրվող թՊՇՌ-ի կատարման համար անհրաժեշտ նյութատեխնիկական ապահովման համալիրներ (V. Marx, 2014): թՊՇՌ մեթոդով ՊՇՌ-ի կատարումը սկսվում է նմուշի նոսրացման և բազմաթիվ խցիկների միջև նոսր լուծույթի բաշխման փուլից:

Այս փուլում կարևոր է բաշխել նմուշ պարունակող լուծույթը բազմաթիվ, մեկը մյուսից հուսալիորեն առանձնացված միավորների, որի շնորհիվ ամեն խցիկում կամ կլինի նմուշ՝ «+», կամ ոչ՝ «-», և դետեկցիայի արդյունքները ստացվում են հստակ ու հուսալի: Փորձի ճշգրիտ կատարման համար կարևոր գործոններ են խցիկների քանակը և չափսերը, ռեակցիայի կատարման ջերմաստիճանը, նմուշի դիսպերգավորման արագությունը: Խցիկի մեծ չափսերի դեպքում մեկ խցիկ տեղափոխված նմուշը կարող է պարունակել մեկից ավելի պատճեն, որը կառաջացնի սխալ արդյունքներ, իսկ փոքր խցիկների դեպքում կավելանա դրանց քանակը, բայց նմուշի ԴՆԹ-ի մոլեկուլը կարող է չտեղավորվել խցիկում: Այս դեպքում նախատեսվում է ԴՆԹ-ի մոլեկուլի բաժանում մի քանի հատվածների: Խցիկների

քանակի

ավելացումը

նպաստում

է

նմուշների

մեկական պատճենների հավասար բաշխմանը և ավելի ճշգրիտ արդյունքների ստացմանը: Ռեակցիայի ջերմաստիճանի ճիշտ ընտրությունը կարգավորում է ռեակցիայի ընթացքը, ապահովում գոլորշիացման ցածր մակարդակ և, ուրեմն, օբյեկտիվ արդյունքներ: Մեծ նշանակություն ունի նաև նմուշների

արագ

դիսպերսիան,

որը

նույնպես

նպաստում

է

հետազոտության որակի բարձրացմանը և ճշգրիտ կատարմանը (https://pubmed.ncbi. nlm.nih.gov/25828047/): Այժմ արդեն մշակվել են նմուշների դիսպերգավորման մի քանի եղանակներ՝ նմուշների բաժանում կաթիլների, միկրոխցիկների կամ ծորանների օգտագործում, նմուշների բաշխում կնիքի եղանակով (նկ. 3.74): Ամեն մի մեթոդի կատարման համար ստեղծվել են հատուկ սարքեր և տեխնոլոգիաներ:

~

1: C)

~

յ.:l

3Պ .Տ::..

Ը

'

lugրlj

Ո

y

ր-------------------- ր-------------------,

~

~

1:

~

!XDՀl1 ո>Հ::Xլ

C)

= .Տ::..

~

ՇրՀil'Xt i:րՀ:[}Հ::եl

րx:')րՀ::ե::

Ը:x:::յրՀ::l

t

Ը5::յ>Հ::;յ: ~

:

~ ~

DրՀ:i:Xl II

A-

I

3' ::l

I

.Տ::..

I I

t I

I

I

ՀԾորiaաuոլՀiայtiu Iյ)Cf1

lugրljա1tiu Iյ)Cf1

:

L-------------------- L-------------------1 =

1ր1որո11tնցtնո11 ագ11ակնt11ti հաilաttiոոil 1ր1ոո11tնցtնU1 L11աU1կt11ti ր աllա\)!րյQոtil

I HLI~ (

v

A

ժա~անա~

Uնlր)յոtUQUtնlt, հա2կ.ա11L1

■

20 L11աU1կt11ti կ.t111ոoոil

Նկ. 3.74. ԹՊՇՌ-ի կատարման 4 եղանակների սխեման: Կաթիլային եղանակի դեպքում ԴՆԹ-ի նոսր լուծույթը բաժանվում է հատուկ սարքով, և կաթիլներում կատարվում է ամպլիֆիկացիա: Դետեկցիան կատարվում է PMT սարքերով: Խցիկային եղանակի դեպքում լուծույթի միկրոդոզաները բաժանվում են խցիկների միջև և կրկնապատկվում: Նույնը կարտարվում է նաև միկրոծորաններում: Կնիքային եղանակի դեպքում լուծույթի դոզաները տպվում են հատուկ մակերեսներին և ծածկվում պաշտպանիչ թաղանթով: Դրանցում կատարվում է ՊՇՌ: Վերջին 3 դեպքերում արդյունքները վերլուծվում են ПЗС տիպի սարքերով (https://pdfs.semanticscholar.pdf, Cao L., et al., 2016):

3.11.1. Դիսպերգավորման կաթիլային մեթոդ՝ թկՊՇՌ (Droplet Digital PCR, ddPCR) Այս եղանակով կատարված ռեակցիան ստացել է թվային կաթիլային ՊՇՌ անվանումը՝ թկՊՇՌ (Droplet Digital PCR՝ddPCR): Ներկայացված եղանակներից կաթիլային մեթոդը ստացել է լայն տարածում և կիրառվում է հետազոտական, բժշկաբանական ուսումնասիրություններում: Մեթոդի իրականացման համար անհրաժեշտ է բավարար քանակությամբ ԴՆԹ-ի նոսրացված լուծույթ: Կաթիլներ ձևավորող սարքերում (Droplet Generator cartridge) յուղից, 20 մկլ ՊՇՌ-ի համար անհրաժեշտ բոլոր ռեագենտներ պարունակող լուծույթից, հետազոտվող նուկլեաթթուններից և Taq Man զոնդը պարունակող ջրային լուծույթից 1 րոպեում ձևավորվում են 20 000 1 նլ ծավալով կաթիլների էմուլսիա: Էմուլսիայի կազմի յուրաքանչյուր կաթիլը ՊՇՌ-ի միկրոռեակտոր է: Սովորաբար կաթիլները բաշխվում են 96 խցիկ պարունակող պլանշետի վրա (նկ. 3.75) և տեղադրվում ամպլիֆիկատորի մեջ (նկ. 3.76), որտեղ նուկլեինաթթվի նմուշ պարունակող կաթիլներում կատարվում է ՊՇՌ ռեակցիա: Ռեակցիայի ընթացքում Taq Man զոնդերի ֆերմենտային քայքայման արդյունքում կուտակվում են ֆլուորեսցենտ ազդակ արձակող ֆլուորոֆորներ, որոնց քանակը ՊՇՌ-ի ամեն ցիկլում ավելանում է, և ազդակը ուժեղանում: Ժամանակակից սարքերում գրանցվող ազդակը առաջանում է արդեն 25-30 փուլերից հետո: Ռեակցիայի ավարտից հետո պլանշետները տեղադրվում են ընթերցող սարքի՝ ռիդերի մեջ, որով 1000 կաթիլ րոպեում արագությամբ բարակ կապիլյարով հերթով անցնում է խցիկներում գտնվող էմուլսիան: Այն կաթիլներում, որտեղ կատարվել է ամպլիֆիկացիա, բացահայտվում է ֆլուորեսցենտ ազդակ:

1.'11Շրl-ր նյliոշ[յtրiր L. յորtր նյtրil'iոն'րոl'io կարllilրlԲ2Բ l'it2 3 որi l,l'iոշ -

lfրլմ 2.

00000000 O O O O O O O 0 00000000

Ut,Lնոl.յարt,tներ,t, թL.աLյ.որ,ոն 3ոն1

uuո2 .յ~

{~

7f~ 3որi

0օ

3 Uրկ11ոl.jարժր1նյt11ր liltրiաLjlորնոl'i 9ծ tնցրl.jայրնյ Ul[ա[յշեlilր t.lրiա կ. '11Շրl-ր l.jաlilա[lոLl'i 5. 1յ1ոորitնցtնյU1 ագ11ակնյtրiր հաշt.[արil.j Uգ11աLiր

~

.~ * '1l1ա[յշtU1ր tնցրl.jնյtրi ·

~այ(յցոl'i

Նկ. 3.75.1. Միկրոկաթիլների ձևավորման և թՊՇՌ-ի կատարման սխեման. 1 - նմուշներ պարունակող լուծույթի և յուղային ծավալի միավորում, 2 - ջրի և յուղի հոսքերի հատման կետում առաջանում են յուղային շերտով բաժանվող լուծույթի միկրոկաթիլներ՝ էմուլսիա, 3 - միկրոկաթիլները տեղափոխվում են 96 խցիկներ պարունակող մի քանի պլանշետների վրա, 4 - պլանշետները տեղադրվում են ամպլիֆիկատորի մեջ և կատարվում է ՊՇՌ ռեակցիա, 5 - ռեակցիայից հետո պլանշետների վրա առկա կաթիլները անցկացվում են դետեկտորի խողովակով, որում կատարվում է բոլոր և առանձին ազդակ տվող կաթիլների քանակի հաշվարկ (Я.Ю. Киселева* и др., 2016):

3որiր հոUQ

Ռիդերը հաշվարկում է կաթիլների ընդհանուր քանակը և առանձին ազդակներ արձակող կաթիլների քանակը: Ազդակների քանակը հաշվարկվում է նմուշի 1 մկլ ծավալի հաշվով (Я.Ю. Киселева, К.Г. Птицин, С.П. Радько, В.Г. Згода, А.И. Арчаков, 2016): Այսպիսով՝ ռեակցիայի ավարտից 20 վայրկյան անց ստացվում է քանակական վերլուծության գրաֆիկ (նկ. 3.76.6): Այժմ տարբեր կազմակերպություններ արտադրում են թկՊՇՌ-ի կատարման համար անհրաժեշտ սարքավորումներ: Օրինակ՝ Bio-Rad կազմակերպությունը արտադրում է QX200 համակարգ, որը կազմված է QX200 Droplet Generator ՝ միկրոկաթիլների առաջացման և QX200 Droplet Reader ՝ ազդակների հաշվառման սարքերից: Սարքավորումները ապահովում են ռեակցիայի կատարման և վերլուծության բարձր մակարդակ (նկ. 3.76):

Նկ. 3.76. թՊՇՌ-ի համար օգտագործվող սարքերը և ռեկցիայի արդյունքների գրանցման սխեման. 1 - միկրոկաթիլներ ձևավորող սարք, 2 - ամպլիֆիկատոր, 3 - ազդակների հաշվառման սարք, 4 - կաթիլների ձևավորման փուլ, 5 - միկրոխցիկային պլանշետ, 6 - ազդակների հաշվառման արդյունքների գրաֆիկ, որի ամեն գագաթ համապատասխանում է մեկ կաթիլի ազդակի (https://www.dia-m.ru/lab/pcr-cifrovoj-kapelnyj/1864001-sistema-):

ԹՊՇՌ-ի այս եղանակի համար չի պահանջվում առանձին ստուգիչ նմուշ, քանի որ ստացված արդյունքները բացարձակ են՝ անկախ ռեակցիայի արդյունավետության մակարդակից համապատասխանում են ռեակցիային մասնակցող բոլոր նմուշների թվաքանակին: Նշենք նաև, որ ստացված գրաֆիկը, այնուամենայնիվ, ցույց է տալիս յուրաքանչյուր առանձին ՊՇՌ ռեակցիայի արդյունավետության մակարդակը: ԹՊՇՌ-ն կարող է կատարվել նաև մուլտիպլեքսային եղանակով: Մուլտիպլեքսային թՊՇՌ-ն առավել արդյունավետ է, քան սովորական քՊՇՌ-ն, քանի որ ապահովում է արդյունքների բարձր ճշգրտություն նաև այն դեպքերում, երբ հետազոտվող նմուշում թիրախ մոլեկուլների խտությունը կտրուկ տարբեր է՝ ամեն առանձին միկրոռեակցիային մասնակցում է միայն մեկ թիրախ մոլեկուլ և մրցակցության գործոնը բացակայում է: Եթե կատարվում է դուպլեքսային՝ երկու թիրախների խտության վերլուծություն, օրինակ՝ վայրի և մուտանտ ալելների հաճախականության որոշում, ապա վայրի ալելի խտությունը կարող է

օգտագործվել նմուշում գտնվող գենոմների նախնական թվաքանակի որոշման համար: Դուպլեքսային թՊՇՌ-ի համար կարող է օգտագործվել միայն մեկ ներկանյութ: Եթե առաջին թիրախի համար օգտագործվող զոնդերի քանակը լինի սահմանափակ, կատարվող ամպլիֆիկացիաների թվաքանակը նույնպես կլինի սահմանափակ, իսկ ստացված ֆլուորեսցենտ ազդակը թույլ, երկրորդ թիրախի համար կօգտագործվեն մեծ քանակությամբ զոնդեր, և ուրեմն ֆլուորեսցենտ մասնիկների քանակը կլինի մեծ, իսկ ազդակը՝ ուժեղ: Ազդակների ուժի գրանցումը թույլ կտա ճշգրիտ գնահատել թիրախների քանակը հետազոտվող նմուշում: Մուլտիպլեքսային հետազոտություններում կարող են օգտագործվել նաև տարբեր ներկանյութեր, որոնք կառաջացնեն տարբեր գույների ազդակներ (նկ. 3.77): Եթե նույն պրայմերին միացվի երկու նույն նշադիր, ապա կառաջանա նոր ազդակ: Նշադիրների խտության հարաբերության տարբեր մակարդակները գրանցվում են որպես տարբեր ազդակներ և կարող են օգտագործվել տարբեր թիրախներ նշադրելու համար: lՊ'նո11ենյնtո.lոր.lյանյ ՄոtոtնltեQt,յ 2 գո1նոկ. l'iակա[ll)ակնյեն'lj, l'iոL[lll. L. j,նյոենյնj,Lj_որ.}յաl'iր

~ ~. րati/ltll!Շ' y'-,կt,~Y

~

~

~ f

i5-

.

I lflf~յ յ 1

•

"lկյi •

ն

•ltfl ,.(,, կ

'lf-ոՀ1A",'

' .,,~1

l~-"11/

• •

.5Պ 1 նtiրկաCյ111րa i"նlllենut,ttորa,uն

N

Նկ. 3.77. Մուլտիպլեքսային թՊՇՌ-ի արդյունքների սխեման. 1 - տարբեր ներկանյութերով նշված յուրահատուկ զոնդերի կիրառման դեպք, 2 - նույն ներկանյութի տարբեր խտությունների օգտագործման դեպք, 3 - ստացվող ֆլուորեսցենտ արձագանքի պատկերները տարբեր ներկանյութերի և նույն ներկանյութի օգտագործման դեպքում (https://jugendhoritschon.com/2022/06/13/facs-%EC%9B%90%EB%A6%AC/):

Նշենք, որ այժմ օգտագործվող տեխնոլոգիաները դեռևս չեն ապահովում միկրոկաթիլների բացարձակ կայունությունը, և որոշ դեպ293

քերում դրանց ամբողջականության խախտումը առաջացնում է ստացված արդյունքների շեղումներ: Սպասվում է, որ տեխնոլոգիաների զարգացումը կշարունակվի և դրանք կբարելավվեն, կդառնան ավելի հուսալի ու արդյունավետ: 3.11.2. Դիսպերգավորման միկրոխցիկային մեթոդ՝ Micowell Դիսպերգավորման այս մեթոդը կարող է հանդիսանալ կաթիլային մեթոդին համարժեք փոխարինող, քանի որ միավորում է բազմաքանակ զուգահեռ դասավորված ծորանների օգտագործման և բարձր ճշգրտության ու յուրահատկության թՊՇՌ-ի կատարման հնարավորությունները (К. Бренан, Т. Моррисон , 2005): Այս մեթոդի կատարման սկզբնական փուլում կարևոր է միկրոսխեմաների պատրաստումը: Միկրոսխեմաները կազմված են սիլիկոնային թիթեղում մեծ քանակությամբ առաջացվող բարակ ծորաններից: Հաջորդ փուլում միկրոսխեմայի մակերեսները մշակվում են, դարձվում հիդրոֆիլ ծորանների մասում և հիդրոֆոբ միջծորանային մակերեսներում: Միկրոսխեմայի ծորաններում կարող են կատարվել մեկուսացված հազարավոր ՊՇՌ ռեակցիաներ: Օգտագործվող զոնդերը նշադրվում են պոլիքրոմ եղանակով, որի շնորհիվ նույն պրոցեսում կարող են բացահայտվել բազմաթիվ տարբեր թիրախներ: Նշադիրները կապվում են միայն սպեցիֆիկ հերթականությունների հետ, բազմացնում դրանք և այսպիսով նշում դրա որակն ու քանակը հետազոտվող նմուշում: Ստացված արդյունքների դետեկցիան՝ ազդակների գրանցումը, տեսակի որոշումը և կարգավորումը կատարվում են հատուկ, երկմեր պատկերներ առաջացնող սարքերի միջոցով (R.L. Stears, T. Martinsky, M. Schena, 2003): Micowell մեթոդի համար կիրառվող ամենահարմար միկրոսխեմաներից են ThermoFisher տիպի QuantStudio 20K™ տարբերակները: Դրանց ծորանային մակերեսները անհարթ են, հիդրոֆոբ, իսկ ծորանների մակերեսները՝ հիդրոֆիլ: Միկրոսխեմաների ստեղծման ամենաընդունված մեթոդը միկրոլիտոգրաֆիան է: Միկրոսխեման պարունակում է մոտ 20 000 0,8-1,0 նլ ծավալով միկրոծորաններ:

Ծորանների ներքին մակերեսի հիդրոֆիլ ազդեցությունը և մազանոթային ուժերը պահում են հեղուկը ծորանների մեջ (նկ. 3.78): Նկ. 3.78. Միկրոխցիկային միկրոսխեմայի օգտագործման կարգը (https://pdfs.semanticscholar.org/c925 /b7ff427a68356bcbaeacd09ea86a0e6 81f63.pdf):

Նոսրացված լուծույթի դիսպերգավորումից հետո միկրոսխեմայի երկու մակերեսները անմիջապես պատվում են յուղային շերտով, որը արգելակում է հեղուկի գոլորշիացումը և նմուշների խառնվելու վտանգը: Մեթոդի կիրառությամբ կատարված հետազոտություններում հաջողվել է ստանալ ճշգրիտ քանակական արդյունքներ 10-90 մկմ խտությամբ նմուշների դեպքում (Witters et al., 2013): Վերջին տարիներին նմուշի լուծույթի արագ բաժանումը ծորանների միջև ավտոմատացված է և կատարվում է ռոբոտների օգնությամբ: Միկրոխցիկների մեթոդը ավելի հստակ և հուսալի է բաժանում նմուշի առանձին մասնիկները և ապահովում է թՊՇՌ-ի ավելի ճշգրիտ ու արագ կատարում: 3.11.3. Դիսպերգավորման միկրոծորանային մեթոդ Վերջին տարիներին մշակվել են նմուշի կաթիլների դիսպերգավորման նոր մեթոդներ, որոնց առանձնահատկությունը ժամանակակից պոլիմերային բնույթի նյութերի օգտագործումն է: Պոլիմերային նյութերը, լինելով մեխանիկորեն կայուն և ջերմադիմացկուն, հաջողությամբ օգտագործվում են լիտոգրաֆիայի մեթոդով բազմախցիկային և բազմածորանային միկրոչիպերի պատրաստման համար: Բազմաշերտ մոնոլիտային փափուկ լիտոգրաֆիայի եղանակով ձևավորվող միկրոհեղուկային միկրոչիպերը նման են ինտեգրված տրանզիստորներին (Heyries et al., 2011, Tian et al., 2015a): Պոլիմերների օգտագործմամբ ավելի հեշտ և արագ են ձևավորվում հետազոտությունների համար

անհրաժեշտ միկրոխցիկային/միկրոծորանային համակարգեր պարունակող միկրոչիպեր, քան այլ նյութերի դեպքում (Blow, 2009, de Mello, 2006, Sackmann et al., 2014, Velve-Casquillasetal, 2010): ՊՇՌ-ի համար նոսրացված նուկլեինաթթվի նմուշ պարունակող լուծույթը ներմուծվում է պոլիդիմեթիլօքսանից՝ PDMS-ից կազմված միկրոֆլուիդային միկրոսխեմայի մեջ: Միկրոսխեման կազմված է նանոեղանակով ձևավորված հազարավոր, մեկը մյուսի հետ կապված փոքր խցիկներից: Այսպիսի կազմության շնորհիվ ամեն առանձին խցիկում կատարվում են մեկուսացված միկրոՊՇՌ ռեակցիաներ (Blow, 2007, Nixon, et al., 2014, Ottesen, et al., 2006, Рамакришнан и др., 2013): Լուծույթը հավասարապես բաշխվում է խցիկների միջև և ամեն խցիկում, մեծ հավանականությամբ, գտնվում է անհատական ՊՇՌ ռեակցիայի ենթարկվող նուկլեինաթթվի մեկական մոլեկուլ: Խցիկները բաժանվում են միկրոհեղուկային փականով՝ ուղղահայց ծորանները մեկուսացնող PDMS-ի թաղանթով: Fluidigm ֆիրման ստեղծել է միկրոչիպեր, որոնցում նյութի բաժանումը խցիկների միջև կատարվում է յուղի հոսքի միջոցով. յուղի շերտը բաժանում է խցիկների ջրային լուծույթը՝ արգելակելով խառնվելու հնարավորությունը (նկ. 3.79): Արդեն մշակվել և արտադրվում են ավելի կատարելագործված բազմաշերտ միկրոչիպեր: Օրինակ՝ դրանցից մեկը կատարում է և ԴՆԹ-ի մաքրում, և թՊՇՌ (Tian et al., 2015a): Մեկ այլ տարբերակ օգտագործվում է բջիջների կլանման, քայքայման, հետադարձ տրանսկրիպցիայի և թՊՇՌ-ի իրականացման համար (White et al., 2013): 2010 թվականին կիրառվեց սահող բաժանման եղանակը: Երկու թիթեղների մակերեսների օգտագործմամբ ձևավորվում են ծորաններ, որոնց մեջ լցվում է հեղուկ: Ապա թիթեղները շարժվում են մեկը մյուսի նկատմամբ և բաժանում ծորանները առանձին մեկուսացված խցիկների, որոնցում և կատարվում է ՊՇՌ-ն (Shen et al., 2011): Լուծույթի բաժանումն առանձին ծավալների այս եղանակով ավելի հուսալի է, քան կաթիլների ձևավորման եղանակը, և ավելի

արդյունավետ, բայց ոչ լիովին անթերի: Օրինակ՝ PDMS-ի թաղանթը, լինելով օդաթափանցիկ, չի արգելակում լուծույթի չորացումը և միշտ չէ, որ ապահովում է խցիկների մեկուսացումը:

Նկ. 3.79. Միկրոսխեմայի կազմության և օգտագործման սխեման: Հատուկ մուտքերով միկրոսխեմայի մեջ ներմուծվում է ՊՇՌ լուծույթը: Հաջորդ փուլում, երբ բոլոր խորշերում արդեն առկա է նուկլեինաթթվի և լուծույթի բավարար քանակություն, այլ մուտքով ուղղահայաց ուղղությամբ ներմուծվում է յուղ: Յուղային շերտը բաժանում է խորշերի պարունակությունը՝ ապահովելով առանձին ՊՇՌ ռեակցիաների մեկուսացումը (https://pdfs.semanticscholar.pdf, Cao L., et al., 2016):

Տարբեր մեթոդների կատարման ընթացքում բացահայտվում են տարբեր թերություններ, որոնց հաղթահարման համար մշակվել և մշակվում են բազմազան նորույթներ: Օրինակ՝ վերջին տարիներին ջրայուղային կաթիլները պատվում են ագարոզային դոնդողով, որն առավել հուսալի է մեկուսացնում կաթիլները և պահպանում քայքայումից կամ միավորումից: Հուսալիության աստիճանի բարձրացման համար կարող է կատարվել դոնդողի սառեցում և ամուր գնդերի ձևավորում: Դոնդող/զոլ (հեղուկ ֆրակցիա) անցումը ապահովում է կաթիլների հուսալի բաժանում և թույլ է տալիս օգտագործել ոչ թանկ տեխնոլոգիաներ՝ ստանալով արդյունքների բարձրագույն մակարդակ: Այս եղանակով կատարվող հետազոտություններում հաջողվել է բացահայտել նույնիսկ 0,1 % հաճախականությամբ հանդիպող մուտանտ ալելներ (Zhang et al., 2012):

3.12. ՏՊԱԳՐՈՒՄ ՅՈՒՐԱՀԱՏՈՒԿ ՆՄՈՒՇՆԵՐԻ ՕԳՏԱԳՈՐԾՄԱՄԲ

1. Նմուշների կաթիլային կամ հոսքային տպագրման մեթոդը իսկզբանե արդյունավետ է և կարող է բարելավվել նոր տեխնոլոգիաների և նյութերի օգտագործման եղանակով (Hoffmann, et al., 2012): 2. Մեթոդը ունիվերսալ է և կիրառվում է տարբեր տեսակի հետազոտություններում: Պրոցեսը կազմված է մի քանի փուլերից (նկ. 3.80): Նախ յուղային նյութը տպվում է մոդիֆիկացված հիդրոֆիլ/հիդրոֆոբ մակերեսի վրա (Zhang et al., 2011): Ապա յուղի ամեն մի կաթիլի մեջ ներմուծվում է նուկլեինաթթու պարունակող ՊՇՌ լուծույթի դոզա: Հաջորդ փուլում պատրաստի նմուշները ենթարկվում են ամպլիֆիկացիայի:

Նկ. 3.80. Տպագրման կաթիլային մեթոդի փուլերը (https://pdfs.semanticscholar.pdf, Cao L., et al., 2016):

Առաջացած ֆլուորեսցենտ ազդակները գրանցվում են և վերլուծվում: Սիլիկոնային յուղի կաթիլների չափսերը կարող են լինել 800 պլ: Մեթոդը պահպանում է չորացումից, ապահովում է կաթիլների մեկուսացում և ՊՇՌ ռեակցիայի կատարման համար հուսալի բարենպաստ պայմաններ: Տպագրման մեթոդը ունիվերսալ է, կիրառելի է տարբեր նմուշների ու հետազոտությունների համար: Կատարելագործված տպագրման կաթիլային մեթոդը մեծ հավանականությամբ կդառնա թՊՇՌի իրականացման ամենահարմարավետ եղանակ:

3.13. ՊՇՌ-Ի ԱՐԴՅՈՒՆՔՆԵՐԻ ՔԱՆԱԿԱԿԱՆ ԳՆԱՀԱՏՄԱՆ

ՄԵԹՈԴՆԵՐԸ

dPCR-ի կատարման տարբեր եղանակների կիրառմամբ ստացված արդյունքները ենթարկվում են դետեկցիայի և մշակվում են օգտագործվող եղանակներին համապատասխանող մեթոդներով: Բոլոր դեպքերում առանձին կաթիլում կամ խցիկում թիրախ մոլեկուլները ամպլիֆիկացվում են, և ամեն մի առանձին ռեակցիայի արդյունքում հետզհետե աճում է ֆլուորեսցենտ ազդակի ինտենսիվությունը: ՊՇՌ-ի բավարար ցիկլեր անցնելուց հետո ազդակները դառնում են ըմբռնելի: ԹկՊՇՌ-ի արդյունքները որոշվում են ֆլուորեսցենտ ազդակ առաջացնող

կաթիլների

անմիջական

հաշվառման

եղանակով:

Դետեկցիայի համար օգտագործվում է ֆոտոպատկերներ հաշվարկող (PMT) սարքը (Л. Мазутис и др., 2009, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pmc/articles/PMC4128248/): ԹկՊՇՌ-ի հաշվառում կատարող սարքը լայնորեն օգտագործվում է տարբեր ֆիրմաներում արտադրվող թերմոցիկլերներում d PCR (QX100™, QX200™, Bio-Rad®, Rain Drop™, RainDance®): Ջուր/յուղ խառնուրդում կատարվող ամպլիֆիկացիայի ռեակցիայի ավարտից հետո կաթիլները հավաքվում են տեղափոխվող անոթի մեջ և միացվում ընթերցող սարքին: Մեկուսացնող յուղի հոսանքի և բրդող ճնշման ազդեցությամբ կաթիլները 1000 կաթիլ վայրկյանում արագությամբ շարժվում են լազերային երկգույն դետեկտորի խողովակով: Խողովակի որոշակի կետում կատարվում է կաթիլում գտնվող ֆլուորեսցենտ զոնդով նշադրված թիրախ նմուշներից ստացվող ազդակի գրանցում (նկ. 3.81): Թիրախ

մոլեկուլների

բացարձակ

խտությունը

սկզբնական

նմուշում որոշվում է խողովակում առկա բոլոր կաթիլների և ազդակ արձակող կաթիլների քանակական հարաբերությամբ:

ս

'.եtոո11եugեCյgl1ա1'1 ո11ոշllաCյ լjեո

tllոtutiոCյ կարatitCiե11

-

i

p Շյ

laաlfiոCյCյե11 ~

Ը

12:

u:t=~~:i. • -----------'

ա

.D

ա

.c.

Թtiրiաtն 1

{I

Թtiրiաtն 2 :եոնյայtյ[յ ագ11ակ

'\ \ (\] Ո\Ո/\. րi Վ\N մաllաCյալjo

Նկ. 3.81. ԹկՊՇՌ-ի արդյունքների դետեկցիայի սխեման: Ա - կաթիլները ճնշման տակ անցնում են մազանոթային խողովակով և ամեն կաթիլ ստանում է լուսային ազդակ: Թիրախ ՆԹ պարունակող կաթիլների ֆլուորեսցենտ նշադիրները արձակում են լույս, որը գրանցում է հաշվիչ PMT սարքը: Բ - ստացված արդյունքներով կառուցվում է գրաֆիկ: Ինչքան մեծ է տվյալ նշադիրը կրող թիրախ ՆԹ պարունակող կաթիլների քանակը, այնքան ավելի բարձր է գրանցվող ազդակի ինտենսիվությունը և այնքան մեծ է գրաֆիկում գագաթի բարձրությունը (https://pdfs.semanticscholar.pdf, Cao L., et al., 2016):

Միկրոխցիկային Micowell, միկրոծորանային և նմուշների տպագրման մեթոդներով կատարվող ՊՇՌ-ների դեպքում դետեկցիան կատարվում է ռաստրային երկմեր 2D ֆլուորեսցենտ պատկերներով: Փորձի համար նոսրաված նմուշը բաժանվում է չիպային կազմություն ունեցող մակերեսների վրա, և առաջանում են երկմեր 2D փորձադաշտեր: Ամպլիֆիկացիան կատարվում է մակերեսի վրա ֆիքսված ամեն առանձին մասնիկի մեջ: Այն մասնիկներում, որտեղ առկա է ՆԹ-ի ֆլուորեսցենտ նշադրված նմուշ, կատարվում է ֆլուորեսցենտ ազդակ արձակող գործոնների կուտակում, և ազդակը գրանցվում է CCD զուգորդված ազդակ ընկալող սարքով: 2D ֆլուորեսցենտ պատկերների դետեկցիայի սխեման ներկայացվում է նկար 3.82-ում: Ստացված պատկերում հաշվարկվում են բոլոր առանձին միավորները և տարբեր գույնի միավորները, կատարվում է ամեն առանձին միավորի խտության հաշվարկը նմուշում:

u

,----. ---------. ----~ I

I

'

.... ........ .. ...... .

ր

• :.::: :•:: :::.:: • րթ~ոարն 1 : : :: :: :::::::::: • րթ~ոարն 2 •••••••• ••••••• • lրոU

Նկ. 3.82. Երկմեր 2D ֆլուորեսցենտ պատկերներով կատարվող երկու տեսակի թիրախների դետեկցիայի սխեման. Ա - առանձին փորձադաշտի մշակում լույսի արտանետման դիոդներով՝ ԼԱԴ և ստացված արձագանքի գրանցում CCD սարքով, Բ - ստացված պատկերի ընդհանուր տեսքը (https://pdfs.semanticscholar, Cao L., et al., 2016):

3.14. ԹՊՇՌ-Ի ԿԻՐԱՌՄԱՆ ԲՆԱԳԱՎԱՌՆԵՐԸ

ԹՊՇՌ-ի տարբերակները կիրառվում են այն դեպքերում, երբ անհրաժեշտություն է առաջանում բացահայտել նմուշներում ՆԹ-ների ցածր խտություն ունեցող տարրերը անկախ դրանց բնույթից՝ լինեն դրանք մուտանտ ալելներ, ուռուցքային բջիջների փոփոխված ԴՆԹներ կամ ՌՆԹ-ներ, քրոմոսոմային վերակառուցումներ կամ հարուցիչների ՆԹ-ներ: ԹՊՇՌ-ն, շնորհիվ մեթոդի հիմնական սկզբունքի՝ նոսրացված նմուշների հետազոտման, թույլ է տալիս բացահայտել առանձին թիրախ մոլեկուլներ և այսպիսով ճշգրիտ գնահատել դրանց առկայությունն ու խտությունը հետազոտվող նմուշում: Այսօր արդեն թՊՇՌ-ն կիրառվում է մի շարք գենետիկական հետազոտություններում և բժշկագիտական բնագավառներում: Դրանք են հարուցիչների բացահայտումը առանձնյակի արյան կամ այլ հեղուկների կազմում, գեների պատճենների (CNV) հաշվարկը գենոտիպում, փոքր ՌՆԹ-ների (miRNA) վերլուծությունը, սերունդներում նպատակային մուտացիաների բացահայտումը, առանձին բջջում գենի էքսպրեսիայի մակարդակի հետազոտությունը:

3.14.1. Հարուցիչների բացահայտումը թՊՇՌ-ի մեթոդով ԹՊՇՌ-ի գրեթե բոլոր տարբերակները կիրառելի են հարուցիչների ՆԹ-ների բացահայտման համար: Օրինակ՝ կաթիլային «IC 3D» համակարգը կիրառվել է թարմ արյան մի քանի կաթիլում արագ, կարճ ժամկետում բակտերիաների գենոմների բացահայտման համար: Միկրոխցիկային dPCR մեթոդով խոզի ստամոքսում բացահայտվել է Prevotella բակտերիայի առկայությունը, որի խտության փոփոխությունը բուժման մեթոդի ազդեցության չափանիշ է: Նույն մեթոդը կիրառվել է մարդու արյան մոնոնուկլեար բջիջներում և ուղեղային հեղուկում ՁԻԱՎ-ի գենոմի բացահայտման համար: Սպիտակուցային Ribonuclease P ենթամիավորը կոդավորող վիրուսային p30 (RPP30) գենի խտությունը օգտագործվել է որպես ՁԻԱՎ-ի ՆԹ-ի բացարձակ քանակի ցուցանիշ: Բացահայտվել է, որ ուղեղային հեղուկի բջիջների 64 %-ը պարունակում են ՁԻԱՎ-ի ԴՆԹ և միայն 53 %-ը՝ ՁԻԱՎ ՌՆԹ: Նման հետազոտություններ են կատարվել նաև մարդու ցիտոմեգալովիրուսի (HCMV) բացահայտման համար (R.T. Hayden, Z. Gu, J. Ingersoll, D. Abdul-Ali, Shi L., 2013): ԹՊՇՌ-ի՝ dPCR-ի մեթոդով կատարված հետազոտությունների արդյունքները ապացուցում են այս մեթոդի արդյունավետությունը և ճշգրտությունը ցածր խտություններով թիրախների բացահայտման գործում: 3.14.2. Գեների պատճենների (CNV) քանակի որոշումը թՊՇՌ-ի մեթոդով Գենոմում գեների քանակի փոփոխությունը գենետիկական փոփոխականության ազդեցիկ գործոն է և հաճախ կապված է մարդու ու կենդանիների բազմաթիվ պաթոլոգիաների՝ ուռուցքների, նյարդային և աուտոիմուն հիվանդությունների, դեղանյութերի նկատմամբ օրգանիզմի արձագանքի շեղումների հետ: ԹՊՇՌ-ն թույլ է տալիս բացահայտել քանակի փոփոխությունը 1/100 հարաբերությամբ (Маркс, 2014, A.S. Whale, J.F. Huggett, S. Cowen, V. Speirs, J. Shaw, S. Ellison, et al., 2012):

3.14.3. Գեների էքսպրեսիայի հետազոտում թՊՇՌ-ի մեթոդով ՄՌՆԹ-ների և փոքր ՌՆԹ-ների (miRNA) ակտիվության մակարդակի վերլուծություն Գեների էքսպրեսիայի վերլուծությունը կատարվում է բջիջներում արտադրվող ՌՆԹ-ների քանակի որոշման եղանակով: Որպես նմուշ օգտագործվում են կամ որոշակի հյուսվածքի միատիպ բջիջները կամ ուռուցքային հյուսվածքի հեղուկը, որում միշտ առկա են բջիջներում սինթեզվող ՆԹ-ներ: Առավել արդյունավետ է ԹՊՇՌ-ի մեթոդը հազվադեպ ակտիվացվող գեների էքսպրեսիայի գնահատման համար: Այս դեպքում նույնպես հետազոտվում են բջջային լիզատները կամ հյուսվածքային հեղուկը: Ուռուցքների վաղ ախտահանման համար օգտագործում են միՌՆԹ նշադիրներ, որոնց արտադրության ինտենսիվությունը պայմանավորված է ուռուցքի զարգացման պրոցեսում տեղի ունեցող կառուցվածքային գեների կարգավորման մեխանիզմների փոփոխությամբ (Ф. Хирш, 2019): Կաթիլային

թվային

ՊՇՌ

մեթոդով

թոքերի

հյուսվածքում

բացահայտվել է թիրախ մի-ՌՆԹ-ների բացարձակ քանակը: Օրինակ՝ որպես թոքերի քաղցկեղի նշադիր օգտագործում են երկու մի-ՌՆԹ՝ miR-31 և miR-210: 3.14.4. Հազվադեպ հանդիպող մուտացիաների բացահայտումը թՊՇՌ-ի մեթոդով Հազվադեպ հանդիպող մուտացիաների բացահայտման համար նույնպես կիրառվում է թՊՇՌ-ի եղանակը (B. Vogelstein, K.W. Kinzler DigitalPCR, 1999): Հազվադեպ հանդիպող մուտացիաների բացահայտումը ՊՇՌ-ի այլ եղանակների միջոցով քիչ հավանական է այն պատճառով, որ մուտանտ ալելներին կոմպլեմենտար պրայմերները բարձր խտության շնորհիվ մրցակցային պայմաններում առաջացնում են ոչ յուրահատուկ դուպլեքսներ, իսկ նոսր խտությամբ մուտանտ ալելները,

չկապվելով պրայմերների հետ, չեն ամպլիֆիկացվում, ուստի և չեն բացահայտվում: ԹՊՇՌ-ի դեպքում, նոսրացված լուծույթում հաճախականությունների տարբերությունը կորցնում է արգելակիչ ազդեցությունը, և ռեակցիային մասնակցող ամեն հետազոտվող շղթան հավասար հավանականությամբ կապվում է պրայմերին: Այսպիսով՝ թՊՇՌ-ն առավել արդյունավետ է հազվադեպ հանդիպող ալելների բացահայտման համար: Մուտացիաների

հետազոտությունը

հաճախ

կատարվում

է

արյան սիճուկում առկա արտաբջջային ԴՆԹ-ներում: Սովորաբար հետազոտվում են քաղցկեղի դեպքում բացահայտվող մուտացիաները: Մի խումբ գիտնականներ հետազոտել են նաև ուռուցքային բջիջների ԴՆԹ-ների մուտացիաները (Taly, Pekin, Benhaim, Kotsopoulos, Le Corre, Li X., et al., 2013): Օրինակ՝ KRAS գենի մուտացիաները կարող են օգտագործվել որպես բուժման արդյունավետության նշադիր: Ինչպես հայտնել է Բեկ Ջ. 2013 թ. օրգանների փոխպատվաստումից հետո արյան սիճուկում բացահայտվում է տեղափոխված օրգանի կամ հյուսվածքի ԴՆԹ-ն (J. Beck, S. Bierau, S. Balzer, R. Andag, et al., 2013): Դրա խտության ավելացումը արյան սիճուկում պայմանավորված է պատվաստի քայքայման պրոցեսներով, և հետազոտության այս եղանակը կարևոր է պատվաստների ընտելացման պրոցեսի գնահատման համար: Այսպիսով՝ ուռուցքների բջիջներում ԴՆԹ-ների մուտացիաների քանակի և փոխպատվաստումից հետո արյան սիճուկում պատվաստի ԴՆԹ-ների խտության որոշումը կարող են դառնալ բժշկագիտական հետազոտությունների կարևոր գործոն:

3.14.5. Քրոմոսոմային անոմալիաների բացահայտումը թՊՇՌ-ի մեթոդով Այսօր արդեն քրոմոսոմային վերակառուցումները բացահայտվում են թՊՇՌ-ի եղանակով (M.I. Evans, D.A. Wright, E. Pergament, H.S. Cuckle, K.H. Nicolaides, 2012): Խոսքը դելեցիաների, տրանսլոկացիաների և ինսերցիաների մասին է: ԹՊՇՌ-ի եղանակով կատարվում են սաղմի ոչ ինվազիվ պրենատալ սկրինինգ (NIPS) և քրոմոսոմային վերակառուցումների բացահայտումներ (Chiu R.W., Poon L.L., Lau T.K., Leung T.N., Wong E.M., Lo Y.M., 2001): Նույն եղանակով է բացահայտվում նաև քիմերիզմը հեմապոեզի ժամանակ: Նշենք, որ թՊՇՌ-ի կատարման պրոցեսի հիմնական փուլերը ավտոմացված են և չեն պահանջում մարդու ակտիվ ու երկարատև մասնակցություն:

3.15. ԹՊՇՌ-Ի ՄԵԹՈԴԻ ԱՄՓՈՓՈՒՄ ԵՎ ՀԵՏԱԳԱ ԶԱՐԳԱՑՄԱՆ

ՈՒՂԻՆԵՐԻ ՔՆՆԱՐԿՈՒՄ

ԹՊՇՌ-ն ՆԹ-ների հազվադեպ հանդիպող տեսակների բացահայտման հասարակ և ճշգրիտ եղանակ է: ԹՊՇՌ-ի տարբերակները ապահովվում են տարբեր նմուշների հետազոտման նպատակային եղանակներ: Նմուշների նոսրացման և մանրագույն՝ մինչև նլ ծավալները թույլ են տալիս կատարել այլ եղանակներով չբացահայտվող հազվադեպ հերթականությունների բացահայտում և դրանց քանակի ճշգրիտ որոշում: ԹՊՇՌ-ի կատարման, նմուշների դիսպերգավորման և նշադրման մեթոդները ապահովվում են փորձաքննության ճշգրտության բարձրագույն մակարդակ և հնարավորություն են տալիս կանխատեսել թՊՇՌ-ի կատարելագործման նոր ուղիներ: Նուկլեինաթթուների հետազոտման այլ եղանակներում օգտագործվող ՆԹ-ների նշադրման և բացահայտման եղանակները՝ ֆերմենտային, իմունաբանական, մոլեկուլային փարոսի մեթոդները կարող են ներգրավվել թՊՇՌ-ի գործընթացի մեջ և բազմազանեցնել արդեն գոյություն ունեցող տարբերակները:

3.16. ԺԱՄԱՆԱԿԱԿԻՑ ԱՄՊԼԻՖԻԿԱՏՈՐՆԵՐԸ

ՊՇՌ ամպլիֆիկատորները տարիների ընթացքում փոփոխվել են, բարելավվել, մասնագիտացվել տարբեր հետազոտություններին համապատասխան, ստեղծվել են նոր հանգույցներ և ֆունկցիաներ: Սկզբնական ժամանակաշրջանում կիրառվող ջերմային ռեժիմի փոփոխման համակարգը՝ տարածականը (նմուշները տեղափոխվում էին տարբեր ջերմաստիճանային գոտիներ), փոխարինվել է նոր՝ Պելտյեի էլեմենտների օգտագործմամբ գործող համակարգով: Նոր համակարգը ստացել է ստացիոնար անվանումը: Այս համակարգը թույլ է տալիս ավելի արագ կատարել ջերմաստիճանի փոփոխությունը և ապահովում է ամբողջ ռեակցիայի արագացում: Պելտյեի էլեմենտների շնորհիվ փոփոխվել են նմուշների համար օգտագործվող փորձանոթները, օգտագործվում են պլաստիկ նյութերից պատրաստված փորձանոթներ, ինչը նույնպես նպաստում է ջերմային ռեժիմի փոփոխման արագացմանը: Ընդլայնվել է ռեակցիաներում օգտագործվող ջերմակայուն ԴՆԹ-պոլիմերազ ֆերմենտների ցանկը, մշակվել են ԴՆԹ-ի հատվածների նշադրման և ստացված արդյունքների դետեկցիայի եղանակները: Սովորական, հիմնականում ռեալ թայմ ՊՇՌ-ի համար արտադրվող ամպլիֆիկատորները արդյունավետ են, տալիս են ճշգրիտ արդյունքներ և օգտագործվում են ինչպես գիտական, այնպես էլ կիրառական բնագավառներում: Բայց ՊՇՌ ռեակցիայի կատարման համար երկար ժամանակ կիրառվող համակարգերը սովորաբար ունեն մեծ չափսեր, ջերմային ցիկլերի փոփոխումները երկարատև են, օգտագործում են շատ էլեկտրականություն և թանկարժեք են: Նման սարքերի օգտագործումը հասանելի է միայն մեծ լաբորատորիաներում: Այժմ մշակվել են նոր տիպի թերմոցիկլերներ, որոնք ավելի արագ են կատարում ջերմաստիճանի ռեժիմի փոփոխությունները, ավելի մոբիլ են, օգտագործում են քիչ էլեկտրաէներգիա և հարմարեցված են քանակական մեթոդներով կատարվող ՊՇՌ-ի համար: Ժա306

մանակակից թերմոցիկլերը նույնպես աշխատում են երկու հիմնական սկզբունքով՝ ստացիոնար կամ տարածական: Ժամանակակից, ստացիոնար եղանակով գործող թերմոցիկլերներում ջերմաստիճանային ցիկլերի փոփոխման համար օգտագործվում են լազերային ճառագայթներ, ակուստիկ ալիքներ և միկրոմշակված մետաղյա թիթեղներ: Լազերային եղանակը հիմնվում է լույսի էներգիայի միջոցով ջերմային ազդեցության առաջացման մեթոդի վրա: 60 նմ տրամագծով մասնիկները ակտիվացվում են 532 նմ երկարությամբ ճառագայթներով և բարձրացնում ջերմաստիճանը 7,62 ºC վայրկյանում: Սառեցումը կատարվում է հովհարով 3,33 ºC վայրկյանում արագությամբ: Չնայած ջերմակարգավորման այս եղանակը արդյունավետ է, բայց թանկարժեք, այդ պատճառով ավելի հաճախ կիրառվում է ոսկյա թիթեղի եղանակը: Ոսկյա թիթեղը տաքացվում է լույսարձակող դիոդներով (Son, et al., 2015), որոնք ոսկու բարձր ջերմահաղորդականության շնորհիվ ապահովում են ջերմաստիճանի բարձրացման 12,79 ºC վայրկյանում արագություն և զգալիորեն կրճատում ռեակցիայի ընթացքը: Սառեցումը կատարվում է 6,6 ºC վայրկյանում արագությամբ՝ կատարելագործված հովհարով: Ներկայացվող մեթոդը մատչելի է, արագ, քիչ էներգատար, ապահովում է ամպլիֆիկացիայի բարձր արագություն: Ակուստիկ ճառագայթների օգտագործումը ջերմակարգավորման համար նույնպես կիրառվում է ՊՇՌ ռեակցիաներում, մասնավորապես կաթիլային թվային ՊՇՌ-ի համար: Կաթիլները հոսում են խողովակով տարբեր ջերմաստիճանային գոտիներով, և դրանցում կատարվում են ՊՇՌ-ի ցիկլերը (նկ. 3.83.1): Ջերմաստիճանի բարձրացման արագությունն այս դեպքում հավասար է 25 ºC վայրկյանում, իսկ իջեցմանը՝ 18 ºC: Այսպիսով թերմոցիկլերի այս տարբերակը ապահովում է ՊՇՌ-ի կատարման լավագույն պայմաններ՝ ջերմաստիճանային ռեժիմի բարձր զգայունություն և մեծաքանակ նմուշների մշակում կարճ ժամկետներում: Սակայն այս դեպքում անհրաժեշտ է թերմոցիկլերում ունենալ հեղուկի մեծ ծավալներ և կաթիլային նմուշ307

ների շարժը առաջացնող ճնշումը կարգավորող սարքեր, որոնք թերմեցիկլերը դարձնում են մեծ և բարդ կազմված: Նկ. 3.83. 1 - հոսանքային եղանակով տեղափոխվող կաթիլային ՊՇՌ-ի սխեման, 2 - նմուշները ռոտորի եղանակով տեղափոխող թերմոցիկլերի կառուցվածքային սխեման (https://pdfs.semanticscholar):

Տարածական թերմոցիկլերի մյուս տարբերակը կառուցված է ռոտորային սկզբունքով՝ նմուշներ պարունակող միկրոչիպը պտտվում է երեք տարբեր ջերմաստիճանային պայմաններ ունեցող ծավալների միջև և անցնում դրանցում ՊՇՌ-ի ցիկլի բոլոր փուլերը (նկ. 3.83.2):

Նկ. 3.84. ProFlex™ համակարգի ընդհանուր տեսքը և կիրառվող տարատեսակները: Սարքը ունի նմուշների դասավորման 4 տարբեր տիպի խցիկներ: 1 - թերմոցիկլերի ընդհանուր տեսքը, 2 - 2*384 նմուշներ ամպլիֆիկացնող խցիկ, 3 - 96 նմուշներ ամպլիֆիկացնող խցիկ, 4 - 2/96 նմուշ ամպլիֆիկացնող խցիկ, 5 - 3*32 նմուշ ամպլիֆիկացնող և լիովին մեկուսացված խցիկներ, 6 - մշակված է 2 Open Array տիպի 8*3072 նմուշ պարունակող թիթեղներ կամ 16*20000 նմուշ պարունակող միկրոչիպերի համար (http://www.spt.by/content/view/1011/9/):

Ջերմաստիճանի արագ բարձրացման համար ստեղծվում են կափարիչի մոդելներ, որոնց շփումը նմուշ պարունակող բլոկի հետ ավելի սերտ է և ապահովում է ջերմաստիճանի բարձրացման բարձրագույն արագություն՝ 44 ºC վայրկյանում: Այսպիսով՝ այժմ մշակվում են թերմոցիկլերների նոր տարբերակներ, որոնք աչքի են ընկնում փոքր չափսերով, էներգիայի խնայման ռեժիմով և մատչելի գներով, օգտագործման հարմարությամբ և ջերմաստիճանային ռեժիմի արագ փոփոխությամբ: Նոր թերմոցիկլերը շատ հարմար են միկրոհեղուկային թՊՇՌ-ի կատարման համար: Ներկայացնենք դրանց տարատեսակները (նկ. 3.84): ProFlex™ տիպի Applied Biosystems կազմակերպության թերմոցիկլերը կարող են օգտագործվել ինչպես սովորական ռեալ թայմ ՊՇՌ-ի համար (2, 3, 4 և 5-րդ տարբերակները հարմարեցված են 0,02 մլ փորձանոթների համար), այնպես էլ թՊՇՌ-ի համար (6-րդ տարբերակը): Թերմոցիկլը բնութագրվում է ջերմաստիճանի փոփոխման բարելավված համակարգով, կարող է միաժամանակ օգտագործվել տարբեր հետազոտությունների համար՝ 5-րդ տարբերակը, կապված է մոբիլ կապի հետ և կարող է ղեկավարվել միջնորդացված եղանակով, ունի սենսորային էկրան: Մեկ այլ՝ B960 տիպի թերմոցիկլերները ունեն կարգավորման համար հարմար ստեղնաշար և մեծ գունավոր դիսպլեյ: Ջերմաստիճանային ռեժիմի կարգավորումը արագ է և ճշգրիտ, արտադրվում են տարբեր տիպի՝ սովորական և քՊՇՌ-ի համար (նկ. 3.85) և կիրառվում են տարբեր հետազոտությունների համար: Տաքացնող բլոկը ունի ոսկյա ծածկ: Հեղուկի գոլորշիացումը փորձանոթներից արգելակված է: Թերմոցիկլը կապվում է համակարգչի, տպիչի և ինտերնետի հետ, ունի USB մուտք և ծավալուն հիշողություն: ԹՊՇՌ-ի համար օգտագործվող թերմոցիկլերների երրորդ տարբերակը ներկայացված է նկար 3.85-ում: QX200 Droplet Digital PCR համակարգը նախատեսված է կաթիլային թվային ՊՇՌ-ի համար: Սարքը կազմված է միկրոդիսպերսիոն կաթիլներ առաջացնող QX200 Droplet Generator-ից, ՊՇՌ ապարատից և արդյունքների վերլուծություն կատարող գերզգայուն և ճշգրիտ QX200 Droplet Reader-ից:

Նկ 3.85. B960 տիպի թերմոցիկլերի արտաքին տեսքը և կառուցվածքը (http://ejsk.phct.ru/termociklerb960/):

Եվ այսպես, ժամանակակից թերմոցիկլերները բազմազան են և կիրառվում են տարբեր բնագավառներում: Դրանց մի մասը մասնագիտացված է որոշակի խնդիրների լուծման համար, մյուսը՝ բազմաֆունկցիոնալ է: Թերմոցիկլերների ընտրությունը կատարվում է դրված խնդիրների, գնի և չափսերի հաշվարկով՝ նկատի ունենալով կատարվող հետազոտությունների և ստացված արդյունքների ճշգրտության մակարդակը: Վերջին

տարիներին

հետազոտություններում

յուրահատուկ

խնդիրների լուծման համար օգտագործում են ՊՇՌ- թերմոցիկլերների նոր մոդիֆիկացիաներ՝ «կենսա-ՊՇՌ» (BIO-PCR), «իզոթերմալ հանգուցային ՊՇՌ» (Loop-mediated isothermal amplification - LAMP) և «միկրոարրեյ վերլուծություն» (Microarray), որոնց միջոցով նույն փորձում միանգամից թեստավորում են պաթոգենների բազմաթիվ տեսակներ և որոշում դրանց առկայությունը:

3.17. ՊՇՌ-Ի ՊՐՈՑԵՍԻ ՎԵՐԱՀՍԿՈՒՄ

ՊՇՌ-ի ռեակցիայի ընթացքի շեղումները պետք է վերահսկվեն մի քանի մակարդակներով. - արտադրական վերահսկում, - լաբորոտորիայի աշխատանքի արտաքին վերահսկում, - ներլաբորատոր վերահսկում: Արտադրական վերահսկումը նախատեսում է խիստ սանիտարականխարգելիչ գործընթաց և մշտապես կատարվում է ընդունված նորմերի սահմաններում: Խնդիրը՝ օտար վարակիչ գործոնների չեզոքացումն է և նմուշների աղտոտման հնարավորության բացառումը: Լաբորոտորիայի աշխատանքի արտաքին վերահսկումը իրականացվում է լաբորատորիայի աշխատանքների արդյունավետության և ճշգրտության մակարդակի համեմատական գնահատման միջոցով: Լաբորատոր վերահսկումը նախատեսում է աշխատանքների արդյունքների ճշգրտության ստուգում այլ լաբորատորիաներում: Ստուգումը կատարվում է առնվազն ամեն տարի: Այս նպատակով միաժամանակ տարբեր լաբորատորիաներում կատարվում է նույն նմուշների վերլուծություն, և ստացված արդյունքներով գնահատվում է տարբեր լաբորատորիաների աշխատանքի արդյունավետությունը: Ներլաբորատոր վերահսկումը նախատեսում է ստուգումների իրականացում որոշակի ծավալով աշխատանքների ավարտից հետո՝ աշխատանքների ինտենսիվության մակարդակով պայմանավորված ժամկետներում: Ստուգվում են ինչպես թեստային ռեագենտները և պանելները, այնպես էլ լաբորատորիայում պատրաստված ստուգիչ տարրերը: Աշխատանքը կատարվում է հետևյալ եղանակով. ներլաբորատոր կամ արտադրողից ստացված ռեակտիվներով ստուգվում է անալիտի առկայությունը և քանակը բոլոր լաբորատոր խառնուրդներում: Այդ նպատակով օգտագործում են ներքին ստուգիչներ՝ ՆՍ-ներ, ԴՆԹ չպարունակող բացասական ստուգիչներ՝ ԲՍ, դրական ստուգիչ311

ներ՝ ԴՍ, հատուկ ստուգիչներ, և գնահատվում են լաբորատոր մակերեսների մաքրման արդյունքները: Ներքին ստուգիչներ: ԴՆԹ-ի անբավարար մաքրման պատճառով փորձի համար նախապատրաստված նմուշում երբեմն մնում են օտար նյութեր, օրինակ՝ ինհիբիտորներ: Ինհիբիտորները արգելակում կամ դանդաղեցնում են ամպլիֆիկացիան և շեղում ռեակցիայի ընթացքը, ինչը խոչընդոտում է հետազոտվող նյութի բացահայտումը: Նման շեղումներից և անճշտություններից խուսափելու նպատակով նմուշի հետ միասին փորձանոթների մեջ ներմուծվում է որպես ներքին ստուգիչ չեզոք նյութ՝ ՆՍ, որի ծավալը մոտ 2 անգամ գերազանցում է թիրախ ԴՆԹ-ի քանակությունը: Սովորաբար այս նպատակով օգտագործվում է պրայմերներին կոմպլեմենտար հերթականություններ պարունակող β-գլոբուլինի փոփոխված գենը: ՆՍ-ն ենթարկվում է ամպլիֆիկացիայի նմուշ ԴՆԹ-ի հետ զուգահեռ: ՆՍ-ն ռեակցիայի ընթացքում դառնում է ամպլիֆիկացիայի թիրախ՝ անկախ հետազոտվող նմուշի առկայությունից: Եթե ՊՇՌ ռեակցիայի ավարտից հետո β գենի պատճենները չեն բացահայտվում ռեակցիոն խառնուրդում, ուրեմն միջավայրում առկա են ամպլիֆիկացիայի ինհիբիտորներ և անհրաժեշտ է կատարել ԴՆԹ-ի կրկնակի անջատում սկզբնական նյութից՝ հաշվի առնելով ամպլիֆիկացիայի ինհիբիտորների առկայությունը նմուշում: Այն դեպքերում, երբ ռեակցիայի վերջում ՆՍ-ների պատճենները առկա են խառնուրդում, բայց ստուգվող ԴՆԹ-ն չի բացահայտվում, կարելի է համարել, որ հետազոտվող նմուշը չի պարունակում ԴՆԹ: Եթե ռեակցիայի ավարտից հետո թիրախ ԴՆԹ-ի ամպլիկոնների քանակը աննշան է, կարելի է ենթադրել, որ դրա քանակը հետազոտվող նմուշում շատ ցածր էր կամ ՆՍ-ն մրցակցության սկզբունքով, նվազեցրել է թիրախ նյութի կրկնապատկման արագությունը: Ուստի ՆՍ-ի քանակը պետք է որոշվի այնպես, որ այսպիսի հետևանքներ չառաջանան:

ԴՆԹ-ի քանակական վերլուծության մեթոդը թույլ է տալիս որոշել ԴՆԹ-ի քանակը նմուշում փորձից հետո և հաշվարկել մրցակցության արդյունքում առաջացող քանակի նվազման չափը: Ճշգրիտ արդյունքներ ստանալու համար պետք է ապահովել հետևյալ պայմանները. 1. Ներքին ստուգիչը պետք է կրկնապատկվի և ստացված արդյունքները գրանցվեն անկախ թիրախ ԴՆԹ-ի առկայությունից՝ տարբեր խտությունների սանդղակի ձևով: 2. ՆՍ-ի և թիրախ ԴՆԹ-ի ամպլիֆիկացիայի էֆեկտիվությունները պետք է լինեն հավասար և համապատասխանեն քանակի աճի գծային հատվածի մակարդակին: 3. Եթե փորձում թիրախ մոլեկուլը ՌՆԹ-ն է, պետք է որպես ՆՍ օգտագործել ՌՆԹ-ի շղթա և երկու շղթաների հետադարձ տրանսկրիպցիան կատարել զուգահեռ՝ բացահայտելու համար պրոցեսի բոլոր հնարավոր շեղումները: Դրական ստուգիչները (ԴՍ) կիրառվում են ռեակցիոն խառնուրդի բոլոր բաղադրիչների քանակական հարաբերության և որակի ստուգման համար: Եթե դրանք բարձրորակ են և ճիշտ են ընտրված, ապա ՊՇՌ-ն կընթանա նորմալ, առանց շեղումների և ձախուղումների: Որպես դրական ստուգիչ օգտագործվում է հետազոտվող նմուշում բացահայտվող ԴՆԹ-ի հայտնի տարբերակը, որի վրա առկա են փորձում օգտագործվող պրայմերին կոմպլեմենտար հատվածներ կամ այդ ԴՆԹ-ի որևէ մաս: Սովորաբար հետազոտվող հատվածի չափսերը տարբերվում են ԴՍ-ի չափսերից. երբեմն դրանք կարող են լինել հավասար և այս դեպքում կգրանցվեն որպես ԴՍ: Ստացված ամպլիկոնների յուրահատկության ստուգման համար օգտագործվում են ֆլուորեսցենտ, նշադիր կրող ԴՆԹ զոնդեր: Դրանք խիստ յուրահատուկ են և թույլ են տալիս բացահայտել հետազոտվող ամպլիկոնները: Բացասական ստուգիչները (ԲՍ) կիրառվում են ռեակցիոն խառնուրդում օտար ԴՆԹ-ի հատվածների բացահայտման համար: Այս դեպքում նմուշ չպարունակող ռեակցիոն խառնուրդ է ներմուծվում կամ ապաիոնացված ջուր, կամ ԴՆԹ չպարունակող էքստրակտ:

Օտար աղտոտող ԴՆԹ-ների բացակայության դեպքում ամպլիֆիկացիան չի կատարվում, և ռեակցիոն խառնուրդը համարվում է մաքուր: Հատուկ ստուգիչների (ՀՍ) օգտագործումը թույլ է տալիս կատարել ռեակցիայի յուրահատկության գնահատում, ԴՆԹ-ի որակական դետեկցիա և հիմք է դնում դրա քանակական որոշման համար: Այս մեթոդը մեծ նշանակություն է ստանում այն դեպքում, երբ անհրաժեշտ է ստուգել տարբեր ԴՆԹ-ներ պարունակող նմուշներ, օրինակ՝ բիոցենոզների կազմը և քանակը, անդամների փոխհարաբերությունների բնույթը: Հատուկ ստուգիչներ են՝ - ԴՆԹ-ի ֆրագմենտների երկարության նշադիրները, - ռեակցիոն խառնուրդի բաղադրիչների վերահսկման գործոնները, - ստանդարտները և կալիբրատորները, - փորձնական նյութի ստացման մեխանիզմները: ԴՆԹ-ի ֆրագմենտների երկարության նշադիրները օգտագործվում են էլեկտրաֆորեզի ժամանակ՝ ռեստրիկտազներով կտրտված երկշղթա ԴՆԹ-ի հատվածների երկարության բացահայտման համար: Ռեակցիոն խառնուրդի բաղադրիչների վերահսկվող գործոններից է գրանցվող ֆոնային ֆլուորեսցենցիան, որը առաջանում է ինչպես զոնդերի, այնպես էլ ռեակտիվների պահման ժամկետների, օգտագործվող պլաստիկների, գրանցող սարքերի առանձնահատկությունների ազդեցությամբ: Ամպլիկոնների և ֆոնային ֆլուորեսցենցիայի համեմատական հետազոտությունը թույլ է տալիս որոշել հետազոտվող հատվածների ֆլուորեսցենցիայի սահմանային մակարդակը: Այս մակարդակը ընդհանուր է միասին հետազոտվող բոլոր նմուշների համար: Եթե հետազոտությունը կատարվում է FLASH մեթոդով, անհրաժեշտ է օգտագործել հատուկ ֆոնային փորձանոթներ: Ստանդարտների և կալիբրատորների օգտագործումը կապված է քանակական ՊՇՌ-ի հետ: Այս դեպքում կառուցում են ԴՆԹ-ի տարբեր խտությունների կալիբրային կորեր, որոնցով որոշում են

ԴՆԹ-ի գումարային քանակը նմուշում: Ստացված արդյունքների ճշգրտությունը կախված է նրանից, թե ինչքանով են փորձնական ՊՇՌ-ի պայմանները համապատասխանում ստանդարտների որոշման պայմաններին: Նմուշում ԴՆԹ-ի քանակի որոշման համար օգտագործվում է ռեալ ժամանակում ՊՇՌ, որի ստանդարտը կարող են լինել ռեալ ժամանակում ՊՇՌ-ի մաքրված նյութը, ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ն, նախօրոք ռևերտազ ֆերմենտով մշակված ռեկոմբինանտ ՌՆԹ-ը, հետազոտվող հատված պարունակող սինթետիկ օլիգոնուկլեոտիդը: Չնայած ՊՇՌ-ի կատարման բոլոր փուլերը խիստ վերահսկվում են, հաճախ ռեակցիայի արդյունքները ճշգրիտ չեն՝ սխալ բացասական են կամ սխալ դրական: 3.17.1. ՊՇՌ-ի կատարման սխալները ՊՇՌ-ի սխալները կարող են առաջանալ նախափորձնական, վերլուծողական և հետանալիտիկ փուլերում: ՊՇՌ-ի հաջող ընթացքի վրա ազդում է նմուշների ճիշտ անջատումը: Նմուշը պետք է վերցնել այնտեղից, որտեղ հետազոտվող ԴՆԹ-ի խտության մակարդակը բարձր է, քիչ են օտար խառնուրդները և ինհիբիտորները: Արյան նմուշների տեղափոխման համար գերադասելի է հեպարինը փոխարինել այլ մակարդող գործոնով, քանի որ հեպարինը ՊՇՌ-ի ինհիբիտոր է: Ստացված նմուշները կարելի է 24-48 ժամ պահել 2-8 ºC պայմաններում: Ավելի երկարատև պահման համար անհրաժեշտ է նմուշները սառեցնել: Արյան նմուշները չեն սառեցվում: Վերլուծողական փուլի սխալները առաջանում են նմուշներում օտար խառնուրդների, հետազոտման համար ընտրված թիրախի կազմակառուցվածքային առանձնահատկությունների, ռետրովիրուսների ՌՆԹ-ի անկայունության և այլ պատճառներով: Նմուշներից ՆԹ-ների անջատման համար սովորաբար դրանք եռացնում են կամ անջատում սորբենտային եղանակով: Երբեմն ԴՆԹն և ՌՆԹ-ն միաժամանակ են անջատվում: Վերջին մեթոդը կիրառելի

է բոլոր տեսակի նմուշների համար, բայց երկարատև է, բարձր է կոնտամինացիայի վտանգը և սորբենտի ազդեցությունը: Մեկ այլ խանգարիչ գործոն են մանրէների և վիրուսների տեսակային առանձնահատկությունները՝ մուտացիաների բարձր հաճախականությունը և ԴՆԹ-ի տեսակի ընտրության սխալները: Տեխնիկական սխալները կարող են առաջանալ, եթե հետազոտվող ԴՆԹ-ի երկարությունը մոտ է այլ շղթայի երկարությանը, և դրանց բաժանումը էլեկտրաֆորեզի եղանակով չի տալիս ճշգրիտ արդյունք: Սխալի պատճառ կարող է լինել նաև փորձանոթներում ֆոնային բաղադրիչների խտության սխալ որոշումը կամ դրանց պահման ռեժիմի խախտումը: Սխալ արդյունքները կարող են լինել նաև ամպլիֆիկացիոն փորձանոթների պահման ջերմաստիճանային ռեժիմի շեղումների արդյունք: Մեկ այլ պատճառ կարող են դառնալ ֆլուորեսցենտ սարքի արձագանքի տատանումները, որոնք առաջացնում են ֆլուորեսցենտ ազդակի սխալ գրանցումներ: Սխալների որոշ մասի պատճառ է մանրէների բարձր փոփոխականությունը: Սովորաբար թեստ-համակարգը կազմելու համար օգտագործվում են դրանց գենոմի ամենակոնսերվատիվ հատվածները, բայց նույնիսկ այս դեպքում հնարավոր մուտացիաները կարող են այնպես փոփոխել գենոմի կազմությունը, որ հետազոտվող շտամը դառնա անճանաչելի, և մանրէների դետեկցիա չկատարվի: Օրինակ՝ քլամիդիոզի (С. trachomatis) թեստավորման ժամանակ հիվանդների 30 %-ի մոտ հարուցիչը չէր բացահայտվում, իսկ պատճառը թեստ-համակարգում պլազմիդային հերթականության օգտագործումն էր՝ այն դեպքում, երբ հիվանդություն առաջացնող շտամը չուներ պլազմիդներ: Հետանալիտիկ փուլի սխալները: Դրանցից կարևորագույնը ստացված արդյունքների սխալ մեկնաբանումն է: Հաճախ բուժումից 12 շաբաթ անց կատարվող հետազոտությունը տալիս է դրական արդյունք, որը կարող է մեկնաբանվել որպես հիվանդության ապացույց, բայց իրականում հարուցիչների ԴՆԹ-ն բավականին երկար

ժամանակ մնում է հիվանդի հյուսվածքներում բջիջների էլիմինացիայից հետո, երբ հիվանդությունը արդեն հաղթահարված է: Որոշ բակտերիաների և վիրուսների առկայությունը արյան և հյուսվածքների բջիջներում գնահատվում է որպես հիվանդություն, բայց դա կարող է լինել վարակվածություն, բայց ոչ հիվանդություն: Հիվանդության ախտորոշման համար մեծ նշանակություն ունի հարուցված բջիջներում հարուցիչների ԴՆԹ-ի խտության մակարդակը: Որոշ պրոբլեմներ կարող են առաջացնել ՊՇՌ-ի և հետազոտության այլ եղանակների արդյունքում ստացված տվյալների անհամապատասխանությունը: Իմունաֆերմենտային վերլուծության և ՊՇՌ-ի արդյունքների տարբերության պատճառ կարող են լինել օրգանիզմների իմուն-համակարգի առանձնահատկությունները՝ ճնշված իմունային պատասխանը, իմունային պատասխանի որոշակի փուլի ՀՄ-ների խտությունը, իմունային հանդուրժողականությունը, նախկինում տարած ինֆեկցիոն հիվանդության մնացորդային ազդեցությունը և այլն: 3.17.2. Կոնտամինացիան և դրա հաղթահարման եղանակները Կոնտամինացիա է կոչվում ռեակցիոն խառնուրդում օտար, յուրահատուկ և ոչ յուրահատուկ պատահական ԴՆԹ-ների ներկայությունը: Դրանց առկայության պատճառով նպատակային ԴՆԹ-ի ամպլիֆիկացիայի պրոցեսը շեղվում է նորմալ ընթացքից, ուստի ստացված արդյունքները ճշգրիտ չեն: Կոնտամինացիայի պատճառները լինում են երեք տեսակի. խաչաձև՝ նմուշից նմուշ, կոնտամինացիա ամպլիֆիկացիայի ռեագենտներով, և կոնտամինացիա լաբորատոր ամանեղենի վրա առկա ԴՆԹ-ի հետքերով: Կոնտամինացիայի վտանգի նվազեցման համար կիրառվում են լաբորատոր աշխատանքի հետևյալ կանոնները.  Աշխատանքային գոտիների մեկուսացում, անջատում:  Աշխատանքային նմուշների միակողմանի շարժ՝ միայն մեկ ուղղությամբ փոխանցում:

Ամեն մի աշխատանքային գոտում առանձին զգեստների օգտագործում:  Միանվագ ձեռնոցներ՝ առանց տալկի:  Ֆիլտրով պիպետներ:  Միանվագ օգտագործվող լաբորոտոր ամանեղեն:  Աշխատանքային գոտում բոլոր աշխատանքային մակերեսների ախտահանում քիմիական նյութերով է ՈՒՁ-ով: Կոնտամինացիայի հաղթահարման կենսաքիմիական եղանակներից մեկը հիմնվում է N-ուրացիլ գլիկոզիլազ ֆերմենտի՝ ուրացիլ պարունակող ԴՆԹ-ի մոլեկուլները քայքայելու ունակության վրա: Կոնտամինացիայից խուսափելու նպատակով ՊՇՌ ռեակցիան կատարում են եռաֆոսֆոթիմինի փոխարեն ուրացիլ նուկլեոտիդի օգտագործմամբ: Բոլոր առաջացող շղթաները պարունակում են ուրացիլ: Եթե ռեակցիայից առաջ ռեակցիոն խառնուրդին ավելացվի N-ուրացիլ գլիկոզիլազ ֆերմենտ և կատարվի ամպլիֆիկացիա, բոլոր նոր առաջացած շղթաները կքայքայվեն, իսկ թիրախ ԴՆԹ-ն կմնա անթերի և կարող է կրկնապատկվել: Կոնտամինացիայի հաղթահարման մեկ այլ եղանակ է ռեակցիոն խառնուրդի մշակումը պսորալեն կամ իզոպսորալեն նյութերով, որոնք ակտիվացվում են ՈՒՖ ճառագայթներով և արգելակում կապված մոլեկուլների ամպլիֆիկացիան: Բայց ներկայացվող մեթոդները չեն ապահովում 100 % արդյունք, և կոնտամինացիան, շատ թույլ, բայց բացահայտվում է: Ամենահուսալի եղանակը փակ փորձանոթում ֆլուորեսցենտ ներկանյութերի միջոցով դետեկցիայի կատարումն է: Հուսալիության մակարդակի բարձրացման համար խորհուրդ է տրվում օգտագործել նաև բացասական ստուգիչներ: Սովորաբար ստացված արդյունքները ստուգվում են հետազոտման այլ եղանակներով: Այս նպատակով կատարվում է նույն նմուշների հետազոտություն իմունաֆերմենտային՝ ԻՖՈ, մանրադիտակային կամ բակտերիաների ցանքի միջոցով: 

3.18. ՊՇՌ ԼԱԲՈՐԱՏՈՐԻԱՆԵՐԻ ԿԱԶՄԸ ԵՎ ՏԱՐԱԾԱԿԱՆ

ԿԱԶՄԱԿԵՐՊՈՒՄԸ

ՊՇՌ-հետազոտությունը կարող է լինել թերի, քանի որ այն շատ ճշգրիտ է, բայց զգայուն, և տարբեր փուլերում օգտագործվող նմուշների ու օժանդակ նյութերի փոխազդեցությունը կարող է առաջացնել առանձին փուլի նորմալ ընթացք և հանգեցնել ստացված արդյունքի շեղման: Այդ պատճառով տարբեր երկրներում մշակվել են կանոններ, որոնք պետք է ապահովեն կատարվող փորձերի բացառիկ անվտանգությունը՝ մաքրությունը: Աղտոտման աղբյուր կարող են լինել լաբորատոր անոթները, պիպետները, աշխատանքային մակերեսները և նույնիսկ փորձ կատարող մասնագետի մաշկի մակերեսը: Հետազոտման աշխատանքների բացարձակ մաքրությունը պահպանելու նպատակով մշակվել են լաբորատորիաների կազմակերպման որոշակի կանոններ: Առաջին հերթին հետազոտության բոլոր փուլերը կատարվում են տարբեր լաբորատոր տարածքներում (նկ. 3.86): Տարածքը, որտեղ կատարում են նախապատրաստական աշխատանքները, ԴՆԹ-ի անջատումը պետք է լինի առանձին: Ռեակցիոն խառնուրդի պատրաստումը և ՊՇՌ-ն պետք է կատարվեն առանձին սենյակներում: Ստացված նյութի դետեկցիան նույնպես պետք է կատարել առանձին տարածքում, հնարավորինս հեռու՝ նույնիսկ շենքի այլ հարկում: Բոլոր սենյակներում պետք է լինեն 260 նմ հզորությամբ ուլտրամանուշակագույն ճառագայթման լամպեր, օրինակ՝ ԴԲ-60 տիպի, որոնց ազդեցությունը 1 մ3 վրա հավասար է 2,5 Վտ: Լամպերի դասավորությունը պետք է ապահովի բոլոր մակերեսների, անոթների, ամանեղենի և սարքերի ախտահանում: Լամպերը միացվում են մեկ ժամով՝ աշխատանքի կատարումից առաջ, ապա մեկ ժամով աշխատանքի ավարտից հետո: Աշխատողները հագնում են հատուկ ախտահանված զգեստ և ձեռնոցներ, այլ տարածք անցնելու դեպքում զգեստը փոխվում է: Բոլոր զգեստները ախտահանվում են առանձին: Աշխատանքի բոլոր փուլերը կատարում են տարբեր մասնագետներ: Բոլոր աշխատանքները կատարում են մեկանգամյա օգտագործման սարքերով և նյութերով: Նմուշները և ռեագենտները պահվում են առանձին:

I

L----~------L------------,

~

Նկ. 3.86. Ռեալ թայմ ՊՇՌ-ի լաբորատորիայի կազմակերպման օրինակ: 1 - նմուշների ընդունման և մաքրման գոտի, 2 - նմուշների նախապատրաստման և ԴՆԹ-ի անջատման գոտի, 3 - փորձի նախապատրաստման և կատարման գոտի, 4 - համատեղված արդյունքների դետեկցիայի գոտի, 5 - արդյունքների վերլուծության գոտի, 6 - նախասենյակ, 7 - ախտահանման գոտի (https://agrodiagnostica.ru/services/laboratory-installation/):

Աշխատանքների կատարման համար անհրաժեշտ սարքերի և նյութերի նվազագույն հավաքածուն բերվում է նկար 3.87-ում: Նմուշների պահպանման համար մշակված են հատուկ մեթոդներ: Օրինակ՝ ժառանգական հիվանդությունների բացահայտման համար ստացված նմուշները կարող են պահվել սառեցված վիճակում, իսկ վարակիչ հիվանդությունների ախտորոշման համար ստացված նմուշները սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում կարող են պահվել մոտ 2 ժամ, ավելի երկար՝ երկու շաբաթ պահելու դեպքում պետք է դնել սառնարան՝ 2-8 ºC պայմաններում, ավելի երկար պահելու դեպքում սառցարան՝ 20 ºC պայմաններում:

Uորt,1 ՊlԸո lաՔոriաviոrյ,ա Mոյl- 1

"IՇ/ll!flյµ~

ա~#ft,Nյյաl!l

Նկ. 3.87. Տարբեր ՊՇՌ-ների կատարման համար օգտագործվող սարքեր (https://www.google.com/search?q):

Այսպիսով՝ լաբորոտորիայի ճիշտ կազմակերպումը անհրաժեշտ պայման է ինչպես ստացված արդյունքների ճշգրտության բարձր մակարդակի ապահովման, այնպես էլ ժամանակակից տեխնոլոգիաների լիարժեք օգտագործման համար:

3.19. ՊՇՌ-ի ԿԻՐԱՌՄԱՆ ԲՆԱԳԱՎԱՌՆԵՐԸ

Վերջին տասնամյակներում ՊՇՌ-ի կիրառությամբ կատարվող հետազոտական և կիրառական աշխատանքները հաջողությամբ օգտագործվում են բազմաթիվ բնագավառներում: Ամեն տարի մշակվում են ՊՇՌ-ի նորանոր հետազոտական եղանակներ և առաջարկվում կիրառման նոր մեթոդներ ու բնագավառներ: Այսօր արդեն կիրառման բնագավառների ցանկում ընդգրկվում են գիտության և տնտեսության բազմաթիվ ոլորտներ: Դրանք են՝ 1. Առողջապահություն, սանիտարական-համաճարակային վերահսկում ա) ինֆեկցիաների ախտորոշում,

բ) իմունային պաթոլոգիաների ախտորոշում, գ) ժառանգական հիվանդություների գենետիկական հետազոտում, դ) գենետիկորեն փոփոխված սննդամթերքի բացահայտում: 2. Անասնաբուժություն և բուսաբանություն ա) ինֆեկցիոն և ժառանգական հիվանդությունների ախտորոշում, բ) առանձնյակների գենետիկական դետեկցիա՝ անձնագրավորում: 3. Գիտություն Գենետիկա, մանրէա- և վիրուսաբանություն, գենային ինժիներիա, գենոմիկա և համեմատական գենոմիկա, էվոլյուցիոն պրոցեսների հետազոտում, էպիգենետիկա և այլն: 4. Արդյունաբերություն ա) նորանոր նյութերի ստեղծում, բ) միջավայրի սանիտարական վերահսկում: 5. Դատական բժշկագիտություն ա) անձի իդենտիֆիկացիա, բ) հայրության որոշում: Ավելի մանրամասն կանդրադառնանք մի շարք կարևորագույն բնագավառների, կքննարկենք այս ուղղությամբ կատարվող հետազոտությունների և կանոնավորված աշխատանքների ցանկն ու նպատակները: 3.19.1.ՊՇՌ-ի օգտագործումը բժշկաբանական հետազոտություններում և պրակտիկայում Բժշկաբանական հետազոտություններում և պրակտիկայում ՊՇՌ-ն օգտագործվում է մի քանի նպատակային ուղղություններով. 1. Բժշկաբանական ախտորոշում: 2. Իմունագենետիկական նշադիրների բացահայտում: 3. Անհատականացված բժշկություն և ֆարմակոգենետիկական հետազոտություններ: 4. Գիտական հետազոտություններ, այդ թվում՝ գենետիկական պոլիմորֆիզմի ուսումնասիրություններ, գեների, քրոմոսոմների և գենոմների քարտեզավորում, համեմատական գենետիկական և գենո322

միկական, ֆիլոգենեզի, գենետիկական բազմազանության հետազոտումներ, գենային նշադիրների բացահայտում, սելեկցիոն աշխատանքներ նշադիրների կիրառմամբ, տեսակների, սորտերի, ցեղերի գենետիկական թեստավորում, ինչպես նաև գենոմների կազմակերպման և կազմի հետազոտություններ, էվոլյուցիոն զարգացման պրոցեսում գենոմի կազմակերպման փոփոխությունների, տարբեր տաքսոնոմիկ խմբերի գենոմների կազմակերպման հիմունքների ուսումնասիրություններ և այլն: ՊՇՌ մեթոդի առավելությունները Լաբորոտոր հետազոտություններում կիրառվող մեթոդների ախտորոշաբանական արդյունավետության ցուցանիշներից է դրանց զգայունությունը: Զգայունությունը լինում է անալիտիկ և ախտորոշական: Յուրաքանչյուր թեստ համակարգի անալիտիկ զգայունությունը որոշվում է ԴՆԹ-ի կամ ՌՆԹ-ի պատճենների նվազագույն խտությամբ 1 մլ նմուշում, որը կարող է ախտորոշվել տվյալ մեթոդով: Օրինակ՝ ՁԻԱՎ-ի ախտորոշման համար օգտագործվող թեստ համակարգերը բացահայտում են վիրուսային մասնիկների առկայությունը, եթե հատազոտվող 1 մլ նմուշում դրանց խտությունը կազմում է առնվազն 300-500 պատճեն: Թեստ համակարգի ախտորոշական զգայունությունը որոշվում է տոկոսներով և հաշվարկվում է հետազոտված ու ճշգրիտ ախտորոշված դեպքերի հարաբերակցությամբ: Լաբորատորիաներում օգտագործվող ՊՇՌ թեստ համակարգերի ախտորոշական զգայունությունը սովորաբար գերազանցում է 95-98 % ցուցանիշը: Հետազոտական մեթոդների և համակարգերի երկրորդ կարևոր ցուցանիշը դրանց յուրահատկության աստիճանն է, որը որոշվում է ճշգրիտ ախտորոշված առողջ մարդկանց թվով և հաշվարկվում է տոկոսներով: ՊՇՌ-ի վրա հիմնված թեստ համակարգերի սպեցիֆիկության աստիճանը հավասար է 99-100 %: Արտասահմանյան որոշ հետազոտական կենտրոններում կատարված համեմատական հետազոտություններում բացահայտվել է, որ

արագ թեստ համակարգերի զգայունությունը հավասար է 40-60 %, ԻՖԱ մեթոդինը՝ 50-70 %, իմունաֆլուորեսցենտ մեթոդինը՝ 55-75 %, կուլտուրայինը՝ 60-80 %, իսկ ՊՇՌ-ինը՝ 90-100 %: Այսպիսով՝ ՊՇՌ-ն այլ մեթոդների համեմատ օժտված է երկու առավելություններով՝ բարձր զգայունությամբ և արագությամբ (տևում է մոտ 4 ժամ): ՊՇՌ ախտորոշումը գնահատվում է որպես լիարժեք և օպտիմալ հետևյալ կարևոր հատկանիշների շնորհիվ. ա) ունիվերսալությունը՝ բացահայտում է բոլոր տեսակի ԴՆԹ-ները և ՌՆԹ-ները, բ) սպեցիֆիկությունը՝ ճշգրիտ է և զգայուն, գ) բոլոր հետազոտություններում օգտագործվում են ռեագենտների նույն համալիրները և նույն սարքավորումները, դ) օգտագործվում է հիվանդության կանխորոշման համար, ե) կարող է օգտագործվել մի խումբ հարուցիչների զուգահեռ բացահայտման համար, զ) անվտանգ է հետազոտողների համար՝ հետազոտվող նմուշը ենթարկվում է քայքայման և չեզոքացման: Բժշկաբանական ախտորոշում կամ գենոդիագնոստիկա: Գենոդիագնոստիկան դասվում է երեք հիմնական ուղղությունների՝ վարակիչ հիվանդությունների ախտորոշում, քաղցկեղային հիվանդությունների ախտորոշում, գենային և գենետիկական հիվանդությունների ախտորոշում: ՊՇՌ-ի եղանակով կատարվել է հարուցիչների ախտորոշում (Кай Хи, Дж.Л. Касвелл, Дж.Ф. Прескотт, 2014, A.D. Salis, 2009, Х. Да Сильвия, Минк, Крисанна М., 2012, Li D, Zhang J., Li J., 2020), ուռուցքների բացահայտում (P.A. Gerber, A.S. Antai, N.J. Neumann, et al., 2009, J. German, M.M. Sanz, S. Ciocci, et al., 2007, N.A. Grudinina, V.I. Golubkov, 0.S. Tikhomirova, et al., 2005, Б. Фогельштейн , Н. Пападопулос, В.Э. Велкулеску , Ш. Чжоу , 2013), միագենային ժառանգական անոմալիաների և սրտանոթային հիվանդությունների ախտո-

րոշում (A.N. Volkov, S.M. Khabieva, E.Yu. Smirnova, A.V. Larionov, 2018, Tong Y., Shen S., Jiang H., Chen Z., 2017): ՊՇՌ-ի մեթոդով բացահայտվում են կետային և քրոմոսոմային մուտացիաները: ԴՆԹ-ի որոշակի կետում մեկ կամ մի քանի նուկլեոտիդների փոխարինումները, կորուստը կամ ներմուծումը կոչվում է գենային մուտացիա: ԴՆԹ-ի կազմում կատարված գենային մուտացիաները առաջացնում են նույն գենի հերթականության պոլիմորֆիզմ՝ նույն պոպուլյացիայի անդամների մոտ տարբեր ժառանգական ձևերի՝ ալելների երկարատև համատեղում: Միանուկլեոտիդային պոլիմորֆիզմը (Single nucleotide polymerphism, SNP) մեկ նուկլեոտիդով տարբերվող ԴՆԹ-ների տարբեր հատվածների բազմաձևությունն է նույն տեսակի տարբեր առանձնյակների գենոմում կամ նույն անձի հոմոլոգ քրոմոսոմների կազմում: ՊՇՌ-ի նոր մեթոդները թույլ են տալիս բացահայտել նաև նման պոլիմորֆիզմները: Իմունագենետիկական նշադիրների բացահայտում: SNP-ների հետազոտման եղանակով մշակվում են մի շարք ոչ վարակիչ համակարգային հիվանդությունների նկատմամբ հակվածության բացահայտմանը և չեզոքացմանը ուղղված կանխարգելիչ գործողություններ: Հիվանդությունների այս խմբին են պատկանում քաղցկեղները և համակարգային՝ սրտանոթային, շնչառական, հորմոնալ, միզասեռական ուղիների և այլ հիվանդությունները: Ամեն տարի մահացության դեպքերի 60 %-ի (մոտ 36 մլն մարդ) պատճառը հենց այս խմբի հիվանդություններն են: Այժմ արդեն գենետիկական կլինիկական հետազոտությունների առօրյա օգտագործման համար մշակվել և լայնորեն ներդրվում են բժշկական լաբորատորիաների հետազոտական պրակտիկա և ռեագենտների տեսակները, որոնց միջոցով բացահայտվում են կետային մուտացիաներ, պոլիմորֆիզմներ բջջային պրոլիֆերացիայի սուպրեսոր գեների (FAS, FASLG, TP53, TNF, IL1B, BAT3), բջջային ցիկլը կարգավորող գեների (CCND1, CHEK2, PPARG, APC, MDM2, FGFR2, RAD5), ապատոքսիկացման գեների (CYP1A1, CYP19A2, CYP1B1,

CYP2D6, CYP3A43, ABCB1, GSTP1, NAT2, SULT1A1), ԴՆԹ-ի ռեպարացիաները կարգավորող գեների (ATM, XRCC1, XRCC3, OGG1, MLH1, MSH2, PARP1) կազմում: Նշենք, որ թվարկված գենային խմբերի ապաակտիվացումը առաջացնում է բջիջների անկանոն բաժանումներ և ուռուցքներ: Գենետիկական հետազոտությունները օգնում են բացահայտել յուրաքանչյուր անձի ժառանգական հակվածությունը այս կամ այն հիվանդության նկատմամբ և նախապես արգելակել դրա հնարավոր զարգացումները: Նշենք, որ վերջին տարիներին նման հետազոտությունները թույլ տվեցին բացահայտել, որ բազմագործոնային հիվանդությունների զարգացման հավանականությունը մեծանում է գենոմի կազմում մի քանի տարբեր SNP-ներից կազմված որոշակի խմբերի առկայության դեպքում: Կատարված հետազոտությունների արդյունքները կուտակվում են Genome-wideassociationstudy (GWAS) բազայում և թույլ են տալիս դատել այս կամ այն հնարավոր շեղումների հնարավորության մասին: Կարևոր բնագավառ է նաև պոպուլյացիաների հետազոտությունը. նույն միանուկլեոտիդային շեղումը տարբեր պոպուլյացիաներում առաջացնում է տարբեր արդյունքներ և կարող է լինել ինչպես վտանգավոր վիճակի նշադիր, այնպես էլ լիովին չեզոք: Այս ուղղությամբ կատարվող հետազոտությունները միավորված են միջազգային ծրագրի մեջ (http://www.humanvarionproject.org/): Աշխատանքների կարևորագույն ուղղությունը մարդու ՀՀԳՀ համակարգի՝ HLA-ի հետազոտություններն են: HLA (Human Leucocyte Antigens) մարդու հիստոհամատեղելիության հակածինները կոդավորող գեների համակարգն է: Հիստոհամատեղելիության գենային համալիրը բաշխված է 3 դասերի, որոնցից յուրաքանչյուրի գեները կոդավորում են իմունային համակարգի գործոնների հստակ խմբեր: ՀՀԳՀ-ի 1-ին դասի գենային լոկուսները (A, B, C) կոդավորում են օրգանիզմի գրեթե բոլոր բջիջների (բացի էրիթրոցիտներից և տրոֆո326

բլաստներից) թաղանթի վրա գտնվող և բջջի սեփական պեպտիդները ներկայացնող ռեցեպտորների պեպտիդային շղթաները: ՀՀԳՀ-ի 2-րդ դասի գեները (DP, DM, DOA, DOB, DQ, DR) կոդավորում են օտար հակածին ներկայացնող բջիջների թաղանթի վրա գտնվող СДՀՀԳՀ-ի 3-րդ դասի գեները կոդավորում են կոմպլեմենտի բաղադրիչների պեպտիդային շղթաները և արյան կազմի այլ սպիտակուցային գործոնները (Լ.Մ. Մելքոնյան, 2016): ՀՀԳՀ-ի 2-րդ դասի գեների տիպավորումը օրգանների փոխպատվաստման համար դոնորների ընտրության անհրաժեշտ պայմանն է: Բացահայտվել է նաև, որ այս գեների որոշ ալելներ նշադրում են մի շարք՝ 1-ին տիպի շաքարախտի (СД 1), ռևմատոիդների, աուտոիմուն թիրեոիդի և որոշ վարակիչ հիվանդությունների նկատմամբ հակվածության բարձր մակարդակ: Նշենք, որ ամուսնական զույգերի անպտղության դեպքերի մի մասը պայմանավորված է ՀՀԳՀ-ի 2-րդ համակարգի գեների ալելային կազմի բարձր հոմոլոգիայով: Բացահայտվել է նաև, որ ամուսինների HLA-ի ֆենոտիպում որոշ հակածինների առկայությունը առաջացնում է սպոնտան վիժումներ, հղիության ծանր գեստոզներ, պտղի զարգացման բնածին անոմալիաներ և դիմադրողականության անկում: ՀՀԳՀ-ի 1-ին դասի գեների տիպավորումը կիրառվում է աուտոիմունային հիվանդությունների ախտորոշման ժամանակ: Հայտնի է, որ HLAB27 ալելը բացահայտված է Ռեյտերի սինդրոմով և անկիլոզային սպոնդիլիտով տառապող սպիտակամորթ մարդկանց 90 %-ի գենոտիպում: Այս ռասսայի առողջ մարդկանց գենոտիպում նշված ալելը հանդիպում է 8 % հաճախականությամբ: HLAB27 ալելի հակածինը որոշում են այն դեպքերում, երբ նշված հիվանդությունների դրսևորումները ատիպիկ են, և վերջնական ախտորոշումը կարող է կատարվել միայն գենետիկական էքսպերտիզայի հիման վրա: Վարակիչ հիվանդությունների նկատմամբ տարբեր գենոտիպերով մարդկանց կայունությունը նույնպես կարող է որոշվել HLA-ի ալելների հետազոտման եղանակով: Այսպես՝ ՁԻԱՎ վիրուսի նկատմամբ կայունության հետազոտություններում բացահայտվել է, որ HLAB57

գենի հատուկ ալելի կրողների իմունային համակարգը ունակ է վարակումից հետո տասնամյակների ընթացքում պայքարել վիրուսի դեմ: Հետազոտությունների արդյունքում բացահայտվել է, որ այս ալելը կրողների ուրցագեղձում հասունանում են հատուկ տեսակի T-լիմֆոցիտներ, որոնք ունակ են ճանաչել ՁԻԱՎ վիրուսի մի քանի հակածիններ և, դրա շնորհիվ բացահայտել մուտացիաներ կրող վիրուսային մասնիկները՝ այն դեպքում, երբ այլ գենոտիպով մարդկանց իմունային համակարգը մնում է չեզոք: Այս ունակության շնորհիվ իմունային համակարգը ակտիվ պայքարում է վիրուսի մուտանտ ձևերի դեմ: 1995 թվականից սկսած տարբեր երկրների գիտնականներ կատարում են ՄԼՀՀԳՀ-ի 2-րդ դասի DR լոկուսների ալելների և օրգանիզմների աուտոիմունային հիվանդությունների նկատմամբ կայունության կամ հակվածության կապի բացահայտմանն ուղղված հետազոտություններ: Տարբեր պոպուլյացիաներում կատարված հետազոտությունների արդյունքներով DRB1*03 և DRB1*04 ալելները կարող են համարվել աուտոիմունային վիճակի նշադիրներ, քանի որ ասոցացվում են բազմաթիվ աուտոիմունային հիվանդությունների հետ: Բացի դրանցից՝ նշադիրներ կարող են համարվել նաև նույն լոկուսի *01, *08, *09 և *10 ալելները: Աուտոիմունային վիճակների առաջացման դեմ որոշակի կայունություն են ապահովում դրանց ձևավորման հավանականությունը իջեցնող DRB1*15, *07, *11, *13 ալելները: Գիտնականների տարբեր խմբեր հետազոտել են DRB1 լոկուսի տարբեր ալելներ կրող տեր-օրգանիզմների հակվածությունը և ռեզիստենտությունը մի շարք վարակիչ հիվանդությունների նկատմամբ: Մինտոնի 1997 և Թուրցի 1999 թվականի տվյալների համաձայն՝ DRB1*11(5) ալելը նշադրում է կայունություն հեպատիտ C-ի նկատմամբ, իսկ DRB1*11(5) և DR2, DR11(5) ալելները, Տիոյի (1999 թ.) և Պարկի (2003 թ.) տվյալներով, կայուն են B հեպատիտի նկատմամբ: Հակառակ պատկեր՝ հակվածություն հեպատիտ C-ի նկատմամբ, դրսևորում են DRB1*07 և DRB1*15(2) ալելներ կրողները (S. Barrett,

E. Ryan, J. Crowe, 1999, 2001, M. Wawrzynowicz-Syczewska, 2000, Fanning L.J., 2000): Տուբերկուլյոզի նկատմամբ կայունությունը կորելացվում է DRB1*13(6) ալելի հետ (А. Дубаниевич, 2000): Հակվածություն այս հիվանդության նկատմամբ դրսևորում են DR6, DRB1*07 և DRB1*15(2) ալելներ կրողները (L. Alric, M. Fort, J. Izopet, J.P. Vinel, C. Bureau, K. Sandre, J.P. Charlet, M. Beraud, M. Abbal, M. Duffaut, 2000, S. Vejbaesya, S. Songsivilai, T. Tanwandee, S. Rachaibun, R. Chantangpol, T. Dharakul, 2000): Հերպեսի վիրուսի նկատմամբ հակվածությունն ասոցացվում է DRB1*16(2) և DRB1*15(2) ալելների հետ (Дж. Азокар, О.П. Клавихо, Э.Дж. Юнис, 2003): Օրգանիզմի արդյունավետ իմունային պատասխանի առաջացման ունակությունը նշադրող ալելների բացահայտումը ժամանակակից առողջապահական գենետիկայի կարևորագույն խնդիրն է և մասնագիտական հետազոտությունների նպատակը: Անձնավորված բժշկաբանություն և բժշկաբանական ֆարմակոգենետիկա: Հաճախ դեղամիջոցների օգտագործումը տարբեր հիվանդների մոտ առաջացնում է տարատեսակ արձագանք: Դրա պատճառը օրգանիզմների՝ դեղամիջոցների նկատմամբ գենետիկորեն պայմանավորված զգայունության և մետաբոլիզմի տարբերություններն են: Օրինակ՝ լյարդի սպիտակուց ցիտոքրոմը կոդավորող գենը պոլիմորֆ բնույթի է և ներկայացված է տարբեր ակտիվություն դրսևորող ալելային ձևերով: Ցիտոքրոմի տարբեր ալելներ կրող օրգանիզմների արձագանքը որոշ դեղամիջոցների նկատմամբ նույնպես տարբեր է: Բուժումը ճիշտ կազմակերպելու համար նախապես պետք է որոշել ցիտոքրոմի ալելը, ապա պլանավորել օգտագործվող դեղամիջոցի քանակը և օգտագործման տարբերակը: Օրգանիզմի որոշակի գործոնների նախնական գենոտիպավորումը կոչվում է prospective genotypin (Golijow C.D., Mouron S.A., et al., 1999): Բժշկաբանական ֆարմակոգենետիկան ձևավորվել է որպես օրգանիզմների պոլիմորֆիզմով պայմանավորված դեղամիջոցների

տարատեսակ ազդեցության գենետիկական պատճառների հետազոտման բնագավառ: Ֆարմակո հունարեն նշանակում է դեղ, այսինքն՝ ֆարմակոգենետիկա - դեղամիջոցների գենետիկա: Ֆարմակոգենետիկան ուսումնասիրում է դեղամիջոցների ազդեցության փոփոխականության գենետիկական հիմունքները և կանխատեսում դրանց օգտագործման ազդեցությունը և անվտանգությունը (անբարենպաստ կողմնակի ազդեցությունները) հիվանդների համար: Ֆարմակոգենետիկան անձնավորված բժշկաբանության ամենահեռանկարային ուղղություններից մեկն է: Հետազոտությունների կարևորագույն թիրախներն են կենսատրանսֆորմացիայի 1-ին և 2-րդ փուլերի ֆերմենտների պոլիմորֆիզմը, գլյուկուրոնիլտրանսֆերազները՝ UGT, և այլն, դեղամիջոցների փոխադրիչները (ABCB1, SLCO1B1 և այլն), թաղանթային ռեցեպտորների և փոխադրիչ խողովակների սպիտակուցային տարրերի պոլիմորֆիզմը: Կոնկրետ գենետիկական նշադիրները ազդում են ֆարմակոթերապիայի ազդեցության և անվտանգության վրա կամ փոփոխելով դրանց աբսորբցիայի, մետաբոլիզմի և էլիմինացիայի մեխանիզմները, կամ թիրախի փոփոխման և դեղամիջոցի նկատմամբ զգայունության մակարդակի մոդիֆիկացման եղանակով: Այսպիսի գենետիկական նշադիները բացահայտում են օրգանիզմի գերզգայունությունը դեղամիջոցի նկատմամբ և կանխագուշակում շեղված ռեակցիաների ու անբարենպաստ կողմնակի ազդեցությունների 20-50 %: Ֆարմակոգենետիկական մարկերների նախնական որոշման և կլինիկական պրակտիկա ներմուծման եղանակը մեծ նշանակություն ունի հաճախակի օգտագործվող դեղամիջոցների դեպքում, երբ դրանց համատարած օգտագործումը կարող է առաջացնել զգալի ռիսկեր: Առավել կարևոր է ֆարմակոգենետիկական մարկերների կիրառումը մի շարք վարակիչ (ՁԻԱՀ, տուբերկուլյոզ) և համակարգային (սրտանոթային, քաղցկեղային, հոգեբուժական) հիվանդությունների դեմ օգտագործվող դեղամիջոցների դեպքում: Մի շարք երկրներում արդեն ստեղծվել և գործում են հատուկ պետական կազմակերպություններ (Food and Drug Administration, FDA, USFDA), որոնց խնդիրն է դեղամիջոցների և սննդամթերքի արտա330

դրության բնագավառում օրենքով սահմանված նորմերի վերահսկումը: Այս կազմակերպությունը մշակել և ներկայացրել է դեղամիջոցների ցանկ, որոնց կիրառությունը թույլատրվում է միայն յուրաքանչյուր առանձին հիվանդի գենետիկական հետազոտության արդյունքներով: Նկարագրված մոտեցումների և մեթոդների կիրառությունը նպաստում է բժշկաբանության ժամանակակից համակարգի ձևավորմանը, ըստ որի բժշկագիտությունը պետք է լինի՝ - պրոդուկտիվ՝ նախատեսող, - անհատականացված, - պրեվենտիվ, - կատարվի հիվանդի ակտիվ մասնակցությամբ: 3.19.2. ՊՇՌ-ի օգտագործումը անասնաբուժությունում Այսօր անասնաբուժական և անասնաբուծական բնագավառներում կատարվում են ԴՆԹ-ի բազմակողմանի հետազոտություններ: Դրանք ուղղված են բազմաթիվ խնդիրների լուծմանը. 1. Գյուղատնտեսական ապրանքների և սննդամթերքի մոլեկուլային վերահսկման մեթոդների ձևավորում: 2. Էպիզոոտիկական նկարագրի կազմում. այս նպատակով կատարվում է գյուղ. կենդանիների վարակիչ հիվանդություններ առաջացնող հարուցիչների բացահայտում: 3. Զարգացման վաղ փուլերում ժառանգական հիվանդությունների ախտորոշում: 4. Հիվանդությունների նկատմամբ կայունության և հակվածության գենետիկական նշադիրների բացահայտումը: 5. Տարբեր տեսակների և ցեղերի կենդանիների գենետիկական թեստավորում, կենսաբանական անձնագրերի կիրառում:

3.19.2.1. Գյուղատնտեսական ապրանքների և սննդամթերքի էպիդեմիական անվտանգությունը Գյուղատնտեսական բուսական և կենդանական ծագում ունեցող ապրանքների և սննդամթերքի էպիդեմիական անվտանգությունը որոշվում է մանրեաբանական ցուցանիշներով: Սննդամթերքի աղտոտումը մանրէներով կատարվում է վերամշակման ու տեղափոխման փուլերում, և աղտոտման աղբյուր կարող են լինել ինչպես սարքավորումները, այնպես էլ օդը, ջուրը, աշխատակազմը կամ տեխնոլոգիաներով նախատեսված բազմաթիվ նյութերը: Մյուս կողմից մանրէները կարող են ազդել արտադրվող սննդամթերքի որակի վրա և լինել վարակիչ հիվանդությունների առաջացման պատճառ: Հաշվի առնելով խնդրի կարևորությունը Առողջապահության Համաշխարհային Կազմակերպությունը (ԱՀԿ) մշակել է վնասակար աղտոտումների ցանկ և դրանց ախտորոշման պարտադիր եղանակներ: Այսպես՝ աշխարհում արտադրվող սննդամթերքի մոտ 25 % չի հասնում բնակչությանը այն պատճառով, որ վերամշակման և տեղափոխման փուլում փչանում է սալմոնելաների, շիգելաների, կլոսրիդիումների և այլ հարուցիչների ազդեցությամբ: Մանրէների և դրանց տոքսինների առկայությունը սննդամթերքում առաջացնում է մարդու երկու տեսակի վտանգավոր հիվանդություններ՝ սննդային թունավորումներ և սննդային ինֆեկցիաներ: Ինֆեկցիոն հիվանդությունների խմբին են պատկանում հիվանդությունները, որոնք առաջացվում են սննդամթերքի միջոցով փոխանցվող պաթոգեն հարուցիչներով: Դրանք չեն բազմանում սննդամթերքում, բայց մնում են կենսունակ երկար ժամանակ: Սննդային ինֆեկցիաները առաջացնում են վիրուսները, էնտերոպաթոգեն աղիքային ցուպիկները, էնտերոկոկերը, շիգելաները և այլն: Առաջացվող հիվանդությունների մեծ մասն ընդհանուր է մարդու և կենդանիների համար և կոչվում է զոոանտրոպանոզային: Նախկինում այս ինֆեկցիաների բացահայտումը կատարվում էր ընդունված բազմակողմանի հետազոտման եղանակով, որը երկարա332

տև էր, բարդ և պահանջում էր նյութական ու աշխատանքային մեծ ներդրումներ: Այժմ զոոանտրոպանոզների բացահայտման նպատակով կիրառվում է ՊՇՌ մեթոդը: Այս խմբին են դասվում սիբիրախտը, բրուցելյոզը, տուբերկուլյոզը, դաբաղը, կատաղությունը, լեպտոսպիրոզը, տրիպանոսոմոզը, էխինոկոկոզը և այլն: ՊՇՌ-ի մեթոդով կատարվող հետազոտությունները ավելի ճշգրիտ են և կարճատև: Հետազոտվում են ինչպես կենդանիներից ստացված նմուշները, այնպես էլ անասնաբուծական ապրանքները՝ կաթը, պանիրը, կաթնաշոռը և այլն: Բրուցելյոզի դեպքում հարուցիչը ախտորոշվում է ինչպես ակտիվ հիվանդության, այնպես էլ քրոնիկ փուլերում: Սննդային թունավորումներ առաջացնում են սննդամթերքում գտնվող սնկայինների կամ բակտերիաների տոքսինները: Թունավորումները վարակիչ չեն, բայց սննդամթերքում կուտակվող տոքսինները կարող են միանգամից վնասել սննդամթերքը օգտագործող մեծ քանակով մարդկանց: Տոքսինների բացահայտման համար օգտագործվում են հետազոտման հիբրիդաբանական եղանակները: 3.19.2.2. Էպիզոոտիկական նկարագրի կազմում և վարակիչ հիվանդությունների ախտորոշում Էպիզոոտիկական նկարագիր կազմելու նպատակով անհրաժեշտ է բացահայտել գյուղ. կենդանիների վարակիչ հիվանդություններ առաջացնող բոլոր հարուցիչներին: Սննդային ինֆեկցիաների և կենդանիների ինֆեկցիոն հիվանդությունների բացահայտման և վաղաժամ հաղթահարման նպատակով բոլոր տնտեսություններում կատարվում են մանրէաբանական հետազոտություններ: բոլոր երկրներում, հաշվի առնելով տեղական ինֆեկցիաների ցանկը, կատարում են պատվաստումներ հաճախ հանդիպող հարուցիչների տարածումը կանխարգելելու նպատակով և հետազոտում ինֆեկցիոն գործոնների առկայությունը հոտերում ու պոպուլյացիաներում: Այժմ նման հետազոտությունները կատարվում են

ժամանակակից միկրոչիպային տեխնոլոգիայի կիրառությամբ, որն ապահովում է կարճ ժամկետներում և բարձր ճշգրտությամբ հետազոտությունների մեծ ծավալների իրականացում: Այս եղանակով կազմվում է երկրի կամ դրա շրջանների Էպիզոոտիկ նկարագիրը: Հայտնի են գյուղատնտեսական կենդանիների բազմաթիվ վարակիչ հիվանդություններ, որոնք տարբերվում են ինչպես դրսևորման եղանակով՝ սուր, լատենտ, քրոնիկ, այնպես էլ հանդիպման հաճախականությամբ՝ հազվադեպ կամ էպիզոոտիաներ: Դրանց ախտորոշման մեթոդները պայմանավորված են տարբեր գործոններով և երկար տարիներ եղել են բավականաչափ մասնագիտացված, այսինքն՝ կատարվել են յուրաքանչյուր հարուցչի անհատական հատկանիշների բազմակողմանի հետազոտման միջոցով: Վերջին տասնամյակներում կիրառվող իմունաախտորոշման մեթոդները ավելի արագընթաց են, հիմնվում են հակածին-հակամարմին յուրահատուկ ռեակցիայի վրա, այսինքն՝ կատարվում հարուցիչյուրահատուկ մոլեկուլների բացահայտման եղանակով: Մեթոդը չի պահանջում մեծ, բազմակողմանի լաբորատոր համալիրներ և բարձրակարգ մասնագետների առկայություն, կարող է իրականացվել նույնիսկ դաշտային պայմաններում: Բայց միշտ չէ, որ բավարար արդյունավետ է և զգայուն: Նշված թերությունները հաղթահարվում են հետազոտվող հարուցչի վիրուլենտությունը պայմանավորող ԴՆԹ-ի հերթականությունների բացահայտման մեթոդների կիրառությամբ: Այսօր արդեն մշակվել և կիրառավում են անասնաբուժությունում ՊՇՌ-ի մեթոդի վրա հիմնված թեստ-համակարգեր տուբերկուլյոզի, սիբիրախտի, լեյկոզի, ԽԵԿ-երի ժանտախտի, բրուցելյոզի, լիստերիոզի, կատաղության, դաբաղի, կենդանիների խլամիդիոզի, կամպիլոբակտերիոզի, խոզերի դասական ժանտախտի, խոզերի ռեսպիրատոր-ռեպրոդուկտիվ սինդրոմի, խոզերի պարվովիրուսային ինֆեկցիայի, ստաֆիլոկոկոզի, միկոպլազմոզի և կենդանիների այլ բազմաթիվ հիվանդությունների բացահայտման համար: ՊՇՌ մեթոդի կիրառությունը արդյունավետ է ինչպես բակտերիաներով, այնպես էլ միկոբակտերիաներով, մանրէներով և վիրուսնե334

րով առաջացվող հիվանդությունների ախտորոշման և հարուցիչների իդենտիֆիկացիայի համար: Օրինակ՝ ԽԵԿ-երի ինֆեկցիոն ռինոտրախեիտը առաջացնում է ԽԵԿ-երի 1-ին կարգի հերպես վիրուսը: Այս հարուցչի ազդեցությամբ բորբոքային պրոցեսները տարածվում են շնչառական և սեռական ուղիներում, զարգանում են մաստիտներ, կոնյուկտիվիտներ, մենինգոէնցեֆալիտներ, գրգռվում են վիժումներ, առանձին դեպքերում հիվանդության արդյունքում ձևավորվում են արտրիտներ, փորլուծություն, զարգանում է հորթերի համալիրային ինֆեկցիա: Նշենք, որ այս վիրուսը փոխանցվում է սերունդներին երկու ծնողներից և ունի շատ երկար լատենտ շրջան: Այս վիրուսային ինֆեկցիան առաջացնում է ԽԵԿ-երի ամենատարծված վիրուսային հիվանդությունը: Այժմ արհեստական սերմնավորման համար նախապատրաստված սերմը հետազոտվում է հերպես վիրուսի բացահայտման նպատակով, քանի որ վարակման այս աղբյուրը, լինելով լայն օգտագործվող, կարող է դառնալ էպիզոոտիայի պատճառ: ՊՇՌ-ի կիրառությամբ բացահայտվում է նաև ԽԵԿ-երի սուր վարակիչ ինֆեկցիոն լեյկոզը (ԽԵԿՎԼ): Հիվանդության հարուցիչը Deltaretrovirus ցեղի Retroviridae ընտանիքի ներկայացուցիչ է: Նույն ցեղի վիրուսները առաջացնում են մարդու T-բջջային 1-ին, 2-րդ կարգի լեյկոզները և կապիկների T-բջջային լեյկոզը: Հիվանդությունը կապված է B լիմֆոցիտների քաղցկեղային բնափոխման հետ, որի արդյունքում փայծախում, լիմֆոտիկ հանգույցներում, լորձաթաղանթում առաջանում են լիմֆոցիտների սեղմ կազմված համալիրներ: Դրանք մշտական բորբոքումների օջախներ են և քայքայիչ, հաճախ մահացու ազդեցություն են գործում ներքին օրգանների վրա: Հիվանդության բուժման արդյունավետ եղանակները դեռ չեն ստեղծվել և պայքարի միակ միջոցը հիվանդ կենդանիների խոտանումն է: Հիվանդությունը տարածվում է շփման միջոցով, հորթերը վարակվում են հիվանդ կովերի կաթով կամ վարակված մայրերից (4-8 % հաճախականությամբ): Լինելով սուր վարակիչ՝ հիվանդությունը լայնորեն տարածվում է առանձին հոտերում և դառ335

նում ծանր տնտեսական կորուստների պատճառ, որոշ դեպքերում խոտանվում է հոտի ամբողջ գլխաքանակը: Քանի որ հիվանդությունը բնութագրվում է երկար լատենտ շրջանով՝ 4-5 տարի, իսկ վարակված հորթերի մոտ դրսևորվում է միայն 2 տարեկանից, վիրուսը կրող և վարակման աղբյուր հանդիսացող կենդանիների վաղաժամ ախտորոշումը և մեկուսացումը կարող է զգալիորեն սահմանափակել վարակի տարածումը և տնտեսական մեծ նշանակություն ունենալ: Ռետրովիրուսային գենոմը ներմուծվում է տեր բջիջների գենոմի կազմ որպես պրովիրուս, որը կարող է բացահայտվել վարակման վաղ փուլերում: Վիրուսային մասնիկի քաղցկեղային հատկանիշները կարող են պայմանավորված լինել դրանց գենոմի կազմի կարգավորիչ (Tax և Rex) տարրերով: Կենդանիների գենոմում ԽԵԿՎԼ-ների պրովիրուսային մասնիկների բացահայտման համար կիրառվում է մուլտիպլեքսային ՊՇՌ: Կատարված նախնական հետազոտությունները թույլ են տալիս պրովիրուսների կազմում ընտրել այն հատվածները, որոնց առկայությունը կենդանու գենոմում բարձր ճշգրտությամբ ախտորոշում է վարակման փաստը: Դրանց թվում են նկար 3.88-ում պատկերված սև քառակուսիներով նշված հատվածները: PնLPCR

ԷNՄI..

PCR .ԷNՄ PCR

LTRPCR

I

I

5'Ll,,.'----;9;;t9; ---~---=:;----;;;րol;,---'---~,;;;.;.- ~ P12,f;, j I \ jRu ~ P30

R

լ3"P13 Tu

Նկ. 3.88. ԽԵԿԼՎ-ի ախտորոշման համար ընտրված պրովիրուսի գենոմի շրջանները (https://elibrary.ru/item.asp?id=25443422):

Այդ հատվածների հերթականություններին կոպլեմենտար պրայմերների և պրովիրուսի տեսակի ճշտման համար կիրառվող զոնդերի միջոցով կատարվում է հիվանդության ֆենոտիպային դրսևորում չունեցող վարակված կենդանիների ախտորոշումը:

Շների և կատուների ինֆեկցիաները դասակարգվում են մի քանի խմբերի՝ համալիրային, արյան հարուցիչների, օֆթալմոբանական, ռեսպիրատոր, դերմատոֆիզական, սեռական, ստամոքսաաղիքային և այլն: Անասնաբուժական պրակտիկայում ՊՇՌ-ն լայնորեն օգտագործվում է համալիրային և ծածկային հյուսվածքների ինֆեկցիաների՝ աչքի, սեռական օրգանների, ռեսպիրատոր հիվանդություններ առաջացնող հարուցիչների ախտորոշման համար: 3.19.2.3. Ժառանգական հիվանդությունների ախտորոշում կենդանիների զարգացման վաղ փուլերում Կենդանիների մահացու կամ կիսամահացու ժառանգական հիվանդությունների ախտորոշումը անասնաբուժության և անասնաբուծության կարևորագույն խնդիրներից մեկն է, որի լուծումը թույլ է տալիս բացահայտել ժառանգական փոփոխությունները կենդանու զարգացման վաղ փուլում և չեզոքացնել վտանգավոր գործոնի ազդեցությունը ամբողջ հոտի կամ ցեղի գենոտիպի վրա: Ժառանգական հիվանդությունների տարածումը պոպուլյացիաներում առաջացնում է ցեղերի կենսունակության անկում, ազդում մթերատվության և պտղատվության մակարդակի վրա: Ախտորոշումը կատարվում է կասկած հարուցող կենդանիների գենոմում մուտանտ ալելների բացահայտման եղանակով: Կիրառվում են ՊՇՌ մեթոդներ կամ միկրոչիպային տեխնոլոգիաներ: Այս ուղղությամբ կատարվող աշխատանքները ծավալուն չեն, բայց արդեն մշակվել են ողնաշարի անոմալիաների համալիրի (CVM) և իմունոդիֆիցիտի (BLAD) գենոախտորոշման մեթոդներ (Т.И. Епишко, О.П. Курак, Р.И. Шейко, И.С. Петрушко и др., 2006, А.Н. Попов, Н.А. Зиновьева, В.А. Полежаева, В.М. Игнатьев, Г. Брем, 2000):

3.19.2.4. Հիվանդությունների նկատմամբ կայունության և հակվածության գենետիկական նշադիրների բացահայտումը Գենետիկական նշադիրների բացահայտումը կատարվում է ալելյուրահատուկ ՊՇՌ-ի եղանակով: Հետազոտությունները թույլ են տալիս բացահայտել տարբեր գեների ալելային տարբերակների ազդեցությունը հիվանդությունների նկատմամբ օրգանիզմների կայունության կամ ընկալունակության վրա: Հավերի Մարեկի հիվանդության նկատմամբ կայունությունն ասոցացվում է В21 ալելի հետ: Սպիտակ լեգհորն ցեղի В5В5 գենոտիպով թռչունների մոտ Ռաուսի սարկոմայի ժամանակ բացահայտվել է մետաստազների բարձր հաճախականություն՝ 66 %: Իսկ В*В2, В^9 հետերոզիգոտներն ավելի կայուն են սալմոնելի նկատմամբ, քան В1/В1 հոմոզիգոտները: Գրականության մեջ ներկայացված են տվյալներ տարբեր վիրուսային ենթախմբերի նկատմամբ կայունության ժառանգման առանձնահատկությունների վերաբերյալ: Մկների մոտ ռեզիստենտությունը գրիպի վիրուսի նկատմամբ նույնպես կարգավորվում է աուտոսոմային դոմինանտ գենի ազդեցությամբ՝ Н-2В, իսկ մկների հեպատիտի վիրուսի նկատմամբ` ռեցեսիվ գենով: Լաբորատոր կենդանիների հետազոտությունների ժամանակ բացահայտվել են նաև մի քանի այլ դեպքեր, որոնցում ռեզիստենտությունը կոդավորվում է մեկ գենի ազդեցությամբ: Սակայն ռեզիստենտությունը ուռուցքների առաջացման նկատմամբ դրսևորվում է համալիրային ձևով և վիրուսների տարբեր խմբերի դեպքում քիչ է տարատեսակվում: SLA համակարգի որոշ ալելների հոմոզիգոտ գենոտիպերն ասոցացվում են բարձր մահացության հետ: Աղիքային ցուպիկի որոշ շտամեր առաջացնում են նորածին խոճկորների լուծ: Բայց խոճկորների մի մասը ռեզիստենտ է K-88 հակածին կրող շտամերի նկատմամբ: Կայունությունը պայմանավորված է լիմֆոցիտների վրա K-88 հակածինը ճանաչող ռեցեպտորների առկայությամբ: Ռեցեպտորների առկայությունը ժառանգվում է

որպես հասարակ աուտոսոմային հատկանիշ: Այն կենդանիները, որոնք ունեն այս ռեցեպտորը, կայուն են, նրանք որոնց մայրերն ունեն նման ռեցեպտոր, կայուն են ինֆեկցիայի նկատմամբ այնքան ժամանակ, քանի դեռ մոր կաթի հետ հակամարմիններ են ստանում K-88 հակածնի դեմ: Գրականությունում ներկայացված են տվյալներ այն մասին, որ ոչխարների ռեզիստենտությունը գեմոնհոզի նկատմամբ ժառանգվում է որպես հասարակ դոմինանտ հատկանիշ: Ջերսեյ ցեղի W1 և W3 ալելներ կրողների մոտ բացահայտվել է լեյկոզի նկատմամբ կայունություն: Նորվեգական ցեղերում W2 ալել կրողները կայուն են մաստիտի նկատմամբ: Ամերիկյան հոլշտին ցեղի կովերի մոտ կայունությունը մաստիտի նկատմամբ ասոցացվում է 1-ին դասի А11, А12 և А19 ալելների հետ (Weigel, et al., 2006): Հակվածություն բակտերիալ ինֆեկցիաների նկատմամբ առաջացնում են А10 (w50) և А31 ալելները: Ցուլերի հետևի վերջույթների պարեզի համար պատասխանատու է BoLA 1-ին դասի А2 ալելը, կովերի անպտղության համար՝ BoLA 1-ին դասի А8 ալելը: Սիմենտալ ցեղի կովերի մոտ հետազոտվել են տուբերկուլյոզի նկատմամբ կայունության և հակվածության հետ ասոցացվող BoLA համակարգի ալելները: Պարզվել է, որ առողջ կենդանիների խմբում բարձր է А1, А4, А2 ալել կրողների խտությունը, հիվանդ կենդանիներին բնորոշ են А7, А10, А8, А11 ալելները: Խոշոր եղջերավոր կենդանիների այշիրյան և սևաբղետ ցեղերի հոտերում կատարված հետազոտությունների ժամանակ բացահայտվել է, որ BoLA-DRB3.2*3, *10 *18 *24 ալելներն ասոցացվում են լեյկոզի նկատմամբ ընկալունակության հետ, իսկ BoLA-DRB3.2*2 և *7 ալելները՝ կայունության հետ (Удина и др., 2003): DQ 1А հապլոտիպ կրողներն ավելի կայուն են մաստիտի նկատմամբ: DQIA հապլոտիպը և արյան խմբի M ալելը ասոցացվում են մաստիտի նկատմամբ հակվածության հետ: Ապացուցված է BoLA համակարգի 2-րդ դասի DQ1 լոկուսի կապը մաստիտի նկատմամբ կայունության հետ: Պարսկական հոլշտին ցեղի մոտ բացահայտվել է BoLA համակարգի 2-րդ դասի

BoLA-DRB 3.2* 11 և *23 ալելների կապը մաստիտի և լեյկեմիայի նկատմամբ կայունության հետ: Խոզերի SLA համակարգի ուսումնասիրությունները ապացուցեցին որոշ ալելներով հոմոզիգոտ կենդանիների անկենսունակությունը: Հիվանդությունների նկատմամբ գենետիկական կայունության և հակվածության նշադիրների բացահայտման ուղղությամբ կատարվող հետազոտությունները շարունակվում են: 3.19.2.5. Գենետիկական թեստավորում, կենսաբանական անձնագրեր 1. Գյուղատնտեսական կենդանիների գենոմների ուսումնասիրություն օգտակար տնտեսական հատկանիշների բացահայտման նպատակով Վերջին տասնամյակներում ընտանի կենդանիների հետազոտությունների կենտրոնում է տնտեսապես օգտական հատկանիշներ կոդավորող ԴՆԹ-նշադիրների բացահայտումը և սելեկցիոն նպատակով դրանց օգտագործման մեթոդների մշակումը: Սովորաբար հետազոտություններում մեծ տեղ են գրավում կապպա կազեինի (CSN3), պրոլակտինի (bPRL), աճի հորմոնի (bGH), սոմատոտրոպինի (GH), դիացիլգլիցերոլ-Օ-ացետիլտրանսֆերազ 1-ի (DGAT1), թերեոգլոբուլինի (TG5) և լեպտինի (LEP) գեների տարբեր ալելների բացահայտումը և կաթնատվության ցուցանիշների վրա դրանց ազդեցության չափի որոշումը: CSN3 գենը կապված է կաթի սպիտակուցային կազմի և տեխնոլոգիական հատկանիշների հետ, կաթնասունների bPRL-ն կարգավորում է կաթնագեղձերի զարգացումը և կաթի արտադրության գրգռումն ու արտադրությունը, bGH գենը կարգավորում է կենդանիների աճը և կաթի արտադրությունը կարգավորող գենի գործունեությունը: DGAT1 գենի նյութը միկրոսոմալ էնզիմ է, որը կարգավորում է եռագլիցիդների սինթեզի վերջին փուլը: Բազմաթիվ հեղինակների (Dybus, et al., 2005, Tatsuda, et al., 2008, Л.А. Калашникова и др., 2009, Pannier, et al., 2010, Bonfattietal,

2011, О.В. Костюнина и др., 2011, Ю. Юльметьева и др., 2013) տվյալներով ԴՆԹ նշադիրների տարբեր ալելներ դրսևորում են կապ ԽԵԿ-երի այնպիսի հատկանիշների հետ, ինչպիսիք են աճը և զարգացումը, կաթնային և մսային արտադրողականությունը, մսի և կաթի որակական և քանակական կազմը, կովերի պտղատվությունը: Հայտնի է, որ փոփոխվող արտաքին միջավայրում գեների մուտացիաները ապահովում են պոպուլյացիաների գենետիկական ճկունության և հարմարվողականության բարձր մակարդակ: Պոպուլյացիաների նորացումը կատարվում է բարենպաստ մուտացիաներ կրող առանձնյակների շնորհիվ: Բնական պայմաններում նոր առաջացած մուտացիան անցնում է այլ ընտանիքների կազմ, տարածվում: Այսպիսի տարածման օրինակ են CVM-ի և BLAD գեների մուտանտ ալելները: Հոլշտին ցեղում այս ալելները լայնորեն տարածվել են և փոխանցվել նաև այլ ցեղերի, քանի որ ժառանգվում են ցեղին բնորոշ բարձր կաթնատվության ցուցանիշների հետ: Արհեստական սերմնավորման արդյունքում ստացվող մեծածավալ սերնդի զգալի մասը մուտանտ ալելի կրողներ են: Երկու հետերոզիգոտից ստացվող սերնդի 25 %-ը ունի մուտանտ ալելով հոմոզիգոտ գենոտիպ և անկենսունակ է: Հետերոզիգոտները կրում են մուտանտ ալելը և փոխանցում սերնդին: Հոլշտին ցեղի օգտագործմամբ կաթնատվության մակարդակի բարձրացմանն ուղղված նպատակային սելեկցիան նպաստել է ստեղծվող ցեղերի գենոտիպերում մի շարք վնասակար մուտանտ ալելների կուտակմանը: Դրանցից են ծնոտների անհավասար զարգացման կամ բուլդոգության մուտացիան (BD), լեյկոցիտային ադհեզիայի դիֆիցիտի մուտացիան (BL), ողնաշարի անոմալիաների համալիրի մուտացիան (CVM), գաճաճության մուտացիան (Df), շատ բարակ մաշկի մուտացիան (IS), սինդակտիլիայի մուտացիան (MF), ատամների կարիեսի մուտացիան (PТ), հղիության ժամկետի երկարացման մուտացիան (PG): Հոմոզիգոտ մուտանտ սերնդի առաջացումը բացառելու նպատակով կենդանիների անձնագրերում նշվում են դրանց մուտանտ ալելները, որոնք պետք է հաշվի առնվեն նպատակային զուգավորումների պլանավորման ժամանակ:

Այս եղանակով անասնաբուծության և անասնաբուժության ժամանակակից մեթոդները նախատեսում են կենդանիների ԴՆԹ-ի դետեկցիա և դրանց ծագումնաբանական վերլուծություն: Այս խնդիրների լուծման համար մշակվում են ՊՇՌ թեստավորման մեթոդներ, ստեղծվում հատուկ պրայմերներ, միկրոչիպային թեստեր: 2. Կենսաբանական անձնագրերի կիրառում Անցյալ դարի 60-70-ական թվականներից սկսած կենդանիների ծագումնաբանական հետազոտությունները կատարվում էին իմունաբանական մեթոդներով՝ արյան խմբերի և բազմաձև սպիտակուցների ալելների որոշման եղանակով: Ընտանեկան վերլուծության եղանակը թույլ է տալիս բացահայտել հայր-մայր-զավակ խմբում ծնողների ալելները սերնդի գենոտիպում և դրանց առկայության դեպքում հաստատել կամ մերժել տնտեսական նշումները: Յուրաքանչյուր ծնողի արյան տարբեր խմբերի ալելների առկայությունը սերնդի գենոտիպում ապացուցում է ընտանեկան կապի առկայությունը: Ծնողների ալելների բացակայությունը գենոտիպում մերժում է բարեկամական կապը: Իմունաբանական մեթոդը, լինելով ճշգրիտ, չէր կարող լիովին բավարարել ծագումնաբանական ճշգրտությանը ներկայացվող պահանջները, քանի որ կոնսոլիդացված ցեղերում ձևավորվում է գենետիկական հոմոգենության բարձր մակարդակ, և պոլիմորֆիզմի աստիճանը ավելի նվազ է, քան պետք է միանշանակ արդյունք ստանալու համար: Այժմ նշված խնդիրների լուծման նպատակով կատարում են տարբեր տեսակների և ցեղերի կենդանիների գենետիկական թեստավորում և կիրառում են գենետիկական անձնագրեր: Կաթնասունների ծագման ճշգրտման ամենավստահելի և հարմար մեթոդը ԴՆԹ միկրոսատելիտային հերթականությունների թեստավորումն է: Միկրոսատելիտները գենոմի տանդեմային ձևով կրկնվող 1-6 զ.ն-ից կազմված հերթականություններ են: Կրկնողությունների քանակը տանդեմի կազմում որոշ դեպքերում հասնում է մինչև 60 և առաջացնում բավականին երկար հատվածներ: Վերջին տարիներին

C' ր:::i

:::l Շ

Աղյուսակ 3.6 STR լոկուսների հետազոտման համար օգտագործվող պատրաստի լուծույթների ցանկ 91ոկոնոj

0,5ծ7

8M1Ց2կ

I

0,ծ97

8M2113 0,ծ20

ETH10 0,ծ29

ETH225 0,կ70

ETH3 0,721

INRՃ023 0,կ7Ց

ՏԲՏ115 0,ծ1ծ

TGLՃ1 22 0,500

TGLՃ1 2ծ

0,7ծ3

TGLՃ227 0,ՑկՑ

TGLՃ53

0,9901 0,9997 0,9999

51ոկոնո[

1ոկոնո[

Որպես հետազոտության օբյեկտ ընտրվել են աղյուսակ 3.6-ում ներկայացված ԽԵԿ-երի STR-ների 11 լոկուսները: STR լոկուսներով

eր

միկրոսատելիտները օգտագործվում են որպես ԴՆԹ նշադիրներ: ԽԵԿ-երի գենոմում, INRA-ի տվյալների համաձայն, արդեն բացահայտվել են 2000-ից ավելի սատելիտային լոկուսներ: Միկրոսատելիտները բազմաթիվ են, դրսևորում են բարձ պոլիմորֆիզմ, լայնորեն տարածված են գենոմներում և Գենետիկների միջազգային կազմակերպությունը (ISAG) 1996 թ. առաջարկել է օգտագործել դրանք մարդկանց և կենդանիների ԴՆԹ դետեկցիայի համար: Միկրոսատելիտները օգտագործվում են որպես մի շարք տնտեսական բարենպաստ գեների նշադիրներ: Միկրոսատելիտային կրկնվող լոկուսների ընդհանուր անվանումը STR (Short Tandem Repeats) հապավումն է: Թեստավորումը կատարվում է միկրոսատելիտային լոկուսների ալելների բացահայտման միջոցով և ապահովում է արդյունքների 99,999 %-անոց հավաստելիություն: Հետազոտության համար օգտագործվում են Applied Biosystems տիպի ՊՇՌ սարքավորումները: Բոլոր լաբորատորիաներում կատարված հետազոտությունները նույն սարքավորումների օգտագործման շնորհիվ կարող են համադրվել և գնահատվել առանց լրացուցիչ վերաստուգումների: Նույն ֆիրման առաջարկում է STR-ների 11 լոկուսների բացահայտման համար պատրաստված ստանդարտ ռեակցիոն խառնուրդներ: Սակայն այժմ նման խառնուրդներ առաջարկում են նաև այլ լաբորատորիաներ, այդ թվում՝ Բելոռուսական գյուղատնտեսական համալսարանի հետազոտական լաբորատորիան:

-:::iր ՊՇյ

կատարվող ծագումնաբանական հետազոտությունների P արդյունավետության բարձրագույն ցուցանիշները ստացվում են TGLA53 (0,848), իսկ ամենանվազը՝ ETH3 (0,470) լոկուսի դեպքում: Պրայմերների ընտրությունը կատարվում է այնպես, որ դրանք հեշտությամբ կապվեն ԴՆԹ-ի շղթաներին և ունենան գրեթե հավասար վառոցքի ջերմաստիճաններ: Օգտագործվող պրայմերների կազմը տարբեր լոկուսների համար ներկայացվում է աղյուսակ 3.7-ում: Աղյուսակ 3.7 STR 13 լոկուսների պրայմերների նուկլեոտիդային հերթականությունների և վառոցքի ջերմաստիճանի ցանկը lոliոu 8M182կ F 8M182կR 8M2113 F 8M2113 R C55M036 F C55M036R ԷTHI0F ԷTHI0 R ԷTH225 F ԷTH225 R ԷTH3F ԷTH3R HԷLIF HԷLi R

INRA023 F

INRA023 R

5P5I 15 F 5P5I I5 R

TՇLA122F

'llաո:il:::iոհ liաո:iո (5' -->3') gagԸaaggtgtttttԸԸaatԸ ԸattԸtԸԸaaԸtgԸttԸԸttg gԸtgԸԸttԸtaԸԸaaataԸԸԸ ԸttԸԸtgagagaagԸaaԸaԸԸ aagaagtaԸtggttgԸԸaatԸgtg ggataaԸtԸaaԸԸaԸaԸgtԸtԸtg gtt.ԸaggaԸtggԸԸԸtgԸtaaԸa ԸԸtԸԸagԸԸԸaԸtttԸtԸttԸtԸ gatԸaԸԸttgԸԸaԸtatttԸԸt aԸateaԸa2ԸԸa2ԸtgԸtaԸt gaaԸԸtgԸԸtԸtԸԸtgԸattgg aԸtԸtgԸԸtgtg_gԸԸaa~agg aggԸtaԸagtԸԸatgggatt eaaԸa,2ԸtatttaaԸaa_gga gagtagagԸtaԸaagataaaԸttԸ taaԸtaԸaegetgttagatgaaԸtԸ aaagtgaԸaԸaaԸagԸttԸtԸԸag aaԸeagtgtԸԸtagt.ttggԸtet11 ԸԸԸtԸԸtԸԸaggtaaatԸagԸ

TՇLA122 R

aatԸaԸatg2ԸaaataagtaԸataԸ

TՇLA126F

TՇLA126R

TՇLA227F

TՇLA227R

TՇLA53 F

TՇLA53R

ԸtaatttagaatgagagaggԸttԸt tt11gtԸtԸtattԸtԸtgaatattԸԸ Ըgaa.ttԸԸaaatԸtgttaatttgԸt aԸa11.aԸa11.aaaԸtԸaatgaaagԸa gԸtttԸagaaatagtttgԸattԸa atԸttԸaԸatiշatattaԸagԸaga

Llաոո11ոհ ol:::iոli."C

70,5

70,9

Ստացված արդյունքների դետեկցիան կատարվում է դոնդողային էլեկտրաֆորեզի եղանակով կամ բազմագույն ֆլուորեսցենտ նշադիրների օգտագործման միջոցով: Մեթոդի կիրառությունը թույլ է տալիս վերլուծել կենդանիների ծագումը, որոշել դրանց գենոտիպերը և ծագման տվյալների համաձայն կատարել գնահատում: Ավելին, այս մեթոդով որոշված գենոտիպերը կարող են օգտագործվել ցեղերի, ընտանիքների և տեսակների բարեկամական կապերի և ծագումնաբանական հետազոտությունների բնագավառում: Տեսակների, ցեղերի, ենթացեղային խմբերի և պոպուլյացիաների միատարրության որոշման և ծագումնաբանական հետազոտություններում օգտագործվում են միջմիկրոսատելիտային հերթականությունների՝ ISSR (inter simple sequence repeats) խտության և լոկալիզացման պատկերների համեմատական հետազոտությունը: Հետազոտության արդյունքները թույլ են տալիս ձևավորել ISSR-ների յուրահատուկ բնութագրեր ընտանի կենդանիների տարբեր ցեղերի, ցեղատեսակների, առանձին պոպուլյացիաների համար, որոշել դրանց առաջացման և ձևավորման պրոցեսներին մասնակցող տարրերը: Հետազոտությունների արդյունքում ստացված տվյալները թույլ են տալիս եզրակացնել, որ ISSR-PCR տարբեր նշադրերի օգտագործմամբ բացահայտվում են տարբեր միկրոսատելիտային հատվածները սահմանող ինվերտավորված հերթականությունները, որոնց առկայությամբ որոշվում են ԴՆԹ-ի ֆրագմենտների տեսակայուրահատուկ համալիրները: Մեթոդը թույլ է տալիս որոշել հետազոտվող ԴՆԹ կրող առանձնյակների տեսակային և ցեղային պատկանելությունը: Հետազոտությունները կատարվել են ԽԵԿ-երի, ոչխարների և ձիերի տարբեր ցեղերի կենդանիների ԴՆԹ-ների նմուշներով:

3.19.3. ՊՇՌ-ն բուսաբուծությունում Բույսերի վիրուսային ինֆեկցիաները առաջացնում են ինչպես բերքի ծավալի, այնպես էլ որակի զգալի կորուստներ՝ դառնալով մթերային անվտանգության լուրջ խնդիր: Վտանգավոր վիճակը նկատվում է ինչպես սննդամթերքի, այնպես էլ կերային և տեխնիկական բույսերի արտադրության բնագավառներում աշխարհի բոլոր երկրներում և մայրցամաքներում: Առավել կարևոր է այն վեգետատիվ եղանակով բազմացող բույսերի համար, քանի որ սերունդների շարքում ինֆեկցիոն գործոնների կուտակումը առաջացնում է լավագույն սորտերի անկում: Այսօր վիրուսազուրկ սորտերի ստեղծման հիմքում ընկած է վարակված բույսերի խոտանման և առողջ բույսերի բազմացման սկզբունքը: Լայն վարակված տեսակների և սորտերի դեպքում վարակի հաղթահարման համար օգտագործվում են ջերմային մշակման և մերիստեմների բազմացման մեթոդներ: Մեծ դեր է հատկացվում կարանտինային բազմացման մեթոդներին: Կատարվող աշխատանքների արդյունավետությունը երկար ժամանակ գնահատվել է սեռոլոգիական մեթոդներով, որոնք անվանվում են նաև «կաթիլային մեթոդներ»: Բայց Ժամանակի ընթացքում պարզվել է, որ այս մեթոդի ճշգրտության մակարդակը և բացահայտվող շտամերի ցանկը չեն բավարարում փորձանոթներում աճեցվող բույսերի ճշգրիտ ախտորոշման պահանջներին: Այժմ արդեն մշակվել են ՊՇՌ-ում օգտագործվող ախտորոշման ռեակցիոն խառնուրդներ, որոնք թույլ են տալիս բացահայտել բանջարային մշակաբույսերի՝ լոլիկի և վարունգի տարածված հարուցիչները: Այս մեթոդով հնարավոր է կարճ՝ մի քանի ժամ տևող հետազոտության արդյունքում ստանալ վստահելի տվյալներ, որոնք թույլ են տալիս ճշգրիտ ընտրել աճեցվող սերմնանյութը: Ավելին, նոր մեթոդները կարող են անհրաժեշտ քիմիական նյութերի կազմի և քանակի լիարժեք ընտրությամբ ապահովել աճեցման լավագույն պայմաններ:

3.19.3.1. Գենետիկորեն փոփոխված սննդամթերքը: ԳՄՕ-ների բացահայտումը սննդամթերքում Գենետիկորեն մոդիֆիկացված է կոչվում այն օրգանիզմը, որի գենոմ է ներմուծվել այլ օրգանիզմի գեն կամ գեների խումբ: Այսօր ԳՄՕ-ները դասակարգվում են հետևյալ եղանակով. QՄO-Շյերlt1 ն,ենակՇյերlնl QեՇյեն,ոկորlեՇյ Liոt1ո~ոկացL[ աO oո1նեո QUԲ Ltորiար.նաՇյ երtաՇյակոL[ L. հան,կաՇյt12Շյերl t1 րագնագաՇյոiթյանր անեՇյանեծ tնոնրՇյ t:

QեՇյեն,ոկորiեՇյ նոt1ո~ոկա ցL[ած 1.iեՇյոաՇյհ Շյեո ԳՄ'-1 UյU0րl արlt1եՇյ UUlերtծL[ած ենյ UայրlակաՇյ կար l,. որiոշ րոԸtո1 Շյյոtjթերl արlUlաtlրlոl'l կոl[երl, այ0երl, հ.նl[երl l,. այl ն,ենա կՇյերi, արlագ ո երl կարlաUlli. ածորi ~Li Շյան,ենաliՇյեո:

QեՇյեն,ոկորiեՇյ նոt1ո~ոկացL[ած նաՇյոtՇյեո ԳՄՄ ՄաՇյրitՇյերl t1 Ulարlրերl ն,ենակՇյերlt1 շն,աներl եՇյ, որiոՇյQ UU1երtծL[ե[ ենյ րԸtշկարաՇյակաՇյ L. ն,եtնՇյո[ոգոակաՇյ tնՇյt1որiՇյերiո tոծնաՇյ հանարi :

Բուսական ԳՄԲ-ները ստեղծվում են մի շարք հատկանիշների ձևավորման նպատակով. 1. Կայունություն կրծողների և միջատների նկատմամբ (արտադրվող ԳՄԲ-ների 18 %): 2. Կայունություն հերբիցիդների նկատմամբ (արտադրվող ԳՄԲների 73 %): Նշված երկու հատկանիշներով օժտված արտադրվող տեսակների ծավալը 8 %-ը: 3. Սննդարար հատկանիշների բարելավման նպատակով: 4. Հիվանդությունների նկատմամբ կայունության բարձրացման նպատակով: 5. Պահման և օգտագործման հատկանիշների բարելավման նպատակով: 6. Դեղամիջոցների արտադրման նպատակով: 7. Կերակրային հավելակերերի արտադրության նպատակով: 8. Սնկայինների նկատմամբ կայունության բարձրացման նպատակով:

9. Միջավայրի աբիոտիկ գործոնների՝ երաշտի, ցրտահարությունների, հողի կազմի աղերի և ալյումինի և այլնի նկատմամբ կայունության բարձրացման նպատակով: Բուսական մոդիֆիկացված օրգանիզմները ստացվում են տրանսֆորմացիայի մեթոդներով՝ կամ ագրոբակտերիաների միջոցով, կամ բալիստիկ և էլեկտրապորացիայի մեթոդների, կամ վիրուսային տրանսդուկցիայի կիրառմամբ: Առավել հաճախ կիրառվում են ագրոբակտերիաների ներմուծման և բալիստիկ տրանսֆորմացիայի մեթոդները: Աշխատանքի համար օգտագործում են պլազմիդային զոնդեր, որոնց կազմում առկա են նպատակային գենը, այդ գենի ակտիվությունը կարգավորող պրոմոտորը, տրանսկրիպցիայի տերմինատորը, և նշադրային կասետ, որը պարունակում է կամ հակաբիոտիկ կանամիցինի նկատմամբ կայունության, կամ հերբիցիդի նկատմամբ կայունության գեն ու պլազմիդի գենոմի որոշակի հատված: Այժմ նշադրային կասետի առկայությունը չի համարվում անհրաժեշտ, քանի որ դա կարող է վատ ազդել մոդիֆիկացվող օրգանիզմի վրա: Դրա տեղը պլազմիդում հատկացվում է նպատակային գենի աշխատանքը կարգավորող օժանդակ գեներին: ԳՄՕ-ների արտադրական օգտագործումը սկսվել է 15-20 տարի առաջ և այս ընթացքում կատարվել է դրանց մեծ մասի բազմակողմանի գենետիկական և արդյունաբերական հետաքննումը: Այժմ աշխարհի տարբեր երկրներում որպես սննդամթերք օգտագործվում են ԳՄՕ փոփոխված օրգանիզմների որոշակի տեսակներ: Միացյալ Ազգերի Կազմակերպության (ՄԱԿ) տվյալներով տարբեր երկրներում թույլատրվում է օգտագործել որոշ ԳՄԲ-ներ. - սոյա՝ 11 գիծ, կազմում են արտադրվող ԳՄԲ-ների 61 %-ը: - կարտոֆիլ՝ 24 գիծ, - եգիպտացորեն՝ 32 գիծ, կազմում են արտադրվող ԳՄԲ-ների 23 %-ը: - շաքարի ճակնդեղ՝ 3 գիծ, - բրինձ՝ 5 գիծ, - լոլիկ՝ 8 գիծ,

-

ռապս՝ 32 գիծ,կազմում են արտադրվող ԳՄԲ-ների 5%-ը: ցորեն՝ 3 գիծ, սեխ՝ 2 գիծ, եղերդ՝ 1 գիծ, սեխածառ՝ 2 գիծ, դդմիկ՝ 2 գիծ, վուշ՝ 1 գիծ, բամբակ՝ 9 գիծ: Մնացած տեսակների արտադրական ծավալը կազմում է ամբողջ ծավալի 10 %-ը: Արտադրվող ԳՄԲ-ների 99 %-ը աճեցվում է նկար 3.89-ում ներկայացվող 10 երկրներում:

,.

qԱՕ-n աot.ց1հնն Lոաոած_րնt.ոo նհl.i) ,o.9

'.:iՊ'

.Ը

~Պ

.D

ա ,o C.

11.2

5'°

.::::r

~ 10

3.6

T3 •

Նկ. 3.89. Տարբեր երկրներում ԳՄԲ-ի աճեցման համար օգտագործվող հողատարածքների ծավալները (2015 թ.) (http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/event/default.asp?EventID=521):

ՄԱԿ-ի Պարենային և գյուղատնտեսական կազմակերպությունը Միջազգային առողջության պահպանման կազմակերպության հետ միասին մշակել են հատուկ օրենքների համակարգ՝ «Foods derived from modern biotechnology», որը կոչված է կարգավորել ԳՄԲ-ների արտադրության և օգտագործման կարգը: Չնայած տարբեր երկրներում գործող ԳՄԲ-ների աճեցման և օգտագործման օրենքները բավականին միակերպ են, սակայն դրանց կիրառության եղանակները

տարբեր են: Այսպես, ԱՄՆ-ում ԳՄԲ-ների օգտագործումը կատարվում է ազատ շուկայական օրենքների համաձայն, իսկ Եվրոպական երկրներում ԳՄԲ-ներ կամ չեն արտադրվում, կամ արտադրվում են աննշան քանակությամբ: Այս երկրներում ընդունված են օգտագործման խիստ սահմանումներ, ԳՄԲ-ի քանակը սննդամթերքում չի կարող գերազանցել կշռի 0,9 %-ը: Ռուսաստանում կատարված հետազոտությունների արդյունքների համաձայն՝ ԳՄՕ-ների քանակը մսամթերքում հավասար է 6,6 %, սոյայի մթերքում՝ 3,9 %, թռչնամթերքում՝ 3,8 %: Մինչև 2014 թ. Ռուսաստանը արգելում էր ԳՄԲ-ների արտադրական աճեցումը երկրում, բայց թույլ էր տալիս փորձնական տարածքներում կատարել գիտական հետազոտություններ և գնել որոշ ԳՄԲ մթերքներ: 2016 թվականից Ռուսաստանում գործում է օրենք, որն արգելում է ԳՄՕ-ների որևէ օգտագործում, իսկ գիտական հետազոտությունները թույլատրվում են: Տարբեր երկրներում ԳՄՕ-ների օգտագործման նկատմամբ որոշումներն ընդունվում են տարբեր պարտադիր գործոնների համաձայն: Բայց բոլոր դեպքերում կիրառվում են որոշակի ընդհանուր սկզբունքներ: Տարբեր երկրներում արդեն մշակվել և գործում են ԳՄԲ-ների քանակական և որակական որոշման մեթոդներ, որոշվել են դրանց առավելագույն խտության թույլտրվող սահմանները: Այս խնդիրների լուծման համար անհրաժեշտ են սարքավորումներով հագեցված լաբորատորիաներ և բարձր մասնագիտացված անձնակազմ: Նշենք, որ 2016 թ. ԱՄՆ-ում թույլատրվել է գենամոդիֆիկացված սաղմոնի ազատ վաճառք: ԳՄՕ-ների առկայության ստուգման համար սովորաբար օգտագործվում են ՊՇՌ-ի որակական և քանակական մեթոդները: ՊՇՌ-ի օգտագործումը անհրաժեշտ է բոլոր այն դեպքերում, երբ ԳՄՕի մշակման մեթոդները նոսրացնում են և քայքայում օրգանիզմների ԴՆԹ-ն, և դրա բացահայտման համար անհրաժեշտ է ստանալ բավարար քանակներ: Նշենք, որ ԳՄՕ-ի քանակի որոշման լաբորոտոր մեթոդները տարբեր են, տարբեր կարող են լինել նաև ստացվող

արդյունքները: Այդ պատճառով ճշգրիտ արդյունք հնարավոր է ստանալ միայն չմշակված ԳՄԲ-ների հետազոտման դեպքում: ԳՄՕ-ների որակական որոշման համար վերջին տարիներին օգտագործում են հատուկ պատրաստված միկրոչիպային համակարգեր: Անվտանգության սկզբունք: Մթերքը պետք է լինի անվտանգ և անվնաս մարդկանց ու կենդանիների համար: Անվտանգությունը պետք տարածվի նաև միջավայրի վրա: Անվտանգությունը որոշվում է բարդ ու երկարատև հետազոտությունների միջոցով, և վտանգ պարունակող մթերքի օգտագործումը և աճեցումը արգելվում է: Եթե օգտագործման ժամանակ բացահայտվում է օգտագործվող մթերքի վնասակար ազդեցությունը, ապա դա պետք է արգելվի: Ընտրության իրավունք: Նույնիսկ անվտանգ ճանաչված մթերքի աճեցման, մշակման և օգտագործման իրավունքը պետք է տրվի արտադրողին և օգտագործողին՝ գյուղացուն, արդյունաբերական կազմակերպություններին, բնակչությանը: Այս իրավունքը իրականացնելու համար մթերքների վրա պետք է դրվեն ԳՄՕ-ների առկայության և քանակի մասին հստակ, հիմնավորված նշումներ: 3.19.3.2. ԳՄ մթերքների օգտագործման ռիսկերը Առողջական ռիսկերը: Սննդամթերքի անվտանգության 100 % մակարդակ ապահովել հնարավոր չէ, բայց ԳՄՕ-ներ պարունակող մթերքները ենթարկվում են բազմակողմանի քննության մի քանի ուղղություններով՝ ժամանակակից մեթոդներով: ԳՄՕ-ներով առաջացվող ալերգիաների վտանգները: ԳՄՕների կազմ ներմուծվող նոր գեները սովորաբար առաջացնում են նոր սպիտակուցի սինթեզ, որը կարող է անսովոր լինել մարդու օրգանիզմի համար: Եթե այդ սպիտակուցի մակերեսին առկա է IgE հակամարմնին համապատասխանող կապի կենտրոն, ապա առաջանում է ալերգիկ ռեակցիա: Ալերգիաների նկատմամբ հակումը գենետիկորեն պայմանավորված է և շատ բազմազան: Միշտ չէ, որ բացահայտվում են բոլոր հնարավոր ռիսկերը: Առավել ևս, որ ալերգիաներ կարող են առաջաց351

նել նաև ԳՄՕ-ի և սովորական տեսակների հիբրիդացման արդյունքում առաջացած սերունդները, որոնց ստուգում չի նախատեսվում: Յուրաքանչյուր նոր ԳՄԲ սորտ անցնում է ալերգենային պոտենցիալի հետազոտություն: Համեմատվում է նոր սպիտակուցի ամինաթթվային հերթականությունը հայտնի ալերգենների ակտիվ կենտրոնների հերթականության հետ, որոշվում է սպիտակուցի կայունությունը մարսողական պրոցեսում: Ալերգիաների նկատմամբ հակում ունեցող մարդկանց արյան հետազոտման եղանակով որոշվում է ալերգիաների առաջացման հավանականությունը, թեստավորվում են օրգանիզմների ռեակցիաները: Եթե նոր սորտի հետազոտման ընթացքում բացահայտվում է դրա ալերգեն բնույթը, այդ ուղղությամբ աշխատանքները արգելվում են, և նոր սորտի ԳՄՕ-ն չի արտադրվում: Օրինակ՝ 1995 թ. Pioneer Hi-Bred կազմակերպությունը ձեռնարկել էր մեթիոնինով հարուստ սոյայի սորտի ստեղծում: Մեթիոնինի քանակի ավելացման համար սոյայի գենոմ էր ներմուծվել բրազիլական ընկույզի գեն, որի ազդեցությունը առաջացնում էր ալերգիկ ռեակցիաներ: Այս ուղղությամբ կատարվող աշխատանքները ընդհատվեցին: Մեկ այլ օրինակ է կերային «StarLink», եգիպտացորենի Bt-մոդիֆիկացված տարատեսակի ստեղծման դեպքը: Հետազոտությունների արդյունքներով ԱՄՆ-ում այս սորտի կիրառումը խիստ սահմանափակվել է՝ օգտագործվում է միայն որպես կենդանիների կեր: Բայց ավելի ուշ Bt-մոդիֆիկացված սորտի հյուսվածքը բացահայտվել է նաև սննդամթերքում, և, չնայած հետազոտությունների արդյունքներով մարդկանց մոտ ալերգիաների 28 դեպքի առաջացման պատճառը Bt-մոդիֆիկացված եգիպտացորենի տեսակը չէր, միևնույն է, դրա արտադրությունը արգելվել է: 2005 թ. ավստրալիական CSIRO կազմակերպությունը ստեղծել էր կրծողների և միջատների նկատմամբ կայուն կերային ոլոռի սորտ: Կայունության գործոնը լոբու գենոմից տեղափոխված գենն էր: Սակայն կարճ ժամանակ անց հետազոտությունների արդյունքում բացահայտվեց դաշտային մկների թոքերի ալերգիկ ռեակցիա, և սորտի օգտագործումը արգելվեց:

ԳՄՕ-ների ալերգիկ ազդեցության մեխանիզմների հետազոտությունները բազմազան են և զարգացած երկրներում ընթանում են ամբողջ ծավալով: Ավելին, ամեն առաջացած դեպք անմիջապես հետազոտվում է նոր վտանգների բացահայտման և չեզոքացման համար: ԳՄՕ-ներով պայմանավորված տոքսիկություն: Սկսած 1999ից մինչև 2005 թվականները կատարվել են ԳՄՕ-ների տարբեր սորտերի տոքսիկության բազմաթիվ հետազոտություններ: Աշխատանքներին ակտիվ մասնակցել և որոշակի ապացույցներ են ներկայացրել մի շարք հեղինակներ՝ Ա. Պուստայա, Ի. Երմակովա, Է. Սերալինի: Բայց հեղինակների ստացած արդյունքների փորձնական ստուգումն ու վերլուծությունը թույլ տվեցին եզրակացնել, որ մինչ այժմ ԳՄՕ-ների տոքսիկ ազդեցության մասին գիտականորեն հիմնավորված ապացույցներ չեն բացահայտվել: Ժիլ Էրիկ Սերալինին շարունակում է հետազոտությունները և 2012 և 2014 թվականներին նոր տվյալներ է հրապարակել: Սակայն այս արդյունքները նույնպես չեն ընդունվում գիտական կազմակերպությունների և հանրության կողմից: «Կոմպոզիցիոն էկվիվալենտություն»: Աշխարհի մի շարք երկրներում գործում է, այսպես կոչված, «կոմպոզիցիոն էկվիվալենտության» (en:substantial equivalence) կանոն, որի համաձայն՝ եթե ԳՄ մթերքը պարունակում է որոշակի նյութերի նույն կազմը, որը բացահայտվում է նորմալ մթերքում, ուրեմն ԳՄՕ-ն չի համարվում առավել վտանգավոր, քան սովորական սնունդը: Գիտնականների մի որոշ խումբ գտնում է, որ նման մոտեցումը արատավոր է, քանի որ մինչ այժմ կապը քիմիական կազմի, կենսաքիմիայի և գենետիկայի միջև դեռ լիարժեք ուսումնասիրված չէ: Բացառված չէ, որ բջիջներում և հյուսվածքներում կան դեռ չբացահայտված և չուսումնասիրված վնասակար նյութեր, որոնց կազմի փոփոխությունը կարող է լինել խիստ վտանգավոր: 2012 թվականին տպագրված հոդվածում քննարկվում են սովորական (MG-BR46 Conquista) սոյայի և գլիֆոսատի նկատմամբ կայուն մոդիֆիկացված տարատեսակի (BRS Valiosa RR) ազդեցությու353

նը մկների օրգանիզմի վրա: Բացահայտվել է, որ և սովորական, և մոդիֆիկացված սոյան մկների մոտ առաջացնում են ԴՆԹ-ի վնասվածքների քանակի նվազեցում, բայց մոդիֆիկացվածի ազդեցությունը 2 անգամ ցածր է, քան սովորականինը: Ավելի վաղ՝ 2010 թվականին նույն սորտերի ազդեցության ուսումնասիրությունների արդյունքում բացահայտվել էր, որ սովորական սոյայի 10 և 20 % չափաքանակը առաջացնում է մուտագեն ֆոնի նվազում: Ավելի թույլ, բայց նույն ձևով է ազդում մոդիֆիկացված սորտի 10 %-անոց կերաբաժինը, բայց 20 %-ոց կերակրաչափը այդպիսի ազդեցություն չի ունենում, ավելին, զգալիորեն նվազեցնում է միտոտիկ ինդեքսը՝ ունի ցիտոտոքսիկ ազդեցություն: Մյուս կողմից մկների ներքին օրգանների 15 օրական հյուսվածքաբանական հետազոտություններում փոփոխություններ չեն հայտնաբերվել: Ամփոփելով ստացված արդյունքները՝ հեղինակները առաջարկել են շարունակել հետազոտությունները: Գեների հորիզոնական փոխանցում մթերքից սնվողին: Յուրաքանչյուր սնվող անձ սննդի կազմում կլանում է 0,1-1,0 % ԴՆԹ, որը, ենթարկվելով մարսողական պրոցեսին, 95 %-ով քայքայվում է մինչև նուկլեոտիդ: Մնացած 5 %-ը հասնում է աղիքային բաժին որպես 100400 նուկլեոտիդներից կազմված շղթա: Քանի որ ներմուծվող գենային հատվածները պարունակում են պրոմոտորային հերթականություններ, դրանց ներմուծումը արյան կազմ և ապա բջիջ կարող էր ակտիվացնել արգելակված գեները, առաջացնել լուրջ հիվանդագին հետևանքներ: Մկների, հորթերի և ճտերի վրա կատարված հետազոտություններում չի դիտվել ոչ մի դեպք, երբ տրանսգենի ԴՆԹ-ի որևէ հատված բացահայտվի հետազոտվող առանձնյակների սերունդների գենոմներում:

3.19.3.3. Շրջապատող միջավայրը և ԳՄՕ-ի ազդեցության ռիսկերը ԳՄՕ-ների ազդեցության կարևոր ռիսկերի թվին է պատկանում միջավայրի էկոհամակարգում հնարավոր փոփոխությունների առաջացումը: Գեների միգրացիա վերափոշոտման պայմաններում: Տրանսգեն բույսերը կարող են ազդել միջավայրի վրա, եթե կարողանան ամրապնդվել և ընդլայնել աճի համար տրամադրված տարածքները՝ անցնել բնական պոպուլյացիաների կազմ: ԳՄՕ-ների ազդեցության գնահատման համար անհրաժեշտ է հետազոտել՝ 1) տրանսգեն օրգանիզմների աճի հնարավորությունը հատկացված տարածքներից դուրս, 2) տրանսգեն օրգանիզմների ունակությունը փոխանցել ներմուծված գեները վայրի տեսակներին և առաջացնել կենսունակ սերունդ, 3) բնորոշ են արդյոք տրանսգեն սորտին սելեկցիոն առավելություններ, և ունակ են արդյոք դրանք հաղթահարել բնական տեսակների ադապտիվ հնարավորությունները: Մշակաբույսերի մեծ մասը, նույն թվում և տրանսգեն բույսերը, ունակ են տրամախաչվել հարևանությամբ աճող նույն տեսակի վայրի բույսերի հետ և փոխանցել դրանց ընտանի տեսակների գեները: Ընտանի տեսակների գեները, հայտնվելով վայրի տեսակի գենոմում, կարող են խախտել բնական էկոհամակարգը: Սովորաբար առաջացող հիբրիդները պտղատու չեն և չեն պահպանվում բնական միջավայրում ընտանի սորտի աճեցման ավարտից հետո: Տրանսգեն բույսերի գեների տարածումը արգելակելու նպատակով մշակվում են տրանսգենը քլորոպլաստի գենոմի կազմ ներմուծելու եղանակներ: Սակայն մինչ օրս այդ խնդիրը լուծված չէ: Այսպիսով՝ տրանսգենի տարածումը հնարավոր է կամ նույն սորտի ընտանի բույսերի հետ տրամախաչման եղանակով, կամ նույն տեսակի վայրի բույսի հետ տրամախաչման, կամ վայրի մտերիմ

տեսակի հետ տրամախաչման դեպքում: Հետազոտությունները ցույց են տալիս, որ ամենահավաստի հնարավորությունը վայրի մտերիմ տեսակի հետ հիբրիդացումն է: Բարենպաստ ազդող գեները շատ արագ են տարածվում պոպուլյացիայում, չեզոք գեները միջին արագությամբ, իսկ վնասակար գեները տարածվում են միայն մշտական ներհոսքի դեպքում: Տրանսգենների տարածումը բնական պոպուլյացիայում կարող է լինել դրա պաշտպանիչ, կայունության արդյունք, օրինակ՝ կայունություն միջատների կամ կրծողների նկատմամբ և հնարավոր է, որ առաջացնի էկոհամակարգի զգալի շեղումներ, նույնիսկ կենդանիների կազմի փոփոխություն: Այնուամենայնիվ, տրանսգենների ազդեցությունը էկոհամակարգերի վրա դժվար է ուսումնասիրել և հավաստի կանխագուշակել: Գեների միգրացիա՝ շարժ բնական հորիզոնական փոխանցման եղանակով Բակտերիաների միջև ժառանգական նյութի հորիզոնական փոխանակումը բնական պրոցես է, որը գործում է ինչպես նույն տեսակի այնպես էլ մոտ տեսակների և շտամերի բջիջների միջև: Տրանսգեն բույսերի մեծ մասի գենոմը պարունակում է աղիքային ցուպիկի Escherichia coli-ի կանամիցինի նկատմամբ կայունության գենը, որն օգտագործվում էր որպես ներմուծվող վեկտորի նշադիր: Սակայն այդ գենի փոխանցումը բուսական օրգանիզմից հողում ապրող բակտերիաներին կարող է առաջացնել կայունության տարածում և հակաբիոտիկների նկատմամբ կայունության փոխանցում ինչպես ավիրուլենտ տեսակներին, այնպես էլ վիրուլենտ: Հետազոտությունները ցույց են տալիս, որ ինչպես բնական պլազմիդները այնպես և արհեստական վեկտորները կարող են կատարել այդ փոխանցումը, բայց պլազմիդները ավելի հաճախ: Ամփոփելով ներկայացված նյութը պետք է նշենք, որ տրանսգեն օրգանիզմների և դրանցից ստացված նյութերի օգտագործումը լիովին անվնաս չէ, և կարող է առաջացնել տարբեր բնույթի հիվանդագին

վիճակներ: Ուստի, հարգելով ձեր իրավունքը՝ ընտրել ԳՄՕ օգտագործելու կամ չօգտագործելու որոշումը, ներկայացնում ենք ձեզ ամենահայտնի ֆիրմաների տրանսգեն նյութեր պարունակող արտադրատեսակների ցանկը (նկ. 3.90):

Նկ. 3.90. Տրասգեն նյութեր օգտագործող ֆիրմաների և դրանց կողմից արտադրվող նյութերի ու մթերքների ցանկ:

3.19.4. ՊՇՌ-ն դատաբժշկագիտական փորձագիտությունում Դատաբժշկական փորձագիտական հետազոտություններում առաջին անգամ ՊՇՌ-ն օգտագործվել է 1987-1988 թվականներին մարդու ՀՀԳՀ-ի HLA-DQA1 լոկուսի պոլիմորֆիզմի ուսումնասիրման համար: Դետեկցիայի այս եղանակը այնքան էլ արդյունավետ չէր, քանի որ ստացված արդյունքները գիտական արժեք ունեին, բայց հարմար չէին գործնական կիրառման համար: Դատական բնագավառում օգտագործման համար մշակվել են ՊՇՌ-ի կիրառման մի շարք ուղղություններ.

1. ԴՆԹ-ի փոքրագույն նմուշների բազմացում ՊՇՌ-ի եղանակով, անհրաժեշտ ծավալների ստացման համար: 2. Տարբեր ծագում ունեցող նմուշների հետազոտում, սեռի որոշում: 3. Սերմի ԴՆԹ-ի հետազոտում տարբեր շեղումների բացահայտման նպատակով: 4. Կանացի և տղամարդու ԴՆԹ-ի խառնուրդի հետազոտում: 5. Տարբեր ժամանակ թողված ԴՆԹ-ի հետքերի հետազոտում: 6. Միկրոբային ԴՆԹ-ի հետքեր պարունակող նմուշների հետազոտում: Օրինակ՝ բջջագենետիկական մեթոդով սեռը որոշելու համար պահանջվում է բավականին մեծ քանակությամբ չվնասված բջիջների հետազոտում, սակայն սովորաբար հետազոտվող նմուշներում բացակայում են ամբողջական բազմաթիվ բջիջները: Ավելին՝ սեռը որոշվում է Բարրի մարմինների առկայությամբ, իսկ դրանց բացահայտումը պահանջում է առանձին հետազոտություն: ԴՆԹ-ի ախտորոշման եղանակը այնպես է կազմակերպված, որ նույն հետազոտությունում որոշվում են և ԴՆԹ-ի անհատական նշադիրները, և սեռի նշադիրները, ուստի առանձին հետազոտման կարիք չի առաջանում: Ավելին, ԴՆԹ-ի հետազոտման եղանակով ստացված արդյունքը ավելի հավաստի է ու անսխալ: X քրոմոսոմի նշադրի բացահայտումը Y-ի բացակայության պայմաններում ապացուցում է նմուշի իգական սեռը: Ընդհանուր առմամբ ԴՆԹ դետեկցիայի մեթոդը ավելի ինֆորմատիվ է, թույլ է տալիս նույն փորձի սահմաններում կատարել մի քանի տարբեր ԴՆԹ-ի նշադիրների որոշում, տնտեսապես ավելի արդարացված է և հավաստի: Տեսակայուրահատուկ պրայմերների օգտագործումը բացառում է միկրոբային ԴՆԹ-ների խառնուրդի ազդեցությունը փորձի արդյունքների վրա և ապահովում դրանց ճշգրտության բարձր մակարդակը, որն կարևոր է դատական գործընթացում:

Տարբեր երկրներում մշակվել են դատաբժշկական փորձագիտության նման համակարգեր, որոնց կիրառությունը պարտադիր է երկրի հետազոտական լաբորատորիաների համար: Նշենք, որ վերջին տարիներին հաճախ օգտագործվում են STR լոկուսների հետազոտման մեթոդները: Ընդ որում՝ հետազոտությունների թիրախ են լինում ինչպես սեռական քրոմոսոմները և միտոքոնդրիումի ԴՆԹ-ն, այնպես էլ աուտոսոմները, որոնց մուտացիոն փոփոխականության ցածր աստիճանը ապահովում է փոքր ամպլիկոնների միջոցով ճշգրիտ արդյունքների ստացման հնարավորություն: Մարդու գենոմի քարտեզավորման արդյունքում ստացված գենոմնուկլեոտիդային հերթականությունների պատկերը «HapMap»-ը (http://www.hapmap.org) թույլ է տալիս գտնել այն գեները և պոլիմորֆիզմները, որոնք նշադրում են գենետիկական կամ գենետիկորեն պայմանավորված հիվանդությունները: Ինչպես արդեն նշել ենք STR-ներում մուտացիաների հաճախականությունը աննշան է և դրա շնորհիվ մեթոդի օգտագործումը ծագումնաբանական հետազոտություններում ապահովում է պատասխանի բարձր ճշգրտություն: Ավելին, մեթոդը թույլ է տալիս հետազոտել կարճ ամպլիկոնները, որն իր հերթին ապահովում է բարձր տեխնոլոգիաների կիրառման և ստացված տվյալների բանկերի ստեղծման հնարավորություն: Այսպիսով՝ ՊՇՌ-ն ժամանակակից գենետիկական հետազոտությունների արագ զարգացող և արդյունավետ եղանակ է, որն ապահովում է աշխատանքների արագ կատարում, ստացված արդյունքների ճշգրտության բարձր մակարդակ և հարմար է դրանց ավտոմատացված վերլուծության և պահման համար: Այժմ աշխատանքների բարելավման հիմնական ուղղությունը ամբողջ ՊՇՌ-ը պրոցեսի ավտոմատացնումն է:

3.20. ԳԻՏԱԿԱՆ ՀԵՏԱԶՈՏՈՒԹՅՈՒՆՆԵՐ

Գիտական հետազոտությունների բնագավառները բազմաթիվ են: Հետազոտությունները ուղղված են ինչպես զուտ գիտական խնդիրների լուծմանը, այնպես էլ նոր հետազոտական ուղղությունների և կիրառման եղանակների մշակմանը: Դրանք են՝ - գենետիկական պոլիմորֆիզմի ուսումնասիրություններ, գեների, քրոմոսոմների և տեսակների գենոմների քարտեզավորում, - համեմատական գենետիկական և գենոմիկական վերլուծություն գենետիկական բազմազանության հետազոտություններ, - գենային նշադիրների բացահայտում, գենային և քրոմոսոմային մուտացիաների հետազոտում, սելեկցիոն աշխատանքներ նշադիրների կիրառմամբ, - տեսակների, սորտերի, ցեղերի գենետիկական թեստավորում, ֆիլոգենեզի պրոցեսների հետազոտում, - գենոմների կազմակերպման հետազոտություններ, էվոլյուցիոն զարգացման պրոցեսում գենոմի կազմակերպման փոփոխությունների, տարբեր տաքսոնոմիկ խմբերի գենոմների կազմակերպման սկզբունքների ուսումնասիրություններ և այլն:

3.21. ՄՈԼԵԿՈՒԼԱՅԻՆ ԱԽՏՈՐՈՇՄԱՆ ՄԵԹՈԴԻ ԶԱՐԳԱՑՄԱՆ

ԺԱՄԱՆԱԿԱԿԻՑ ՈՒՂՂՈՒԹՅՈՒՆՆԵՐԸ

ՊՇՌ-ի կիրառումը հարուցիչների որոշման համար, լինելով հետազոտման արագ և ոչ թանկ եղանակ, կազմում է ախտորոշման աշխատանքների ամբողջ ծավալի 70-80 %-ը: Քեմբրիջի առողջապահության ինստիտուտի և Գեն ամսագրի՝ Cambridge Healthtech Institute և GEN տվյալներով վերջին 15-20 տարվա ընթացքում մոլեկուլային ախտորոշման մեթոդները բժշկության բնագավառում զգալի ընդլայնվել են և տարածվել ամբողջ աշխարհում: Նշենք, որ այս բնագավառում ամենամեծ աճը դիտվում է ՊՇՌ-ի մեթոդների զարգացման և բարելավման բնագավառում: Այսօր արդեն ստացված արդյունքների դետեկցիայի համար կիրառվում են հիմնականում FLASH մեթոդը

(դեպքերի 35 %) և ռեալ թայմ մեթոդը (55 %): Սակայն վերջին 10 տարիներին դիտվում է թվային ՊՇՌ մեթոդի ձևավորման և կատարելագործման գործընթաց, որը, լինելով դասական ՊՇՌ-ի տարատեսակ, այնուամենայնիվ, թույլ է տալիս սկզբնակետի տվյալներով կատարել նմուշում գտնվող հետազոտվող ԴՆԹ-ի մոլեկուլների քանակական որոշում: Այս եղանակը արդեն լայն կիրառվում է ինչպես գիտահետազոտական, այնպես էլ բժշկաբանական հետազոտություններում: Մոլեկուլային ախտորոշման արագ զարգացող նորագույն մեթոդներից են սեկվենացումը, պիրոսեկվենացումը և միկրոչիպային տեխնոլոգիաները: Վերջին տարիներին մշակվել են միկրոչիպային տեխնոլոգիաներ, որոնց կիրառությամբ ՊՇՌ հետազոտությունները ստացան ընդլայնման ազդակ, իսկ գիտական հետազոտությունների ու գործնական կիրառական բնագավառներում առաջացան նոր հնարավորություններ: Բոլոր կիրառվող հետազոտական մեթոդները հիմնվում են ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի մոլեկուլների կոմպլեմենտար հիբրիդացման սկզբունքի վրա: Ուստի մենք կշարունակենք նուկլեոթթուների հետազոտման համար կիրառվող մեթոդների ներկայացումը հիբրիդացման մեթոդի նկարագրման բաժնով:

ԳԼՈՒԽ 4. ՆՈՒԿԼԵԻՆԱԹԹՈՒՆԵՐԻ ԵՎ ՍՊԻՏԱԿՈՒՑՆԵՐԻ

ՄՈԼԵԿՈՒԼԱՅԻՆ ՀԻԲՐԻԴԱՑՄԱՆ ՄԵԹՈԴՆԵՐԸ

Նուկլեինաթթուներին և սպիտակուցներին բնորոշ է հատուկ ձևով միանալ յուրահատուկ մոլեկուլների հետ և կազմել տեսակայուրահատուկ համալիրներ: Նուկլեինաթթուների դեպքում այդպիսի մոլեկուլներ են միաշղթա ԴՆԹ-ները և ՌՆԹ-ները, սպիտակուցների դեպքում՝ հակամարմինները (ՀՄ): Երկշղթա ԴՆԹ-ի մոլեկուլին բնորոշ բնափոխվելու կամ հալեցվելու հատկությունը (100 0C պայմաններում բաժանվել երկու առանձին շղթաների և ջերմաստիճանի իջեցումից հետո կոմպլեմենտար շղթաների միավորման եղանակով վերականգնել երկշղթա կազմությունը) հայտնաբերվել է 1961 թվականին: Ընդ որում՝ միանալ կարող են բոլոր տեսակի՝ ԴՆԹ-ԴՆԹ, ՌՆԹ-ՌՆԹ և ԴՆԹ-ՌՆԹ կոմպլեմենտար շղթաները: Կոմպլեմենտար կապվում են ԴՆԹ-ի կազմի Ա-Թ և Ց-Գ նուկլեոտիդները, որոնց միջև ձևավորվում են ջրածնային կապեր: Պուրինային բնույթի գուանինը (Գ) կապվում է պիրիմիդինային բնույթի ցիտոզինի (Ց) հետ 3 ջրածնային կապով, իսկ պուրինային բնույթի ադենինը (Ա) կապվում է պիրիմիդինային բնույթի թիմինի (Թ) հետ 2 ջրածնային կապով: Շղթաների միավորումը կատարվում է անկախ դրանց առաջացման բնույթից և նույնիսկ այն դեպքերում, երբ շղթաները լրիվ կոմպլեմենտար չեն, միացումը տեղի է ունենում միայն կոմպլեմենտար նուկլեոտիդների միջև: Նուկլեինաթթուների հիբրիդացման սկզբունքը կիրառվում է և որպես ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի հետազոտման ինքնուրույն եղանակ, և այլ տեխնոլոգիաներում՝ ՊՇՌ, սեկվենացիա, միկրոչիպեր: Հիբրիդացման մեթոդը սկզբնական շրջանում կիրառվում էր ԴՆԹ-ի կազմում հայտնի հերթականությունների լոկալիզացիայի բացահայտման համար: Այս եղանակով հետազոտվում է գեների դիրքը քրոմոսոմում կամ էկզոնների դիրքը գենում, որոշվում է կոդավորող և չկոդավորող հատվածների հերթականությունը քրոմոսոմում: Գիտության զարգացման ժամանակակից փուլում հիբրիդացման մեթոդը

բարելավվել է, դարձել ավելի զգայուն և ճկուն, ուստի ընդլայնվել են և օգտագործման հնարավորությունները՝ ինչպես կիրառական այնպես էլ հետազոտական բնագավառներում: Հիբրիդացման մեթոդներից մեկը՝ Սաուզերն բլոտ հիբրիդացումը (Southern blot - հարավային բլոտ) կիրառվում է ԴՆԹ-ի կազմում որոշակի հերթականությունների բացահայտման համար: Այս մեթոդը միավորում է էլեկտրաֆորեզի եղանակը թաղանթային ֆիլտրի վրա ԴՆԹ-ի կտրտված հատվածների ֆիքսման գործընթացի հետ: Մեթոդը առաջարկվել է 1975 թ. Էդվին Սաուզերնի կողմից:

4.1. ՀԻԲՐԻԴԱՑՈՒՄ ՍԱՈՒԶԵՐՆ ԲԼՈՏ ԵՂԱՆԱԿՈՎ

ԴՆԹ-ի շղթաների հիբրիդացման աշխատանքը կատարվում է մի քանի փուլերով և նախատեսում է մի շարք մեթոդների կիրառում: 1. ԴՆԹ-ի հետազոտվող շղթայի համեմատաբար կարճ հատվածներ ստանալու համար մոլեկուլը կտրտվում է մի քանի ռեստրիկտազներով: 2. ԴՆԹ-ի ստացված հատվածները բաժանվում են ագարոզային կամ այլ դոնդողի վրա՝ էլեկտրաֆորեզի եղանակով (նկ. 4.1): 3. Միաշղթա հատվածների ստացման համար թորամասերի բաժանված ԴՆԹ-ի շղթաները ենթարկվում են հալեցման՝ մշակվում հիմնային նյութերով: 4. Դոնդողը ծածկվում է նիտրոցելյուլոզային մեմբրանով: 5. Մեմբրանի վրա դարսվում են ֆիլտրաթղթի բազմաթիվ շերտեր և մշակվում վերևից դանդաղ հոսող բուֆերային լուծույթով: 6. ԴՆԹ-ի միաշղթա հատվածները տեղափոխվում են մեմբրանի վրա և տաքացվում վակուումում կամ մշակվում ՈՒՄ ճառագայթներով: Արդյունքում ԴՆԹ-ի հատվածները անվերադարձ կապվում են մեմբրանի հետ (այս մեթոդը կոչվում է խոնավ տեղափոխման եղանակ): 7. Ցելյուլոզային մեմբրանը տեղափոխվում է ռադիոակտիվ նշադրված զոնդեր պարունակող լուծույթի մեջ: Նմուշի հատվածները հիբրիդացվում են՝ միանում կոմպլեմենտար զոնդերին:

8. Չկապված զոնդերի հեռացման համար ցելյուլոզային մեմբրանը լվացվում է, ապա նկարվում կամ ֆիքսվում ռադիոավտոգրաֆիայի (եթե նշադրման համար օգտագործվել է ռադիոակտիվ նշադիր) կամ այլ եղանակով, եթե նշադիրը այլ բնույթի է: ,i. ոարiոոաlյոհLI

ա. կl!lրlUlljած '1նlթ-հ հաոL!ածնtերրo րաժանL!ոtժ tենյ 13որրաժանl:երlհ t'.ե-հ ժհ2ոցոկ '1ոնր1որi

ր. '1նlթ-հ 13որրաժաներրo ոl:երiաtոորնL!ոtժ tենյ նոորրոցl:ենո1ոգ. Ol:եOր[lաUհ կրlա

նհ2երրոL1 otեoրրրանo նlյարրL!ոtժ t աL!ոոoարiհոգ[lա~հli երiանա[jոLI

գ. Utեoրրրանo 02աlյL!ոtժ t oարiհոա[jոհLI ն2L1ած գոնրiերրոLI

- - - - -'-~ ~հtորրերրոLI ոոttո ~հtորll:երl

tե UL!ոոoարiհոգ[lա~հ ա

ո1ոգա1ոն '1նlթ-հ 13որրաժանtե րlO ոl:երiաtոորնL!ո ժ tենյ otեժր[lանհ Liրlա Uրնորlրtենյ ոաiհն /անոtենանl:ե1հ tենյ/ ր'lllր'lերl

oո2ներրo հհԲրրհրiացL!ոtժ tենյ 2ա'lրlLiած գոնրiերրհ հl:եlրl i աUlյlենանl:ե1հ/

ն2արiրրL1ած նoո2ներրհ oարiհոգ[lա~հli Lljաlյlկl:ե[lQ

Նկ. 4.1. Սաուզերն բլոտ եղանակով ԴՆԹ-ի հիբրիդացման սխեման (https://senthilarivan.wordpress.com/2015/10/13/blotting-techniques/):

Սաուզերն բլոտ եղանակը հաջողությամբ կիրառվում է ԴՆԹ-ի շղթայում փնտրվող գեների լոկուսների բացահայտման համար: Այս եղանակով բացահայտվում է թե ԴՆԹ-ի որ հատվածում է գտնվում փնտրվող գենը, ապա որոշվում է ԴՆԹ-ի այդ հատվածի տեղը քրոմոսոմային ԴՆԹ-ի կազմում: Նույն եղանակով կարող են բացահայտվել նաև կետային մուտացիաները կամ ամբողջական գեների նուկլեոտիդային հերթականությունները և սահմանները: Հայտնի է, որ տարբեր մարդկանց քրոմոսոմային ԴՆԹ-ները տարբերվում են նուկլեոտիդային հերթականությունների պատահական պոլիմորֆիզմներով՝ SNP – single nucleotide polymorphisms:

R1 l.որոlաt 'luԹ

7~~....յ. .. _

R..1

u

.':.~9° գն

uորiuաt

~l°- Լ. ."_. . . .--.............տ9.?0 :(յ .

.-........... . _ րlարiհոաl!lրlհL! գոնրi 2

ՄոU1աUU1

'11'Թ..

_Rt .1.5.03 ~~--..-_-_-յ+~--- - -- 2500 գն Uգարոգայհն րiոնրiորո ներկLոոo t րրոo tl11til'ltiոoոlո

&

"" §-

Բtոl11t,Uգ

)

Uոնոո ր2ար1t,ոգոա:Բt,ա

c

ն

EԸo R1-ոlո կ1Ilր11Illոած ~ .§ 'll.,Թ-ն ենրարկLոոoր--=-----'Պ'--~'--,ljlր1[1l!1Lոած t t lր-t,: :jրրագoեն1I1 ներQ 'll.,Թ-ti կ րաoանlոոo :jրրագoեUl!1Uերt, են րորաoաերկարորյոնo 3 ներt, ն գն-ոlո ներկLոոo tրթti~tiոo րրոotiրiոlո

:,

C. C

ն

ն

i':

ՀDորi\նական ն UIյlաUրlար11յl նoոշներio նշարiրlոոo են 11արit,ոա1I1կ1I1t,Lո նշարiրերոlո, աlյ.lա UIIlացlոա lյ.lաl11կGր1Q նկարlոոo t

Նկ. 4.2. Սաուզերն բլոտ մեթոդի կիրառումը կետային մուտացիաների բացահայտման համար: Զոնդերի միացման կետերը նշված են նկարի վրա մուգ գծերով (http://www.docme.ru/doc/565332/experiments_id_0):

Մեկ երկու նուկլեոտիդի փոփոխությունը կարող է առաջացնել ռեստրիկտազային պոլինդրոմի փոփոխություն, որը հեշտությամբ

կբացահայտվի որպես ռեստրիկցիայից հետո ստացվող ֆրագմենտների կազմի փոփոխություն: Որպես օրինակ հետազոտենք այն դեպքը, երբ հետազոտվող ԴՆԹ-ի 4000 նուկլեոտիդներից կազմված հատվածը սահմանափակվում է EcoR1 ռեստրիկտազի պոլինդրոմներով: Եթե մուտացիայի արդյունքում դրա կազմում կառաջանա նոր պոլինդրոմ, հատվածը կբաժանվի մասերի: Քննարկվող դեպքում առաջանում են նոր՝ 2500 և 1500 նուկլեոտիդներից կազմված երկու ֆրագմենտներ: Էլեկտրաֆորեզից հետո, օգտագործելով հատվածի տարբեր սայտերի նկատմամբ կոմպլեմենտար երկու զոնդ՝ կարող ենք բացահայտել նոր պոլինդրոմի լոկուսը ԴՆԹ-ի շղթայի վրա (նկ. 4.2): Նոր թորամասերին հիբրիդացման ժամանակ միանում են սկզբնական հատվածի տարբեր սայտերում գտնվող հերթականությունների նկատմամբ կոմպլեմենտար զոնդերը, և այս եղանակով բացահայտվում է թորամասի հատվածի տեղը ԴՆԹ-ի շղթայի վրա և ուրեմն նաև մուտացիայի կետը: 4.1.1.

ԴՆԹ-ի հոմոլոգիկ հաջորդականությունների բացահայտում Սաուզերն բլոտինգի մեթոդով Առանձին որոշակի հաջորդականությունների հայտնաբերումը և

տեղակայումը թիրախ ԴՆԹ-ի մոլեկուլի վրա կատարվում է Սաուզերն Բլոտինգ մեթոդով, երկու փուլով. ա) Ռեստրիկտազներով տրոհված ԴՆԹ-ի հատվածները տարանջատվում են ագարոզային էլեկտրաֆորեզի միջոցով` ըստ դրանց մոլեկուլային կշիռների, բնափոխվում են, տեղափոխվում նիտրոցելյուլոզային ֆիլտրի վրա և ամրացվում: Ֆիլտրի վրա տեղափոխելիս պահպանվում են ռեստրիկցիոն հատվածների դիրքերը դոնդողի վրա: բ) Ֆիլտրի հետ կապված ԴՆԹ-ի հատվածները հիբրիդացվում են

P նիշակիր զոնդով և նկարահանումից հետո ռենտգեն ժապավե-

նի վրա ստացված պատկերում հայտնաբերվում են տվյալ զոնդին կոմպլեմենտար ԴՆԹ-ի բոլոր հատվածները:

Փուլ 1. ԴՆԹ-ի տեղափոխում ագարոզային դոնդողից նիտրոցելյուլոզային ֆիլտրի վրա Աշխատանքի ընթացքը. 1. Տրոհված ԴՆԹ-ն ենթարկել էլեկտրաֆորեզի` օգտագործելով 0,7 % ագարոզ և 0,5 մկգ/մլ էտիդիումի բրոմիդ պարունակող տրիսացետատային բուֆեր: Էլեկտրաֆորեզի ավարտից հետո դոնդողը լուսավորելով կարճալիք ուլտրամանուշակագույն լույսով նկարել: 2. Դոնդողը դնել պնակի մեջ, բնափոխել, ավելացնելով 250 մլ` 0,25 Մ HCl (սենյակային ջերմաստիճանի): Պարբերաբար թափահարել 15 րոպե: Գործողությունը կրկնել երկու անգամ: 3. Դոնդողը արագ ողողել ջրով: 4. Դոնդողը տեղափոխել 250 մլ` 0,25 Մ NaOH և 1,5 Մ NaCl լուծույթով պնակի մեջ: Թափահարել 15 րոպե: Գործողությունը կրկնել ևս մեկ անգամ: 5. Դոնդողը չեզոքացնել 500 մլ` 0, 5 Մ տրիս-HCl (pH=7,5) և 1,5 Մ NaCl լուծույթում (տրիս-HCl լուծույթը ստանալու համար 60 գ տրիս հիմքին ավելացնել 30 մլ խտացված HCl, H2O-ով հասցնել մինչև 1 լիտր, իսկ 1,5 Մ NaCl տվյալ լուծույթ ստանալու համար 1 լ H2O-ին ավելացնել 90 գ NaCl): Դոնդողը պահել սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում, զգուշորեն թափահարելով 30 րոպեի ընթացքում: 6. Դոնդողը տեղափոխել 250 մլ` 1 Մ նատրիումի ացետատի (pH=4,0) լուծույթի մեջ, պահել 30 րոպե: Կրկնել նատրիումի ացետատի թարմ լուծույթի մեջ: 7. Ֆերեգրամը լվանալ 0,1 Մ նատրիումի ացետատի (pH=4,0) մեջ, պահել 30 րոպե` NaCl-ի բարձր խտությունը հեռացնելու նպատակով: 8. Պլաստմասսե մեծ թիթեղի վրա դնել վատմանի 3 մմ թղթի թերթ, տեղադրել խորը մեծ էքսիկատորի մեջ, ավելացնել SSC բուֆեր, ապակե ձողիկով հեռացնել թերթի վրա գոյացած օդի պղպջակները: 9. Դոնդողը տեղափոխել վատման 3 մմ թղթի թերթի վրա` հակառակ կողմը դեպի վեր: Թղթի և դոնդողի միջև եղած օդի բոլոր պղպջակները հեռացնել:

10. Նիտրոցելյուլոզային ֆիլտրից կտրել դոնդողի չափսը 1-2 մմով գերազանցող մի կտոր (նիտրոցելյուլոզային ֆիլտրերի հետ աշխատել պինցետով և կրել ձեռնոցներ): 11. Ֆիլտրի թերթը դնել SSC (2x) լուծույթի մակերեսին, պահել այնքան, մինչև ներքևի երեսը ամբողջովին թրջվի, 2-3 րոպե ընկղմել լուծույթի մեջ: 12. Թաց ֆիլտրը դնել դոնդողի վրա և հեռացնել օդի պղպջակները: 13. Կտրել վատման 3 մմ թղթից դոնդողի չափսով 2 թերթ, թրջել H2O-ով կամ SSC (2x)-ով և տեղադրել ֆիլտրի վրա, օդի պղպջակները հեռացնել: 14. Կտրել քամիչ թղթի կամ թղթե սրբիչի 5-8 սմ բարձրությամբ մի դիզակ` վատման 3 մմ թերթից աննշան մաս, տեղադրել վերջինիս վրա: Այս ամենի վրա դնել 500 մգ ծանրություն (նկ. 4.3):

Նկ. 4.3. ԴՆԹ-ի նմուշը մեմբրանի վրա տեղափոխելու համար կատարվող աշխատանքների սխեման (http://www.docme.ru/doc/565332/experiments_id_0):

Սաուզերն բլոտինգի սխեմա: Այս գործողություններն անհրաժեշտ են հեղուկի շարժը դոնդողով և ֆիլտրով ապահովելու համար: Հեղուկի հետ ԴՆԹ-ի հատվածները դոնդողից անցնում են նիտրոցելյուլոզային ֆիլտրի վրա և ամրանում: 15. ԴՆԹ-ի տեղափոխումը տևում է 12-24 ժամ: Քամիչ թղթի կամ թղթե սրբիչի թրջված դիզակը պարբերաբար պետք է փոխարինել

չորով: ԴՆԹ-ի մանր հատվածներն անցնում են ֆիլտրի վրա 1-2 ժամում, իսկ 15 հզն և ավել չափսերի հատվածների տեղափոխումը տևում է ավելի քան 15 ժամ: 16. Հեռացնել քամիչ թղթի կամ թղթե սրբիչի դիզակը, ջրազրկված դոնդողը և ֆիլտրը շրջված վիճակում տեղափոխել չոր 3 մմ թղթի վրա: Շատ փափուկ մատիտով ֆիլտրի վրա նշել դոնդողի փոսիկները և եզրերը: 17. Դոնդողը հեռացնել, ֆիլտրը մշակել SSC (6x) լուծույթով սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում 5 րոպե: 18. Ֆիլտրը չորացնել վատման 3 մմ թղթի վրա: 19. Չոր ֆիլտրը դնել 3 մմ թղթի երկու թերթերի արանքում, տաքացնել 80 0C վակուումային վառարանում 2 ժամ: 20. Հիբրիդացման համար պատրաստ ֆիլտրը պահել 3 մմ թղթի երկու թերթերի արանքում վակուումում, սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում: Փուլ 2. Հիբրիդացում ֆիլտրերի վրա` Սաուզերն բլոտինգի մեթոդով Աշխատանքի ընթացքը. 1. Տաքացրած ֆիլտրը դնել դնել SSC (6x) լուծույթի մակերեսին, պահել, մինչև ներքևի երեսը ամբողջովին թրջվի, ապա ընկղմել լուծույթի մեջ 2-3 րոպեով: 2. Թաց ֆիլտրը դնել պոլիէթիլենի տոպրակի մեջ, ավելացնել մինչև 68 0C տաքացրած նախահիբրիդացման լուծույթ (տես հավելվածը): Լուծույթի քանակը կախված է ֆիլտրի չափսերից (0,2 մլ 1 սմ): 3. Օդը տոպրակից լիովին հեռացնել, տաքացնելով փակել բաց եզրը: Ինկուբացնել ջրային բաղնիքում՝ 2-4 ժամ 68 0C պայմաններում: 4. Տոպրակը բաղնիքից հանել, մի անկյունը կտրել, նախահիբրիդացման լուծույթը լիովին հեռացնել: 5. Տոպրակի մեջ լցնել հիբրիդացման լուծույթ` 50 մկլ 1 սմ2: Օդը զգուշորեն հեռացնել և տաքացնելով փակել:

6. Տոպրակը դնել ջրային բաղնիքի մեջ` 68 0C պայմաններում, հիբրիդացման ամբողջ ընթացքում (12-24 ժամ): 7. Տոպրակը հանել, արագորեն կտրել երեք կողմից, հանել ֆիլտրը, դնել SSC (2x)-ով և 0,5 % SDS-ով տաշտակի մեջ, սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում: 8. 5 րոպեից ֆիլտրը տեղափոխել մեկ այլ տաշտակի մեջ` SSC (2x) և 0,1 % SDS լուծույթով: Թեթևակի ճոճելով ինկուբացնել 2 ժամ, սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում: 9. Ֆիլտրը տեղափոխել SSC (0,1 x)-ով և 0,5 % SDS-ով պլաստմասսե սաղր տաշտակի մեջ, թեթևակի ճոճելով ինկուբացնել 15 րոպե, 68 0C պայմաններում: Ինկուբացիան շարունակել թարմ բուֆերում ևս 30 րոպե: 10. Ֆիլտրը չորացնել վատման 3 մմ թղթի վրա: 11. Ֆիլտրը փաթաթել Saran Wrap թաղանթի մեջ, դնել համապատասխան չափսի ռենտգեն ժապավենի վրա` ռադիոակտիվ պատկեր ստանալու համար: Փաթեթը դնել հատուկ տուփի մեջ և պահել մի քանի ժամից մինչև մի քանի օր: 12. Ժապավենը հանել և կոնդենսատի գոյացումից խուսափելու համար անմիջապես նկարել: Հիշեցում. 1. Բոլոր գործողությունները կատարել ձեռնոցներով: 2. Լվացման ոչ մի փուլում թույլ չտալ, որպեսզի ֆիլտրը չորանա: 4.1.2.

Դոտ հիբրիդացման մեթոդ

Այն դեպքերում, երբ անհրաժեշտություն է առաջանում հետազոտվող ԴՆԹ-ի նմուշում բացահայտել որոշակի հերթականություն, օգտագործվում է Դոտ հիբրիդացման մեթոդը: Առանձնացված, մաքրված ու բնափոխված ԴՆԹ-ն անմիջապես ամրացնում են ցելյուլոզային մեմբրանին, ապա հիբրիդացնում նշադրված զոնդերի հետ: Առաջացած ազդակը ֆիքսվում է համապատասխան սարքերով: Դոտ հիբրիդացումը ունի առավելություններ դետեկցիայի այլ եղանակների նկատմամբ, քանի որ ապահովում է հարուցիչների

անմիջական ախտորոշման արդյունավետ հնարավորություն: Այն դեպքերում, երբ ախտորոշման մյուս մեթոդները ճշգրիտ պատասխան չեն տալիս, դոտ հիբրիդացումը օգնում է բացահայտել հարուցչի ԴՆԹ-ն, ավելին, այս մեթոդը թույլ է տալիս տարբերակել պաթոգեն և ոչ պաթոգեն շտամերը: Ախտորոշման դոտ հիբրիդացում եղանակը չի պահանջում նմուշների պահման բարդ պայմաններ, կիրառվում է և այն դեպքերում, երբ հարուցիչն անկենսունակ է օրգանիզմից դուրս: Հիվանդության ախտորոշումը կարճ ժամկետում հաջող բուժման կարևորագույն պայմանն է, իսկ Դոտ հիբրիդացման եղանակով թեստավորման համար կարող է օգտագործվել անմիջականորեն հիվանդից ստացված նմուշը: Դոտ հիբրիդացման մեթոդը կիրառվում է ինչպես բակտերիաների և վիրուսների ՆԹ-ների բացահայտման համար, այնպես էլ լաբորատոր հետազոտություններում: Դոտ հիբրիդացման եղանակով արդեն ախտորոշվում են Salmonella, Campylobacter, Mycobacterium ցեղի պաթոգենները, մշակվել են զոնդեր Yersinia enterocolitica պաթոգեն շտամերի ախտորոշման համար: Վերջին տարիներին ախտորոշվող պաթոգենների ցանկն ընդլայնվել է, մշակվել և կիրառվում են զոնդեր ՁԻԱՎ-ի ախտորոշման համար:

4.2. ՀԻԲՐԻԴԱՑՈՒՄ ՆՈԶԵՐՆ ԲԼՈՏ ԵՂԱՆԱԿՈՎ

Նոզերն բլոտինգ (Northernblotting - հյուսիսային բլոտինգ) կոչվում է հիբրիդացման միջոցով ՌՆԹ-ների հետազոտման եղանակը: ՌՆԹ-ի շղթաները չեն կապվում սովորական նիտրոցելյուլոզային մեմբրանի հետ, այդ պատճառով դրանք ֆիքսելու համար սկզբնական շրջանում առաջարկվել էր օգտագործել նիտրոցելյուլոզի փոփոխված տարբերակը՝ ԴՄԲ-ցելյուլոզը, որը պարզապես դիազոբենզիլօքսիմեթիլավորված թուղթ է: Ավելի ուշ մշակվեց ՌՆԹ-ի շղթաները նիտրոցելյուլոզի հետ ոչկովալենտ կապերով միացման մեթոդը: ՌՆԹ-ի շղթաները նախապես բնափոխվում են՝ ՌՆԹ-ին բնորոշ ներմոլեկուլային երկշղթա հատվածները անջատվում են (նկ. 4.4): Բնափոխումը կատարվում է ԷՖ-ից առաջ կամ ԷՖ-ի փուլում: Այս նպատակով ՌՆԹ-ն մշակում են ֆորմալդեհիդով կամ դիմեթիլսուլֆօքսիդով:

21-('

·~

.. ' ,

i; -• . /'

1-l

;

•• Ը IԾ ftl♦ t,I U· C ն •

C •·•

1,1

l • Պ H ll t •ե.:ՇU• N•::;\oՊ'

,o~-,

e

Նկ. 4.4. Տարբեր տեսակի ՌՆԹ-ների մոլեկուլների տարածական կազմության սխեմաները (https://ppt-online.org/330816, https://slide-share.ru/stroenie-isvojstva-rnk-132102, https://slide-share.ru/stroenie-i-svojstva-rnk-132102):

Նոզերն բլոտի կատարման ընթացքը չի տարբերվում սաուզերն բլոտի ընթացքից (նկ. 4.5): Այստեղ նույնպես օգտագործվում են բազմանուկլեոտիդային բնույթի նշադրված զոնդեր: Մեթոդը կիրառվում է գեների էքսպրեսիայի մակարդակի որոշման և մուտացիաների բացահայտման համար: Օրինակ՝ տարբեր օրգաններում և հյուսվածքներում տարբեր գեներ էքսպրեսավորվում են տարբեր ինտենսիվությամբ, ավելին, տարբեր հյուսվածքներում նույն գենից ընթերցված հկ-ՌՆԹ-ները հասունանում են տարբեր եղանակներով, արդյունքում ձևավորվում են տարբեր ի-ՌՆԹ-ներ: Գեների ակտիվությունը և տրանսկրիպցիայի ինտենսիվությունը տարբեր հյուսվածքների բջիջներում փոփոխվում են նաև օնտոգենեզի ընթացքում: Այսպիսով՝ Նոզերն բլոտ մեթոդը կիրառվում է ի-ՌՆԹ-ների տրանսկրիպցիայի ակտիվության ու ինտենսիվության և օրգանիզմի հասունացման փուլայնության ուսումնասիրություններում: Նման հետազոտությունները հնարավորություն են տալիս ուսումնասիրել օրգանիզմ372

ների աճի և զարգացման պրոցեսները օնտոգենեզի տարբեր փուլերում և առանձին գեների դերը այդ պրոցեսներում:

Նկ. 4.5. Նոզերն բլոտ հետազոտության սխեման (http://www.docme.ru/doc/565332/experiments_id_0):

Գեների ակտիվության մակարդակը և ի-ՌՆԹ-ների սինթեզի ինտենսիվությունը կարող են կիրառվել նաև ուռուցքային փոփոխությունների բացահայտման համար, քանի որ այս դեպքում նորմալ և հիվանդ բջիջներում առաջանում են գեների ակտիվության տարբերություններ: Բոլոր դեպքերում կիրառվում է ի-ՌՆԹ-ի բաժանված և բացահայտված թորամասերի որակական և քանակական որոշում:

4.3. ՀԻԲՐԻԴԱՑՈՒՄ ՎԵՍՏԵՐՆ ԲԼՈՏ (EASTERN BLOT) ԵՂԱՆԱԿՈՎ

Վեստերն բլոտ եղանակը կոչվում է նաև իմունոբլոտ և մշակվել է սպիտակուցների բացահայտման համար: Մեթոդը ստեղծվել է Բազելի համալսարանի Հարրի Տոբինի լաբորատորիայում 1979 թ., բայց Վեստերն անվանվել է երկու տարի անց՝ որպես Սաուզերն և Նոզերն բլոտերի սպիտակուցային տարբերակ: Մեթոդը շատ արագ ստացել է լայն տարածում և մինչ այժմ հիշատակվել է գիտական աշխատանքներում ավելի քան 400 000 անգամ: Վեստերն բլոտը երբեմն անվանում են իմունոբլոտ, և հաճախ այն կիրառվում է մոլեկուլային գենետիկայի և իմունոգենետիկայի բնագավառներում արյան և հյուսվածքների նմուշներում յուրահատուկ սպիտակուցների բացահայտման համար: Կենսաքիմիական հետազոտություններում վեստերն բլոտ մեթոդը կիրառվում է առանձին սպիտակուցների և դրանց հետտրանսլյացիոն մոդիֆիկացիաների բացահայտման համար: Մեթոդը

նաև լայնորեն կիրառվում է հարուցիչների բացահայտման և դրանց ախտորոշման համար: Մեթոդի հիմքում ընկած է սպիտակուցային մոլեկուլների՝ միմյանց հետ փոխազդելու երևույթը, որը պայմանավորված է դրանց կազմակառուցվածքային առանձնահատկություններով և բացահայտվում է որպես ՀՄ-ՀԾ իմունային ռեակցիա: ՀԾ-ՀՄ մոլեկուլների կապը կովալենտ չէ և պայմանավորված է էլեկտրաստատիկ, Վան դեր Վալսի, ջրածնային և հիդրոֆոբ փոխազդեցություններով, որոնք ձևավորում են իմունային համալիրներ (ՀՄ-ների և ՀԾ-ների կազմակառուցվածքի և փոխազդեցության մասին կարդալ Լ.Մ. Մելքոնյանի «Անասնաբուժական գենետիկա» դասագրքի 21.6 և 21.7 բաժիններում): Որպես փորձնական նմուշ վերցվում են բոլոր տեսակի կենսաբանական տարրերը՝ հետազոտվող անձանց հյուսվածքները, օրգանիզմում արտադրված հեղուկները, կենսաբանական բնույթի այլ օբյեկտներ: Հյուսվածքները քայքայվում են և մշակվում ֆոսֆատազների ու պրոտեազների ինհիբիտորներով, որոնք պահպանում են սպիտակուցները սեփական ֆերմենտների ազդեցությունից: Բոլոր աշխատանքները կատարվում են ցածր ջերմաստիճանի պայմաններում: Սպիտակուցների ախտորոշումը իրականացվում է դրանց համապատասխանող հակածինների միջոցով, այդ պատճառով մեթոդը կոչվում է նաև իմունոբլոտինգ: Վեստերն բլոտ մեթոդում միավորված են էլեկտրաֆորեզի և հիբրիդացման եղանակները, որոնց շնորհիվ հետազոտվող սպիտակուցները նախ բաժանվում են առանձին թորամասերի, ապա հիբրիդացվում համապատասխան իմունաակտիվ սպիտակուցների հետ: Սպիտակուցների բաժանումը դոնդողային էլեկտրաֆորեզի (ԷՖ) միջոցով կատարվում է դրանց իզոէլեկտրական կետի (pI), մոլեկուլային զանգվածի, էլեկտրական լիցքի կամ մի քանի գործոնների օգտագործմամբ: Գործոնի ընտրությունը պայմանավորված է սպիտակուցների նախնական մշակման եղանակով: ԷՖ փուլը օգտագործվում է ինչպես տարբեր սպիտակուցների առանձնացման համար, այնպես էլ տարբեր հակամարմինների միջև

փոխադարձ ակտիվությունը չեզոքացնելու նպատակով: ԷՖ-ից հետո սպիտակուցները տեղափոխվում են սովորական թղթի կամ PVDF վրա, որտեղ կատարվում է սպիտակուցների բլոտինգը յուրահատուկ հակամարմիներով՝ ՀՄ-ներով: Ընդհանուր առմամբ հետազոտությունը կատարվում է 4 փուլերով. 1. Սպիտակուցի թորամասերի բաժանում SDS-PAGE էլեկտրաֆորեզի եղանակով: 2. Թորամասերի տեղափոխում մեմբրանի վրա: 3. Մեմբրանի չեզոքացում: 4. Դետեկցիա՝ սպիտակուցների բացահայտում կամ որոշում: 1. SDS (դոդեցիլ սուլֆատ) պարունակող պոլիակրիլամիդային դոնդողում SDS-PAGE ԷՖ-ի ժամանակ սպիտակուցները պահպանվում են դենատուրացված վիճակում (երկրորդային և երրորդային կառուցվածքի հեռացումից հետո), որի շնորհիվ բացասական լիցք ստացած մոլեկուլները բաժանվում են թորամասերի մոլեկուլային քաշի տարբերության համաձայն (Laemmli, 1970, [email protected]): Սպիտակուցները շարժվում են դոնդողի պոլիակրիլամիդային ցանցով դեպի դրական էլեկտրոդ՝ անոդ: Տարբեր քաշի սպիտակուցային մոլեկուլները շարժվում են տարբեր արագությամբ: Նմուշների հետ զուգահեռ թեստավորվում են նաև ստուգիչ շղթաները: Դրանց տարբեր թորամասերը ներկված են տարբեր ներկանյութերով և դոնդողի վրա առաջացնում են գունավոր բծեր: Փորձնական նմուշների շարժի արագությունը պոլիակրիլամիդային դոնդողում համապատասխանում է դրանց մոլեկուլային զանգվածին. թեթև մոլեկուլները շարժվում են ավելի արագ: Ինչքան ավելի բարձր է ակրիլամիդի խտությունը, այնքան ավելի հստակ է կատարվում թորամասերի բաժանումը առանձին բծերի: Բարձր մոլեկուլային զանգված ունեցող սպիտակուցների համար օգտագործվում են դրանց հստակ բաժանումը ապահովող ակրիլամիդի ցածր խտություններով դոնդողներ, որոնց խոռոչների չափսերը չեն խոչընդոտում խոշոր մոլեկուլների շարժը էլեկտրական դաշտում և ապահովում են դրանց բաժանումն ըստ մոլեկուլային զանգվածի:

Փորձի սկզբում հետազոտվող նմուշները ներդրվում են դոնդողի փոսիկների մեջ, ապա միացվում է էլեկտրական հոսանքը, որի ազդեցությամբ սպիտակուցային մոլեկուլները շարժվում են էլեկտրական դաշտում և բաժանվում թորամասերի (տես գլուխ 2): 2. Սպիտակուցների բաժանված թորամասերը տեղափոխվում են նիտրոցելյուլոզային կամ պոլիվինիլիդենդիֆտորիդի (PVDF) մեմբրանի վրա՝ այնպես, որ պահպանվի դրանց դիրքային պատկերը դոնդողի վրա: Այդ նպատակով մեմբրանը դրվում է դոնդողի վրա, իսկ դրա վրա դարսվում է ֆիլտրաթուղթ: Սովորաբար տեղափոխման համար օգտագործվում է ձգող էլեկտրական հոսանք, ուստի մեթոդը կոչվում է էլեկտրաբլոտինգ: Խոնավ միջավայրում սպիտակուցները տեղափոխվում են մեմբրանի վրա: Մեմբրանների նյութերը օժտված են բարձր հիդրոֆոբ հատկություններով, որոնց շնորհիվ տեղափոխվող սպիտակուցները կապվում են դրանց մակերեսին էլեկտրական կամ հիդրոֆոբ ուժերի ազդեցությամբ: Մեմբրանի մակերեսին կապված սպիտակուցները ունակ են մասնակցել տարբեր ռեակցիաների: Տեղափոխումը կոչվում է Blotting (ծծանում): Տրանս-բլոտ Turbo համակարգի կիրառումը արագացնում է բլոտինգի ընթացքը. 2 ժամի փոխարեն այն տևում է 7 րոպե: Ներկելով մեմբրանը Coomassie Brilliant Blue կամ Ponceau S ներկանյութերով՝ կարելի է վերահսկել տեղափոխման արդյունավետությունը (նկ. 4.6): 3. Մեմբրանի չեզոքացում: Մեմբրանի կպչուն մակերեսը կարող է կապել դետեկցիայի համար օգտագործվող ՀՄ-ները և դրանով առաջացնել արդյունքների շեղում: Այս վտանգը չեզոքացվում է մեմբրանի մակերեսը հատուկ նյութերով՝ ցուլի 3-5 %-անոց շիճուկային ալբումինի (BSA) կամ յուղազրկված չոր կաթի տրիսբուֆերային լուծույթով մշակման միջոցով: Սովորաբար լուծույթը պարունակում է նաև լվացող նյութեր՝ դետերգենտներ (Tween 20 կամ Triton X-100): Լուծված սպիտակուցները կապում են տեղափոխված սպիտակուցներից ազատ մեմբրանի մակերեսները և, լինելով չեզոք հակամարմնի նկատ376

մամբ, չեն փոխազդում դրա հետ: Այսպիսով բացառվում է կեղծ դրական արդյունքների ստացման վտանգը: ~հlU1(1այհU յoոLl"lfo tL t:;կո11ա~ո11t:;զ '1ոuրiորi Ul::iliրf)աU

L

.1.

- r

-

MiX ՊՀ,(

u2աL1Lլաo մt:;նրflաU 2-nri ՀU

.. = P."\ - ...

1-հu ՀU u11րi1ոu12

-

-·

Նկ. 4.6. Վեստերն բլոտի փուլերի սխեման. 1 - մոլեկուլային զանգվածի նշադիրներ, 2 - հետազոտվող նմուշ (https://yandex.ru/images/search?from=tabbar&text=%D0%B2%D0%):

4. Դետեկցիա՝ սպիտակուցների բացահայտում: Չեզոքացումից հետո մեմբրանը 3 անգամ լվացվում է բուֆերով, ապա հետազոտվող սպիտակուցը որոշվում է դետեկցիայի եղանակով: Դետեկցիայի համար առաջնային ՀՄ-ի 0,5-5 մկգ/մլ խտությամբ բուֆերային լուծույթը, որի կազմում առկա է 3-5 % ցուլերի շիճուկային ալբումին (BSA) կամ յուղազրկված չոր կաթի սպիտակուցներ, ինկուբացվում է նախապատրաստված մեմբրանի հետ: Ինկուբացիան կարող է տևել 30 րոպեից մինչև մի քանի ժամ: Ինկուբացիայի ջերմաս377

տիճանի բարձրացումը արագացնում է յուրահատուկ և ոչ յուրահատուկ կապերի առաջացումը: Ինկուբացիայից հետո չմիացած առաջնային ՀՄ-ների հեռացման համար մեմբրանը մի քանի անգամ լվացվում է բուֆերային լուծույթով, ապա մշակվում որևէ նշադրի հետ կապված երկրորդային ՀՄ-ով: Կոլորիմետրիկ դետեկցիայի դեպքում որպես 2-րդ ՀՄ-ի նշադիր հաճախ օգտագործվում է ծովաբողկի պերօքսիդազը, այլ դեպքերում կարող են օգտագործվել նաև հիմնային ֆոսֆատազ կամ գալակտոզիդազ ֆերմենտները: Օգտագործվող ֆերմենտը և դրան համապատասխանող սուբստրատը ընտրվում են փորձում օգտագործվող տարրերին համապատասխան: Ֆերմենտը փոխազդում է լվացված ժապավենի վրա ավելացվող սուբստրատի հետ և փոխում դրա գույնը: Դետեկցիայի մեթոդները նույնպես տարբեր են և համապատասխանում են նիշի բնույթին: Կարող են օգտագործվել քեմալյումինիսցենտոմետրիան, ֆլուորոմետրիան, սպեկտրոֆոտոմետրիան և այլն: Քեմիլյումինիսցենտ նշադիրը առաջացնում է լուսային ազդակ: Ազդակի ինտենսիվությունը համապատասխանում է նմուշում առկա ՀԾ-ի քանակին, քանի որ ֆերմենտի խտությունը խցիկում համապատասխանում է ՀԾ-ի և ֆերմենտի հետ կապված ՀՄ-ների խտությանը (նկ. 4.7): Լյումինիսցենտ ազդակների դետեկցիայի համար մեմբրանի դիմաց դրվում է լուսազգայուն ֆոտոժապավեն և լույսի ազդեցությամբ դրա վրա բացահայտվում են ՀՄ-ների դասավորմանը համապատասխանող լուսային զոլեր: Նույն նպատակով օգտագործվում են ChemiDoc MP տիպի դետեկտորներ, որոնց CCD խցիկը շատ զգայուն է և ճշգրիտ ֆիքսում է լույս արձակող զոլերը: Համակարգչային ծրագիրը վերլուծում է ստացված ազդակները և որոշում հետազոտվող նմուշների որակական կազմն ու խտությունը նմուշում:

Հարոtglt, Հ0-uերt, t!ե րiոuրiորiti ljրա

Ը:.

յ.յ . =-.:i

i:::::>

Ը:..

5 Մ ·: 3 .i::. 3 3 -.:, Ը:. s ... .:::r ··

Cl.

Շ:

~" Ց .§ ....

.)եյ

..:յ .......

Ը:: Ը::

Հ:l

+

+

+ Հն-uերt, ոերiաtյ,ոtuոul ՔՄDF ljրա

&+

+

Նկ. 4.7. Վեստերն բլոտ մեթոդով սպիտակուցների ախտորոշման սխեման (https://ppt-online.org/534298):

Ներկայացվող մեթոդը լայնորեն կիրառվում է ինչպես կիրառական բժշկությունում և անասնաբուժությունում, այնպես էլ գիտական հետազոտություններում բջջի և տեսակների գենետիկական, կենսաքիմիական և ֆիզիոլոգիական հետազոտություններում, հիվանդությունների մոդելավորման և հետազոտման աշխատանքներում, ուռուցքային և ներքին օրգանների բարդ հիվանդությունների բուժման համար ստեղծված դեղամիջոցների թեստավորման գործընթացում և այլն: 4.3.1. Վեստերն բլոտի օգտագործումը ՁԻԱՎ-ի բացահայտման համար Այժմ ՁԻԱՎ-ի նախնական թեստավորման համար հիմնականում օգտագործվում են ԻՖՎ՝ իմունաֆերմենտային հետազոտությունը կամ բլոտինգը: Վերջնական ախտորոշումը կատարվում է Վեստերն բլոտի, իմունաֆերմենտային անուղղակի ռեակցիայի կամ ՊՇՌ-ի եղանակով: Մարդկանց մոտ ախտորոշվում են ՁԻԱՎ-ի երկու տեսակներ՝ ՁԻԱՎ 1 և ՁԻԱՎ 2: Հետազոտություններում բացահայտվել են վիրուսների ամեն տարատեսակին բնորոշ հակածինների նկատմամբ արտա379

դրվող հակամարմինների խմբեր: Այսպես՝ ՁԻԱՎ 1-ի դեպքում հիվանդների արյան պլազմայում բացահայտվում են թաղանթային (env) - gp160, gp120, gp41, կորիզային (gag) - p17, p24, p55 և ֆերմենտային (pol) - p31, p51, p66 սպիտակուցների նկատմամբ ակտիվ ՀՄներ: ՁԻԱՎ 2-ի դեպքում բացահատվում են թաղանթային (env) gp140, gp105, gp36, կորիզային (gag) - p16, p25, p56, ֆերմենտային (pol) - p68 սպիտակուցների նկատմամբ ակտիվ ՀՄ-ներ: ՁԻԱՎ 1-ի ախտորոշման դեպքում հետազոտվում է gp41, gp120, gp160-ի նկատմամբ արտադրվող ՀՄ-ների առկայությունը, իսկ ՁԻԱՎ 2-ի դեպքում՝ gp36, gp105, gp140 նկատմամբ ակտիվ ՀՄ-ների առկայությունը: Առողջապահության համաշխարհային կազմակերպության պահանջների համաձայն՝ վարակման դեպքում պետք է բացահայտվեն թաղանթային սպիտակուցներից առնվազն երկուսը, այլ կերպ արդյունքը չի համարվում ճշգրիտ, հիվանդություն չի արձանագրվում, և պահանջվում են կրկնակի հետազոտություններ: Սովորաբար դրանք կրկնվում են 3-6 ամիս անց: Վարակված անձանց մոտ այս ժամկետում բացահատվող հակամարմինների քանակը պետք է աճի, դիտվում է իմունային համակարգի ակտիվացում նաև օտարի այլ տարրերի նկատմամբ: Դրական ռեակցիան gag և pol սպիտակուցների նկատմամբ, երբ բացակայում է env-ի նկատմամբ ակտիվությունը, կարող է նշանակել, որ օրգանիզմում ձևավորվել է ոչ յուրահատուկ արձագանք, կամ վարակումը նոր է տեղի ունեցել, հնարավոր է նաև, որ առկա է ՁԻԱՎ 2 տիպի ինֆեկցիա: Հետազոտման համար նախապես մաքրված և քայքայված ՁԻԱՎ-ի մասնիկների տարրերը ենթարկվում են էլեկտրաֆորեզի: Նմուշի հակածինները բաժանվում են թորամասերի մոլեկուլային զանգվածի համաձայն: Բլոտինգի եղանակով ՀԾ-ները տեղափոխվում են նիտրոցելյուլոզային մեմբրանի վրա և մշակվում ՀՄ-ներով: Վեստերն բլոտի եղանակով կատարված հետազոտության արդյունքների մեկնաբանման օրինակը ներկայացվում է նկար 4.8-ում:

Էքսպրես հետազոտության դեպքում նիտրոցելյուլոզային մեմբրանը մշակվում է թիրախ նմուշով: Եթե դրա կազմում առկա են հետազոտվող ՀԾ-ները, դրանք կապվում են մեմբրանին ամրացած յուրահատուկ ՀՄ-ներին: Հետագա փուլերում կատարվում է դրանց դետեկցիան և հիվանդության ախտորոշումը (նկ. 4.8):

-160J P66 -

ր

8fա

ր55 - կ1

pօl

l

ր31

p18 -

1. րացահայոilt.1

t :եեր!-'UL!.

կ

2.ցր1ծ0-ո! LL1աոLոանոոLitiց հենո' արոր12 3. ~tiաlո 1-o կանկաoե1ti t. աոljա t ~ր-ULI 2 կ Liանկաoե1ti արiրնոՇրյi հնրարա Lյ.որi t ոjյորiահաոոlj ոեաljցtյա 5. Բացանաljանր ր1ոո ոեաljցtյա, ~1-'ULL- o րացա ոLոոLi t

Նկ. 4.8. Վեստերն բլոտինգի եղանակով ՁԻԱՎ-ի ախտորոշման սխեման (https://present5.com/vtoric hnye-immunodeficity-vichspid-lekciya-9-vtorichnyeimmunodeficity/):

Վեստերն բլոտինգ հետազոտական մեթոդը կիրառվում է մոլեկուլային կենսաբանության, կենսաքիմիայի, գենետիկայի բնագավառներում կատարվող ուսումնասիրություններում: Մեծ է դրա նշանակությունը առողջապահության բնագավառում: Այս եղանակով ախտորոշվում են ՁԻԱՎ-ը, Լայմի հիվանդությունը, Helicobacter Pylori-ն, Էպշտեյն Բարի վիրուսը: Գենետիկական հետազոտություններում մեծ է գեների ակտիվության և արդյունավետության գնահատման խնդիրը, որը կարևոր է ինչպես գիտական, այնպես էլ կիրառական՝ հիվանդությունների առաջացման պատճառների ախտորոշման գործում: Ներկայացվող երեք

մեթոդների՝ Սաուզերն, Նոզերն և Վեստերն բլոտերի համեմատական պատկերը բացահայտում է հիբրիդացման մեթոդների օգտագործման արդյունավետությունը գեների ակտիվության և տրանսկրիպցիայի և տրանսլյացիայի ինտենսիվության մակարդակի գնահատման գործում (նկ. 4.9):

____l,_Q__yր__ ~ 1 8 lյր _,(22..!ո

ր - -~ H

- ~ր

գեն_x

-, 7րՊ' 8

H

րոtlոնոtl

ij

tlոնրթ .lՄՄՄՄՄՄՄՄՄՄ 2 ,1 կԲ t.կո[tն-կե1.կո~-_ L- 7 0 0 աtljlUայՀIյՀlոL . X գենjl X գենjl Utlրոր12ական Xգենjl աtlրորյ.2. աtlրորյ.2ածնե11 ոն,թ Lկրոոեtiն

Uաոգեր ն

ն ոյՀlերlն

X գl:iնt, 'lula-լ!

X գl:iնt, ljնula-լ!

Liենոերն 1.կ11ոոեtiնti հակաtlա11tljlն

x

Նկ. 4.9. Սաուզերն, Նոզերն և Վեստերն բլոտ մեթոդների նմանությունները և առանձնահատկությունները (http://www.docme.ru/doc/56533 2/experiments_id_0):

Նկարում պատկերված են ԴՆԹ-ի որոշակի գենի, դրանից ընթերցված ի-ՌՆԹ-ի և սինթեզված սպիտակուցի չափսերը և կազմությունը: Ներկայացված է հետազոտության արդյունքների համեմատական պատկերը: Քանակական վերլուծությունը թույլ է տալիս գնահատել նաև գեների ակտիվության և հետագա փուլերի ինտենսիվության մակարդակները:

4.3.2. Իմունոբլոտինգ՝ իմունաֆերմենտային վերլուծություն, ԻՖՎ (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) Վեստերն բլոտինգի հիման վրա ստեղծված տեխնոլոգիաները լայն կիրառություն են գտել ախտորոշիչ բժշկությունում և դարձել հարուցիչների ախտորոշման արագ ու արդյունավետ մեթոդներ: Իմունային ռեակցիայի՝ ՀՄ-ՀԾ սպիտակուցների յուրահատուկ փոխազդեցության վրա հիմնված մեթոդները ապահովում են նմուշում առկա ՀԾ կրող հարուցչների ճշգրիտ ախտորոշում: Մինչ այժմ չի մշակվել ԻՖՎ-ների տարբեր մեթոդների միասնական դասակարգում, ինչի պատճառով դրանց հետևողական համեմատական ուսումնասիրություն և գնահատում չի կատարվել: Բոլորի կողմից ընդունված դասակարգման միակ սկզբունքը կապված է ռեակցիայի պրոցեսի միա- կամ երկֆազային կատարման հետ: Եթե ամբողջ պրոցեսը կատարվում է հեղուկ միջավայրում, ռեակցիան հոմոգեն է, եթե որոշ փուլերում օգտագործվում է պինդ մակերես՝ հետերոգեն: Հետերոգեն ԻՖՎ-ն կոչվում է նաև պինդ ֆազային: Հոմոգեն ԻՖՎ-ն կատարվում է անմիջականորեն նույն միջավայրում, և կատարման փուլերը չեն անջատվում միջանկյալ լվացման գործընթացով: Հոմոգեն եղանակը սովորաբար կիրառվում է փոքրամոլեկուլային նյութերի բացահայտման համար: ԻՖՎ-ի առաջին քայլը «ճանաչման» փուլն է, երբ հետազոտվող սպիտակուցը ճանաչվում է յուրահատուկ ՀՄ-ով: Քանի որ իմունային համալիրները ձևավորվում են ՀՄ-ի և ՀԾ-ի հավասար քանակների միջև, առաջացած իմունային համալիների քանակը հավասար է հետազոտվող ՀԾ-ի քանակին: Նշադրված թեստային ՀՄ-ն կոչվում է կոնյուգատ, իսկ նմուշում առկա ՀԾ-ն՝ հետազոտվող, անալիտ, անալիտի հետ կապվող նպատակային նյութը՝ լիգանդ: Նշադիրը հեշտ բացահայտվող և անալիտի քանակի որոշման համար ներմուծվող նյութ է: Կոնյուգատի քանակը և ակտիվությունը պետք է ընտրվեն օպտիմալ յուրաքանչյուր տվյալ ՀԾ-ի դեպքում:

ԻՖՎ-ի մեթոդներն ըստ հետազոտման եղանակի բաժանվում են երկու խմբի՝ մրցակցային և ոչմրցակցային: Այս եղանակների նմանությունները և տարբերությունները կքննարկվեն ավելի ուշ: Նշենք, որ բժշկաբանական և գիտական հետազոտությունների համար առավել հաճախ կիրառվում է ոչմրցակցային եղանակը: Սովորաբար ախտորոշումը կատարվում է 96 խցիկ պարունակող միկրոտիտրային պլանշետների վրա: Խցիկների հատակը տափակ է (նկ. 4.10):

Նկ. 4.10. ԻՖՎ-ի համար օգտագործվող 96 խցիկանոց պլանշետ (https://www.abcam.com/protocols/sa ndwich-elisa-protocol-1):

ՀՄ-ները և ՀԾ-ները կապվում են պլանշետի հատակին մի քանի եղանակներով. 1. Ագարոզային դոնդողը մշակվում է այնպես, որ կապի սպիտակուցները, և դրանով մշակվում է խցիկի հատակը: 2. Խցիկի հատակին ամրացվում են երկաթի օքսիդից կազմված մագնիսային նանոմասնիկներ, որոնք, շնորհիվ մակերեսային NH2 կամ COOH ֆունկցիոնալ խմբերի, կապում են սպիտակուցները: 3. Պլանշետները պատրաստվում են բարձր հիդրոֆոբ հատկություններով օժտված պոլիստերոլից, որը կապում է սպիտակուցները: Երբեմն պոլիստերոլին կապում են ստրեպտովիդին, իսկ ՀՄ-ների Fc ծայրին՝ բիոտին, որի շնորհիվ ձևավորվում է ամուր կապ: Ամեն մի խցիկում կատարվում է առանձին ինքնուրույն ռեակցիա: Այս եղանակով կարող են ուսումնասիրվել հիվանդներից ստացված նմուշները և հարուցիչներ պարունակող այլ տարրերը:

Հոմոգեն հետազոտության եղանակներից մեկը՝ սերոլոգիկ տեստը, կատարման տեսակետից ամենահասարակներից է: Այս դեպքում հետազոտության համար որպես թիրախ օգտագործվում են այն բջիջները, որոնց թաղանթային ՀԾ-ների հետազոտությունը նախատեսվում էր: Հեմոլիտիկ տեստի օրինակ է էրիթրոցիտների թաղանթի վրա գտնվող արյան խմբերի ՀԾ-ների որոշումը: Փորձի համար մաքրված էրիթրոցիտների 2,5 % լուծույթները բաշխվում են պլանշետների խցիկների մեջ և հետազոտվող ՀԾ-ին համապատասխանող ՀՄների հետ, ապա թափահարվում և դրվում կուլտիվացման ջերմապահարանում: Կուլտիվացման առաջին փուլից հետո գնահատվում է յուրաքանչյուր խցիկում կատարված փոխազդեցության ինտենսիվությունը: ՀՄxՀԾ փոխազդեցությունը պետք է առաջացնի էրիթրոցիտների թաղանթի քայքայում և խցիկի լուծույթի գունավորման փոփոխություն: Այն դեպքում, երբ ՀՄxՀԾ հանդիպում չի եղել, այսինքն՝ էրիթրոցիտի թաղանթի վրա հետազոտվող ՀԾ բացակայում է, ռեակցիա չի կատարվում և ամբողջական էրիթրոցիտները իջնում են նստվածք՝ առաջացնելով խիտ օղակաձև մարմին: Արյան խմբերի որոշումը բժշկական պրակտիկայի կարևորագույն և ամենատարածված հետազոտություններից մեկն է, և դրա նշանակությունը դժվար է գերագնահատել: Ամեն մարդու, իսկ վերջին տասնամյակներում նաև տոհմային կենդանու համար որոշվում են արյան խմբերը և գրանցվում դրանց անձնագրերում:

4.3.3. Ոչ մրցակցային ԻՖՎ-ի եղանակները Վերջին տասնամյակներում մշակվել են ոչ մրցակցային ԻՖՎ-ի մի շարք եղանակներ, որոնք ամեն առանձին դեպքում ընտրվում են հետազոտությունում դրված խնդիրներին հանապատասխան, այդ թվում՝ ԻՖՎ, որոնք ուղղված են ՀԾ-ների բացահայտմանը, և ԻՖՎ, որոնք ուղղված են ՀՄ-ների բացահայտմանը: Երկու դեպքում էլ հետազոտությունների կատարման ամենատարածված եղանակներն են՝ - ուղղակի ԻՖՎ, - անուղղակի ԻՖվ, - սենդվիչ ԻՖՎ: 4.3.3.1. Ուղղակի ELISA ԻՖ-վերլուծություն Ուղղակի ԻՖվ-ի դեպքում թիրախ նյութի բացահայտումը կատարվում է ախտորոշողի հետ անմիջական փոխազդեցության եղանակով: Նշադրված ՀՄ-ը փոխազդում է թիրախ ՀԾ-ի հետ և ձևավորվում է իմունային համալիր, որի մշակումը սուբստրատով առաջացնում է դրա գունավորման փոփոխություն: Փորձը կատարվում է բազմափուլ եղանակով: 1. Հետազոտման ենթարկվող նյութը նմուշի կազմում ներմուծվում է ադհեզիվ հատկություններով օժտված պլաստիկ խցիկի մեջ: Խցիկի հատակին ամրացված ադհեզիվ նյութի շնորհիվ հետազոտվող ՀԾ-ն կապվում է խցիկի հատակին: Հարուցիչների ախտորոշման դեպքում այդպիսի նյութ են դրանց բնորոշ յուրահատուկ ՀԾ-ները: Չկապված տարրերի հեռացման համար խցիկը երեք անգամ լվացվում է բուֆերով: 2. Հաջորդ փուլում խցիկի մեջ ավելացվում է ցուլի 3-5 %-անոց շիճուկային ալբումինի (BSA) կամ յուղազրկված չոր կաթի տրիսբուֆերային լուծույթ, որոնց կազմի սպիտակուցները չեզոք են ՀԾ-ների նկատմամբ և կապվում են պլաստիկ հատակի չկապված մակերեսին: Ներմուծվող ՀՄ-ները չեն փոխազդում չեզոք սպիտակուցների հետ և

չեն շեղում ռեակցիայի նպատակային ընթացքը: Խցիկը լվացվում է ավելորդ նյութերի հեռացման համար: 3. Երրորդ փուլում խցիկի մեջ ավելացվում է հետազոտվող ՀԾին համապատասխանող ՀՄ, այսինքն՝ իմունաբանական նյութ, որը հարուցվող օրգանիզմը արտադրում է հարուցչի որոշակի ՀԾ-ի դեմ: Ներմուծվող ՀՄ-ները կապված են սուբստրատը գունավորող ֆերմենտի հետ: Խցիկում իրար համապատասխանող ՀԾ-ների և ՀՄ-ների միջև առաջանում է իմունային կապ և ձևավորվում ՀԾ-ՀՄ համալիր: Չկապված ՀՄ-ները հեռացվում են լվացման եղանակով: 4. Վերջին՝ ախտորոշման փուլում փորձնական խցիկ է ավելացվում գունափոխվող սուբստրատ: Եթե վերոհիշյալ համալիրը առկա է խցիկում, ֆերմենտը կապվում է սուբստրատի հետ, և սուբստրատի գույնը փոխվում է: Գունափոխումը ապացուցում է փնտրվող ՀԾ-ի առկայությունը նմուշում: Այն դեպքում, երբ անհրաժեշտ է որոշել ՀԾ-ի խտությունը նմուշում, պլանշետը հետազոտվում է սպեկտրոֆոտոմետրի օգնությամբ, որը գնահատում է գունավորման ինտենսիվությունը: Քանի որ ֆերմենտի քանակը խցիկում համապատասխանում է իմունային համալիրների քանակին, իսկ գունավորման ինտենսիվության մակարդակը պայմանավորված է սուբստրատի վրա ազդող ֆերմենտի խտությամբ, դրա մակարդակը բացահայտում է հետազոտվող ՀԾ-ի խտությունը նմուշում: ԻՖԱ-ի ներկայացված տարբերակը կոչվում է ուղղակի, քանի որ փորձի ընթացքում կատարվում է հետազոտվող ՀԾ-ի անմիջական միաքայլ ախտորոշում: Փորձի փուլերը ներկայացված են նկար 4.11ում:

t>:j)Ll-ր ո1111աl.յր ոա17րl:i17աlj

t>'.եLl-ր ա(ոtf1f1աljր ոա17րl:i17աlj

_J

l

U 2ակոն'i

1 1-ti ՀU l

'.)եգոQացոն'i

/ ,· .. /

ոtրi11ա~ti ~ րi.եU1եկցրա 1-tiu

UtնU1ոյ1ո2ոնl

..:__; 1 ժաt'i

--l

ՀU

2-1111- ՀU

_.-!-

!

~

LlրնU1ոյ1ո2ոt'i կ,5ժաt'i

Նկ. 4.11. ԻՖՎ վերլուծության ուղղակի և անուղղակի տարատեսակների համեմատական պատկերը (https://microbeonline.com/indire ct-fluorescent-antibody-ifa-test/):

Ուղիղ ԻՖՎ վերլուծության եղանակով կարող են հետազոտվել նաև ՀՄ-ների առկայությունը և խտությունը փորձնական նմուշում: Ուղիղ ԻՖՎ-ի երկու տարբերակների համեմատական սխեման ներկայացվում է նկար 4.12-ում:

ՀO +կրերl tlե նոո

~ ~+

Նկ. 4.12. 1-ին տարբերակ՝ ՀԾ-ների բացահայտման սխեման ԻՖՎ-ի եղանակով: 2-րդ տարբերակ՝ ՀՄ-ների բացահայտման սխեման ԻՖՎ-ի եղանակով, փոփոխված (https://studfile.net/preview/3053831/page:3/):

ՀՄ-ների բացահայտման համար հետազոտվող նմուշը ներմուծվում է պլանշետի խցիկ և ինկուբացվում: Նմուշում առկայության դեպքում ՀՄ-ն կապվում է խցիկի հատակին: Հաջորդ փուլում խցիկ է ավելացվում ֆերմենտով նշված կոմպլեմենտար ՀԾ: ՀՄ-ՀԾ ռեակցիայի արդյունքում ձևավորվում է խցիկի հատակին կապված իմունային համալիր, որը չի հեռացվում հերթական լվացման արդյունքում: Սուբստրատը ավելացնելուց հետո կատարվում է գունափոխում, որը և գրանցվում է դիտարկումներով ու սարքերով: 4.3.3.2. Անուղղակի ELISA ԻՖ-վերլուծություն Անուղղակի ԻՖՎ-ի դեպքում է 1-ին փուլում հետազոտվող ՀԾ-ն կապվում է խցիկի հատակին, 2-րդ փուլում դրանք մշակվում են ՀԾ-ին յուրահատուկ 1-ին ՀՄ-ով: Առաջանում են իմունային համալիրներ: Հաջորդ փուլում խցիկի մեջ ավելացվում են նշադրված և 1-ին ՀՄ-ի նկատմամբ սպեցիֆիկ 2-րդ ՀՄ-ներ: Այսպիսով՝ ախտորոշվում են խցիկում արդեն առկա իմունային համալիրները: Փորձը կատարվում է բազմափուլ եղանակով: Այս տարբերակում նշադրված ՀՄ-ն փոխազդում է ոչ թե թիրախ, այլ միջանկյալ նյութի հետ, որը նախապես կապվել էր թիրախին (նկ. 4.9): 1. Հետազոտվող ՀԾ նմուշի կազմում ներմուծվում է ադհեզիվ հատկություններով պլաստիկ խցիկի մեջ: Պլաստիկի ադհեզիվ հատկության շնորհիվ հետազոտվող ՀԾ-ն կապվում է խցիկի հատակին: Հարուցիչների ախտորոշման դեպքում այդպիսի նյութ են դրանց բնորոշ յուրահատուկ ՀԾ-ները: Չկապված տարրերի հեռացման համար խցիկը երեք անգամ լվացվում է բուֆերով: 2. Հաջորդ փուլում խցիկի մեջ ավելացվում են ցուլի 3-5 %-անոց շիճուկային ալբումինի (BSA) կամ յուղազրկված չոր կաթի տրիսբուֆերային լուծույթներ, որոնց կազմի սպիտակուցները չեզոք են ՀԾ-ների նկատմամբ և կապվում են պլաստիկ պատերի չկապված մակերեսին: Այսպիսով՝ չեզոքացվում է այլ սպիտակուցների ակտիվության հնարավորությունը: Խցիկը լվացվում է ավելորդ նյութերի հեռացման համար:

3. Երրորդ փուլում խցիկի մեջ ավելացվում է հետազոտվող ՀԾին համապատասխանող 1-ին ՀՄ, այսինքն՝ իմունաբանական նյութ, որը հարուցվող օրգանիզմն արտադրում է հարուցչի որոշակի ՀԾ-ի դեմ: ՀԾ-ի և ՀՄ-ի միջև առաջանում է կապ, և ձևավորվում է ՀԾ-ՀՄ համալիր: Չկապված ՀՄ-ները հեռացվում են լվացման եղանակով: 4. Ախտորոշման փուլում խցիկում առաջացած ՀԾ-ՀՄ համալիրը ախտորոշելու համար խցիկ է ներմուծվում 1-ին ՀՄ-ն կապող 2-րդ ՀՄ, որը կապված է սուբստրատը գունավորող ֆերմենտի հետ: Սովորաբար օգտագործվում է պերօքսիդազ ֆերմենտը: Խցիկում ձևավորվում են ՀԾ-ՀՄ1-ՀՄ2-ֆերմենտ տարրերից կազմված համալիրներ: Խցիկը լվացվում է չկապված տարրերի հեռացման համար: 5. Վերջին՝ դետեկցիայի փուլում փորձնական խցիկ է ավելացվում գունափոխվող սուբստրատ: Եթե վերոհիշյալ համալիրը առկա է խցիկում, ֆերմենտը կապվում է սուբստրատի հետ, և սուբստրատի գույնը փոխվում է: Գունափոխումը ապացուցում է փնտրվող ՀԾ-ի առկայությունը նմուշում: Այն դեպքում, երբ անհրաժեշտ է որոշել ՀԾ-ի խտությունը նմուշում, պլանշետը հետազոտվում է սպեկտրոֆոտոմետրի օգնությամբ, որը գնահատում է գունավորման ինտենսիվությունը և հաշվարկում ՀԾ-ի խտությունը: ԻՖՎ-ի ներկայացված տարբերակը կոչվում է անուղղակի դասական, քանի որ խցիկում փորձի սկզբում կապվում են հետազոտվող ՀԾ-ները: Այժմ մշակվել են նաև ախտորոշման այլ տարբերակներ, որոնք ընդլայնում են հետազոտման հնարավորությունները և բարձրացնում ճշգրտության աստիճանը: Անուղղակի ԻՖՎ-ի կատարման համար անհրաժեշտ նյութերը և սարքերը. 1. Ջերմապահարան 2. Սառցարան 3. Ջրի թորիչ սարք 4. Պլանշետները լվացող սարք՝ վոշեր 5. Սպեկտրոմետր կամ ԻՖՎ ընթերցող սարք

6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18.

Ցենտրիֆուգա Լաբորատոր ամանեղեն Ավտոմատ պիպետներ, պիպետների հանվող ծայրեր և այլն Միկրոպլանշետներ Հետազոտվող նմուշ Ֆոսֆատային-աղային բուֆեր PBS Ծածկող բուֆեր Ռեագենտը նոսրացնող բուֆեր BSA Լվացման բուֆեր Կապող ՀՄ-ների լուծույթ Դետեկտավորող ՀՄ-ների լուծույթ Սուբստրատ և ստոպ լուծույթ Ստուգիչ լուծույթներ՝ դրական, բացասական, կալիբրատորներ Փորձի կատարման ընթացքը ՀԾ-ի ադսորբցիա: 96 խցիկանոց պլանշետի խցիկների մեջ ներմուծում են 100 մկլ ֆոսֆատ-աղային բուֆերի (PBS) մեջ լուծված 0,1-0,5 հետազոտվող սորբենտ (рН=9,6): 30 րոպե ինկուբացնում են խառնուրդը պլանշետների հարիչի վրա սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում: Չկապված հակածինները հեռացվում են խցիկներից կրկնակի լվացումով: Լվացման համար օգտագործում է 150 մմ NaCl, 10 մմ Na2HPO4, 0,1 % Tween-20 պարունակող ֆոսֆատ-աղային բուֆեր՝ PBST (pH=9,0): 1. Խցիկի մակերեսի չեզոքացում: Խցիկի ՀԾ-ների հետ չկապված մակերեսների չեզոքացման նպատակով խցիկներ է լցվում (pH=9,0) ֆոսֆատ-աղային բուֆեր (PBS), որի կազմում առկա է ցուլի շիճուկային ալբումինի կամ որևէ այլ չեզոք սպիտակուցի՝ կազեինի, ժելատինի և այլնի 1 %-անոց լուծույթ: Ապա պլանշետը ինկուբացվում է 15 րոպե սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում: Խցիկը կրկնակի անգամ լվացվում է PBST բուֆերով՝ ավելորդ, չկապված նյութերի հեռացման համար: 2. Յուրահատուկ 1-ին ՀՄ-ների ներմուծում: Հետազոտվող ՀԾ-ի խտության բացահայտման համար ներմուծվող յուրահատուկ

ՀՄ-ի խտությունները տարբեր սյուներում կամ շարքերում պետք է լինեն տարբեր: Սկզբնական հայտնի խտության լուծույթի 1-10 մկգ ներմուծվում է, օրինակ, առաջին շարքի խցիկների մեջ: Երկրորդ շարքի խցիկների մեջ ներմուծվող լուծույթը նոսրացվում է երկու անգամ: Երրորդ շարքինը՝ էլի երկու անգամ, և այսպես մի քանի անգամ: Ապա պլանշետները ինկուբացվում են 30 րոպե հատուկ ճոճող սարքերի վրա սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում: Վերջում 1-ին ՀՄ-ի չկապված մնացորդների հեռացման համար խցիկները 2-3 անգամ լվացվում են PBST բուֆերով: 3. Ֆերմենտային նիշ կրող 2-րդ ՀՄ-ի ներմուծում: Որպես 2-րդ ՀՄ սովորաբար ընտրվում է ճագարների կամ այծերի պոլիկլոնալ ՀՄ-ներից, ոչ յուրահատուկ է, նշված է պերօքսիդազ ֆերմենտով: Ոչ յուրահատուկ իմունոգլոբուլինները ճանաչում են 1-ին ՀՄ-ի ամբողջ մոլեկուլը կամ դրա Fc-հատվածը: Փորձի համար օգտագործում են պատրաստի, որոշակի խտությամբ լուծույթներ: Ինկուբացիան կատարվում է սովորական եղանակով 30 րոպե: Ընդունված ֆերմենտային նշադիրը՝ ծովաբողկի պերօքսիդազը, օքսիդացնում է սուբստրատը ջրածնի պերօքսիդով: Որպես սուբստրատ օգտագործվում է О-ֆենիլենդիամինը՝ ՕՖԴ: Օքսիդացման արդյունքում ձևավորվում է ՕՖԴ-ի գունավորված օքսիդ: Սուբստրատի պատրաստման համար 0,1 Մ рН=4,5 Na-ցիտրատային բուֆերին ավելացվում է 0,01 մլ 30 %-անոց ջրածնի պերօքսիդ և 0,2 մլ ՕՖԴ (340 մգ ՕՖԴ լուծել 10 մլ էթիլային սպիրտում, պահել –20 ºС պայմաններում): Ինկուբացիան 100 մկլ սուբստրատի հետ կատարվում է 10 րոպե հորիզոնական թափահարիչի վրա սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում: 4. Ֆերմենտային ռեակցիայի ընդհատում: Օպտիկական ինտենսիվության մակարդակը որոշվում է այն պահին, երբ գունավորման ինտենսիվությունը հասնում է առավելագույնի: Ռեակցիայի արգելակիչ է H2SO4 թթուն: Օ-ֆենիլենդիամին (ՕՖԴ) պարունակող խցիկների մեջ ներմուծվում է 0,5 Մ ծծմբաթթվի 50-ական մկլ: Այս գործո392

ղությունից անմիջապես հետո ռեակցիան արգելակվում է, և կատարվում է օպտիկական խտության որոշումը: 5. Օպտիկական խտության որոշում: Օպտիկական խտությունը որոշվում է λ=490 նմ պայմաններում՝ պլանշետային սպեկտրոմետրով: Ուղղակի ԻՖՎ վերլուծության կատարման կարգը տարբերվում է անուղղակի վերլուծությունից նրանով, որ այս դեպքում 3-րդ փուլում օգտագործվում են յուրահատուկ նշադրված ՀՄ-ներ: 4-րդ փուլը բացակայում է, իսկ 5-րդ և 6-րդ փուլերը կատարվում են նույն կարգով: 4.3.3.3. ELISA ԻՖՎ վերլուծության սենդվիչ եղանակի կատարման կարգը Սենդվիչ եղանակը նույնպես բազմափուլ է և կատարվում է հետևյալ կարգով. 1. Առաջին ՀՄ-ի ադսորբցում խցիկի հատակին: 96 խցիկանոց պլանշետի ամեն մի խցիկ 100 մկլ ֆոսֆատաաղային (PBS) բուֆերի կազմում ներմուծվում է 1-2 մկգ ՀՄ: Ինկուբացիան կատարվում է պլանշետային հորիզոնական թափահարիչի վրա սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում 30 րոպե: Լվացումը կրկնվում է երկու անգամ և կատարվում է 0,1 % Tween-20 պարունակող ֆոսֆատաաղային (PBST) բուֆերով: 2. Խցիկի մակերեսի չեզոքացում: Խցիկի ՀՄ-ների հետ չկապված մակերեսների չեզոքացման նպատակով խցիկները լցվում են PBST-ով, ապա պլանշետը ինկուբացվում է 15 րոպե սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում: Խցիկը կրկնակի անգամ լվացվում է ֆոսֆատաաղային բուֆերով (PBST) ավելորդ և չկապված նյութերի հեռացման համար: 3. Պլանշետի խցիկ հետազոտվող ՀԾ-ների ներմուծում: Նախապես կապված ՀՄ-ներով խցիկների մեջ ներմուծվում են հետազոտվող լուծույթի 50 մկգ կամ ՀԾ-ի ստանդարտ նոսրացումներ պարունակող լուծույթներ: Լուծույթի հիմքը կազմում է PBST բուֆերը, որի

կազմի Tween-20 նյութը խոչընդոտում է ոչ յուրահատուկ կապերի առաջացումը և լուծույթի կազմի սպիտակուցների միջև և պլանշետի մակերեսի հետ կապի ձևավորումը: Փորձի ճշգրտության ստուգման նպատակով բոլոր նմուշները, և ստանդարտ լուծույթները ներմուծվում են 2-3 խցիկների մեջ: Ինկուբացիան կատարվում է թափահարիչի օգնությամբ 30 րոպե սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում: Հաջորդող լվացումը կատարվում է PBST բուֆերով և կրկնվում երեք անգամ: 4. Ինկուբացում ֆերմենտով նշված ՀՄ-ների հետ: Պլանշետի խցիկների մեջ ներմուծվում է 100 մկլ ֆերմենտով նշադրված յուրահատուկ ՀՄ-ների լուծույթ: ՀՄ-ների խտությունը լուծույթում նշում է արտադրողը, սովորաբար՝ 2-4 մկգ/մկլ: Ինկուբացիան նշադրված ՀՄ-ների հետ կատարվում է թափահարիչի օգնությամբ 30 րոպե սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում: Հաջորդող լվացումը կատարվում է PBST բուֆերով և կրկնվում 5-6 անգամ: 5. Գունավորող ֆերմենտային ռեակցիա: Ինկուբացիան 100 մկլ սուբստրատի հետ կատարվում է 10 րոպե հորիզոնական թափահարիչի վրա սենյակային պայմաններում: Սուբստրատի պատրաստման համար 0,1 Մ рН=4,5 Na-ցիտրատային բուֆերին ավելացվում է 0,01 մլ 30 %-անոց ջրածնի պերօքսիդ և 0,2 մլ ՕՖԴ (340 մգ ՕՖԴ լուծել 10 մլ էթիլ սպիրտում, պահել –20 ºС պայմաններում): 6. Ֆերմենտային ռեակցիայի ընդհատում: Օպտիկական ինտենսիվության մակարդակը որոշվում է այն պահին, երբ գունավորման ինտենսիվությունը հասնում է առավելագույնի: Ռեակցիայի արգելակիչ է H2SO4 թթուն: ՕՖԴ (Օ-ֆենիլենդիամին) պարունակող խցիկների մեջ ներմուծվում է 0,5 Մ ծծմբաթթվի 50-ական մկլ: Այս գործողությունից անմիջապես հետո ռեակցիան արգելակվում է, և կատարվում է օպտիկական ինտենսիվության որոշում (նկ. 4.13): 7. Օպտիկական խտության՝ ինտենսիվության որոշում: Օպտիկական խտությունը որոշվում է λ=490 նմ պայմաններում՝ պլանշետային սպեկտրոմետրի օգնությամբ:

Նկ. 4.13. Սենդվիչ տիպի ԻՖՎ-ի փուլերը (https://nplus1.ru/material/2021/12/14/ifa-tests-avivir):

ԻՖՎ-ի առավելություններն են՝ ճշգրտության բարձր մակարդակ (բացահայտում է նույնիսկ 0,05 նգ/մլ խտությամբ նյութերը), հետազոտվող նյութի աննշան քանակների օգտագործումը, բոլոր տարրերի կայունություն երկարատև պահման պարագայում, ռեակցիայի կատարման հեշտություն, սարքային և դիտարկումային դետեկցիայի հնարավորություն, օգտագործվող ռեակցիոն հավաքածուների հասանելի գներ, բոլոր պրոցեսների ավտոմատացման հնարավորություն: 4.3.4. Մրցակցային ԻՖՎ վերլուծություն Մրցակցային ԻՖՎ եղանակով կարող են հետազոտվել նմուշների ՀՄ-ները կամ ՀԾ-ները: Վերլուծությունը կատարվում է երկու՝ ուղղակի և անուղղակի եղանակներով: Ինչպես և ոչմրցակցային վերլուծությունը, մրցակցայինը նույնպես կատարվում է միկրոտիտրային պլանշետների վրա: Ըստ էության, այս վերլուծության հիմքում ընկած է կոնյուգատ ՀԾ-ների կամ ՀՄ-ների սահմանափակ քանակությունների օգտագործման սկզբունքը: Այս պայմաններում ռեակցիայի արդյունքում ձևավորվող ֆիքսված իմունային համալիրների քանակը և դրանցով արձակվող ազդակի ինտենսիվությունը հակառակ համաչափ են հետազոտվող անալիտի խտությանը: Ինչքան ավելի բարձր է հետազոտվող անալիտի խտությունը լուծույթում, այնքան ավելի քիչ

ֆիքսված իմունային համալիրներ են ձևավորվում և այնքան թույլ է ստացվող գունային ազդակը և հակառակը՝ ինչքան ցածր է անալիտի խտությունը, այնքան ավելի բարձր է նշադրված իմունային համալիրներինը, և ինտենսիվ է դրանցով առաջացվող գունային ազդակը: Մրցակցային ԻՖՎ վերլուծության հիմնական փուլը լուծույթում առկա հետազոտվող անալիտի և խցիկի պատերին և հատակին ամրացված կոնյուգատների մրցակցային միացումն է կոմպլեմենտար, որոշակի քանակությամբ օգտագործվող նշադրված ՀԾ-ի կամ ՀՄ-ի հետ: Ռեակցիայի լավագույն ընթացքը դիտվում է այն դեպքում, երբ թեստավորվող ՀՄ-ի կամ ՀԾ-ի խտությունը և նշադրված կոմպլեմենտար նյութի խտությունները մոտ են, գտնվում են նույն հաշվարկային շարքում: Մրցակցային ԻՖՎ մեթոդը կիրառվում է այն դեպքերում, երբ հետազոտվող տարրի խտությունը նմուշում շատ ցածր է և դժվար է որսվում այլ մեթոդների միջոցով: Նշենք, որ մրցակցային հետազոտման ընթացքում թիրախ տարրի համար ստեղծվում են ռեակցիային մասնակցելու արտոնյալ պայմաններ՝ հնարավորություն ավելի շուտ փոխազդել յուրահատուկ տարրի հետ, քան խցիկում ֆիքսված գործոնները, որի շնորհիվ դրանց փոխազդեցությունը անալիտի հետ լիարժեք իրականացվում է: Շնորհիվ այս հանգամանքի՝ հետազոտվող նյութը և որակապես է բացահայտվում, և հնարավորություն է ստեղծվում կատարել դրա քանակական գնահատում: Մրցակցային ուղիղ ԻՖՎ Ինչպես և ոչմրցակցային ուղիղ ԻՖՎ-ի դեպքում մրցակցային ուղիղ ԻՖՎ կատարվում է ընդամենը 2 փուլով: 1-ին փուլում միկրոխցիկի հատակին կապվում են թիրախ ՀՄ-ների նկատմամբ յուրահատուկ ՀԾ-ների որոշակի քանակ: 2-րդ փուլում խցիկ է ներմուծվում լուծույթ, որի կազմում առկա են նմուշը դրա կազմի թիրախ ՀՄ-ներով և նշադրված ոչ յուրահատուկ ՀՄ-ի սահմանափակ քանակ: Եթե հետազոտվող նմուշում առկա են թիրախ ՀՄ-ներ, դրանք կապվում են խցիկի ՀԾ-ներին: Ինչքան բարձր է դրանց խտությունը, այնքան մեծ թվով ՀԾ-ներ դրանք կկապեն: Այս իրավաճակը պայմանավորված է թիրախ ՀՄ-ների առաջնահերթ՝ մրցակցային առավե396

լությամբ՝ յուրահատկությամբ ՀԾ-ների նկատմամբ: Ֆիքսված ՀԾների ավելացած՝ չկապված մոլեկուլները կապում են նշադրված ներմուծվող ՀՄ-ները և ձևավորում խցիկում ֆիքսված իմունային համալիրներ: Կապված և նշադրված իմունային համալիրների քանակը, ինչպես տեսնում ենք, համապատասխանում է թիրախ ՀՄ-ով չկապված ֆիքսված ՀԾ-ների քանակին: Լվացումից հետո խցիկների մեջ ներմուծվում է սուբստրատը, որը փոխազդում է նշադրված ՀՄ պարունակող իմունային համալիրի նիշ-ֆերմենտի հետ և փոխում լուծույթի գույնը: Քանի որ նշադրված ՀՄ-ների քանակը իմունային համալիրներում հավասար է ազատ՝ յուրահատուկ թիրախ ՀՄ-ով չկապված ՀԾ-ների քանակին, ֆերմենտի խտությունը խցիկում ցածր է, ցածր է և գունավորման ինտենսիվությունը: (նկ. 4.14): Գունավորման ինտենսիվությունը և նշադրված իմունային համալիրների խտությունը որոշվում են հատուկ սարքերով և վերլուծվում համակարգչային ծրագրերով:

Y-արiյան ննո2~ ՀU-ներi O -հեU1ագոոկորi ՀU-tiն l.jոU1յ..1[եUեUU1արl © , 1· LI2արlր11ոաOՀU-ներ,

Նկ. 4.14. Մրցակցային ԻՖՎ-ի սխեման: ՀՄ-ի բացահայտման մրցակցային ուղղակի ԻՖՎ-ի սխեմա: Թիրախ և նշադրված ՀՄ-ները կապում են խցիկի ՀԾ-ները իրենց խտությունների հարաբերակցությանը համապատասխան (https://en.ppt-online.org/721073):

Ընդհանուր առմամբ մենք ունենք ռեակցիային մասնակցող գործոնների հետևյալ քանակական պատկերը. հայտնի է կապված ՀԾների և նշադրված իմունային համալիրների քանակը: Հետազոտվող թիրախ ՀՄ-ների հետ կապվել է ՀԾ-ների որոշակի մասը: Մնացած ՀԾ-ները կապվել են նշադրված ՀՄ-ների հետ և առաջացրել նիշի միջոցով բացահայտվող իմունային համալիրների որոշակի քանակ: Ուստի թիրախ ՀՄ-ների քանակը որոշվում է ՀԾ-ների ընդհանուր քանակի և բացահայտվող իմունային համալիրների քանակի տարբերությամբ:

Մրցակցային ԻՖՎ վերլուծությունը ֆիքսված ՀԾ-ների օգտագործման եղանակով Մրցակցային անուղղակի ԻՖՎ դեպքում 1-ին փուլում միկրոխցիկի հատակին կապվում են ոչ յուրահատուկ ՀԾ-ներ: 2-րդ փուլում խցիկ է ներմուծվում լուծույթ, որի մեջ հետազոտվող նմուշի կազմում կարող են լինել թիրախ ՀԾ-ներ: Ապա խցիկ են ավելացվում ՀԾ-ին յուրահատուկ չնշադրված ՀՄ-1-ի որոշակի սահմանափակ քանակ: Եթե լուծույթում առկա է հետազոտվող ՀԾ, կատարվում է իմունային ռեակցիա, և թիրախ ՀԾ-ի մոլեկուլները կապվում են յուրահատուկ ՀՄ1-ին: Առաջանում են լուծված իմունային համալիրներ: Այս ռեակցիան արտոնյալ է մրցակցային համակարգում, քանի որ ՀՄ-ները յուրահատուկ են լուծված ՀԾ-ների նկատմամբ, և դրանց միջև առաջանում է ամուր կապ: Ձևավորված լուծված իմունային համալիրների քանակը հավասար է նմուշի կազմում առկա հետազոտվող ՀԾ-ների քանակին: Բայց չնշադրված ՀՄ-ների չկապված մասը կարող է փոխազդել նաև ֆիքսված ոչնպատակային ՀԾ-ների հետ և առաջացնել խցիկում ֆիքսված իմունային համալիրներ: Ֆիքսված համալիրների քանակը հավասար է չնշադրված յուրահատուկ ՀՄ-ների և թիրախ ՀԾ-ների քանակների տարբերությանը: Երկրորդ փուլում խցիկ են ավելացվում նշադրված ոչ յուրահատուկ ՀՄ-ներ: Դրանց մի մասը կապվում է խցիկում ֆիքսված իմունային համալիրներին և նշադրում դրանք: Ռեակցիայի ավարտից հետո խցիկը լվացվում է, և դրանում մնում են միայն նշադրված ֆիքսված համալիրները: Սուբստրատի ներմուծումից հետո լուծույթը նիշ-ֆերմենտի ազդեցությամբ գունափոխվում է: Նշադրված իմունային համալիրների քանակը խցիկում հավասար է յուրահատուկ ՀՄ-ների և թիրախ ՀԾ-ների քանակի տարբերությանը: Գունավորման ինտենսիվությունը և ֆիքսված համալիրների խտությունը որոշվում են հատուկ սարքերով, ապա վերլուծվում համակարգչային ծրագրերով: Ռեակցիային մասնակցող տարրերի քանակական հարաբերությունը հետևյալն է. ֆիքսված ՀԾ-ների հետ առաջացվող համալիրների քանակը բացահայտվում է դետեկցիայի միջոցով: Յուրահատուկ ՀՄների քանակը հայտնի է: Քանի որ յուրահատուկ ՀՄ-ների որոշ մասը

գտնվում է ֆիքսված համալիրների կազմում, ապա թիրախ ՀԾ-ներին կապվել է այդ ցուցանիշների տարբերության մասը, որը և հավասար է թիրախ ՀԾ-ի քանակին: Մրցակցային ԻՖՎ վերլուծությունը ֆիքսված ՀՄ-ների օգտագործման եղանակով Մրցակցային ԻՖՎ-ի այս տարբերակը կիրառվում է այն դեպքերում երբ անհրաժեշտ է նմուշի կազմում հայտնաբերել թիրախ ՀԾ-ներ: Առաջին փուլում միկրոխցիկների հատակին կապում են թիրախ ՀԾ-ի նկատմամբ յուրահատուկ մոնոկլոնալ ՀՄ: Ապա խցիկների մեջ ներմուծում են նմուշը և ֆերմենտով նշված ՀԾ: Խառնուրդը ինկուբացվում է, ապա խցիկները լվացվում են: Եթե հետազոտվող նմուշում առկա է թիրախ ՀԾ, այն, մրցակցային սկզբունքի համաձայն, լինելով յուրահատուկ ֆիքսված ՀՄ-ի նկատմամբ առաջնահերթ կապվում է ՀՄ-ին ամուր կապով: Չկապված ՀՄ-ները փոխազդում են նշադրված ոչ յուրահատուկ ՀԾ-ների հետ: Այսպիսով՝ խցիկում ձևավորվում են հատակի հետ կապված երկու տիպի իմունային համալիրներ՝ թիրախ ՀԾ-մոնոկլոնալ x ֆիքսված ՀՄ և նշադրված-ՀԾ x ֆիքսված ՀՄ: Կատարվում է խցիկների լվացում չկապված տարրերի հեռացման համար: Հաջորդ փուլում խցիկների մեջ ներմուծվում է սուբստրատը, որը նշադրող ֆերմենտի ազդեցությամբ գունափոխում է լուծույթը (նկ. 4.15): Գունավորման ինտենսիվությունը պայմանավորված է իմունային համալիրների կազմում նշադրված ՀԾ-ների խտությամբ: Ռեակցիան արգելակում են գունավորման ինտենսիվության բարձրագույն կետում և կատարում գունավորման ինտենսիվության գնահատում ԻՖՎ-ռիդերի օգնությամբ: Ստացված արդյունքներով կալիբրային կորի վրա որոշում են թիրախ ՀԾ-ի խտությունը, որը հակառակ համաչափ է ֆերմենտի խտությանը և գունավորման ինտենսիվության մակարդակին:

կաl11կաOՀՄ•ր I, LiաU1կաoՀՄ

L

~ Qոնյայրն l.l.Qրlակր~

Մրցա~ցայ~~ l"'lոկ

>1աաա0 Հն-հհCաա1հo ,,~,կg,ա

Uնաlրlllր !Iյlllոti,յոն Uնաlրlllր !Iյlllոtiaյան

րարoրացո~Qաոllյ\1աց0ո~ t ագր)ակ~ ոԸ/ր Qljագո~

Նկ. 4.15. մրցակցային ԻՖՎ-ի եղանակով թիրախ ՀԾ-ների բացահայտման սխեման: Երկրորդ փուլում ներմուծվող թիրախ և նշադրված ՀԾ-ները փոխազդում են կապված ՀՄ-ների հետ և առաջացնում 2 տիպի համալիրներ: Լվացումից հետո՝ 3-րդ փուլում, դետեկցիային մասնակցում են միայն իմունային համալիրների կազմում առկա ֆերմենտով նշադրված տարրերը (https://rockland-inc.com/elisa.aspx?ref=driverlayer.com):

4.3.4.1. Մրցակցային ուղղակի ԻՖՎ-ի կատարման կարգը 1. Միկրոտիտրային պլանշետի խցիկների մեջ ներմուծել 50 մկլ յուրահատուկ մոնոկլոնալ ՀՄ և կատարել ինկուբացում սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում՝ 4 ժամ, կամ 4 ºC պայմաններում՝ ամբողջ գիշերվա ընթացքում: 2. Չկապված մնացորդները հեռացնելու համար ինկուբացիայից հետո երկու անգամ խցիկները լվանալ PBS բուֆերով: 3. Խցիկի ներքին մակերեսի՝ ՀՄ-ով չզբաղեցված հատվածները կողմնակի միացումներից չեզոքացնելու համար մշակել արգելակող բուֆերով՝ 3 % BSA/PBS, և նատրիում ազիդի 0,02 % լուծույթով: Ապա մի քանի ժամ ինկուբացնել սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում: 4. Ինկուբացիայի ավարտից հետո ավելորդ նյութերի հեռացման համար խցիկները կրկնակի անգամ լվանալ PBS բուֆերով: 5. Խցիկների մեջ ավելացնել 50 մկլ նմուշի լուծույթ: Բոլոր նյութերը նոսրացնել արգելակող բուֆերով՝ PBST (3 % BSA / PBS с 0,05 % Tween-20):

6. Ավելացնել 50 մկլ ֆերմենտով նշված ՀԾ-ի լուծույթ: Խառնուրդը երկու ժամից ոչ պակաս ինկուբացնել սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում: 7. Պլանշետը չորս անգամ լվանալ PBS-ով: 8. Օպտիկական ինտենսիվության մակարդակը որոշվում է այն պահին, երբ գունավորման ինտենսիվությունը հասնում է առավելագույնի: Ռեակցիայի արգելակիչ է H2SO4 թթուն: ՕՖԴ (Օ-ֆենիլենդիամին) պարունակող խցիկների մեջ ներմուծվում է 0,5 Մ ծծմբաթթվի 50ական մկլ: Այս գործողությունից անմիջապես հետո ռեակցիան արգելակվում է, և ռիդերի օգնությամբ կատարվում է օպտիկական ինտենսիվության որոշում: 4.3.5. ԻՎ վերլուծությունների այլ եղանակները 1. ՌԻՎ մեթոդը ռաջին անգամ կիրառվել է ինսուլինի որոշման համար 1959 թ. (Р.С. Ялоу, С.А. Берсон): Որպես նշադիր օգտագործվել է I, իսկ որպես կոնյուգատի նշադիր՝ 125I ռադիոակտիվ յոդը: Վերլուծությունը կոչվեց ռադիոիմունային վերլուծություն՝ ՌԻՎ: Վերլուծության այս եղանակը հետերոգեն է և մրցակցային ու նախատեսում է չկապված տարրերի հեռացում ցենտրիֆուգման կամ պարզ լվացման եղանակով (նկ. 4.16): Վերլուծությունը խիստ յուրահատուկ է և զգայուն, ստացված արդյունքները՝ վստահելի: Ռադիոակտիվ ճառագայթման մակարդակը որոշվում է գամմա հաշվիչով: Իզոտոպների կիրառմամբ ՀՄ-ների և ՀԾ-ների բացահայտման համար ավելի ուշ՝ 70-ական թվականներին մշակվեց մեկ այլ եղանակ, որը կոչվեց իմունոռադիոմետրիկ վերլուծություն՝ ԻՌՄՎ: Արյան նմուշում ալերգեն յուրահատուկ IgE-ի բացահայտման նպատակով ալերգենները նախապես ֆիքսվում են խցիկի (թղթից, պոլիմերային ժապավենից, սպունգից) հատակին: Ապա ավելացնում են հիվանդի արյան շիճուկը և ինկուբացնում 3 ժամ: Այնուհետև խցիկը լվանում են և ավելացնում հակաալբումինային՝ հակա- IgE ռադիոակտիվ յոդով նշված շիճուկ:

2աlj'tiլ

Ծաfl~ոակUl~Lj ոiaյաU Uակաflflակ1!

• :Հ,--------' • Նկ. 4.16. ՌԻՎ մեթոդի փուլերի սխեման (http://biotech.city.tomsk.net):

Հաջորդ փուլում կատարում են խցիկի լվացում և հաշվիչի օգնությամբ ստուգում ռադիոակտիվ ճառագայթման մակարդակը (նկ. 4.17): Այս եղանակը այլ կերպ անվանում են ռադիոալերգոսորբենտային թեստ՝ ՌԱՍԹ: U~Liրրոtնց~lj~ հաոաlj~նյ .'.j)~րնաo ա[tiրգl::ենյ

,..-.ii

Ը:::ր ~

U1tրգեO յորահաtոո~ lցԲ արյա O ն~ծո~ո~

I •

· 000000

Նկ. 4.17. ՌԱՍՏ-ի կատարման սխեման (http://biotech.city.tomsk.net):

Ռադիոակտիվ նշադիրների օգտագործմամբ կատարվող հետազոտություններում ստացված արդյունքների ճշգրտության բարձր աստիճանը և արդյունավետությունը հիմք դարձան հետազոտական այս մեթոդի հետագա զարգացման համար: Սակայն ճառագայթող նյութերի օգտագործման վտանգի հաղթահարումը առաջնահերթ խնդիր էր, այդ պատճառով սկսվեց այլ նշադիրների որոնումը: ԻՖՎ ֆերմենտային նշադիրնով կատարվող վերլուծության մոդիֆիկացված տարբերակներ: Կարևորագույն նորույթներից մեկը՝ նշադրման համար ֆերմենտների օգտագործումը, առաջարկել են 1971 թվականին Շվեդիայի և Նիդերլանդների մի խումբ գիտնականներ (Е. Энгвалл, Р. Пелманн, Б. ван Вимен, А. Шюрс): Այս խմբին են պատկանում մինչ այժմ ներկայացված բոլոր հետերոգեն մրցակցային և ոչ մրցակցային մեթոդները: ԻՖՎ-ի կիրառման բնագավառները բազմազան են, և շնորհիվ հետազոտության հասանելիության բարձր աստիճանի, ստացված արդյունքների ճկունության և զգայունության բարձր մակարդակի՝ այն լայնորեն օգտագործվում է բժշկական պրակտիկայում և բազմաթիվ լաբորատոր աշխատանքներում՝ ինչպես ՀՄ-ների, այնպես էլ ՀԾ-ների, հորմոնների ու այլ ակտիվ սպիտակուցների բացահայտման համար: Նշենք, որ մեթոդի զգայունության բարձրացմանը նպաստում են մշտապես մշակվող նոր եղանակները և նոր նյութերի օգտագործումը: Օրինակ՝ ԻՖՎ-ի զգայունության աստիճանի բարձրացման համար, երբ անհրաժեշտ է բացահայտել հետազոտվող նյութի նվազագույն խտությունները, օգտագործվում են գունային ազդակի ինտենսիվությունը բարձրացնող մի շարք եղանակներ: Օրինակ՝ յուրահատուկ ՀՄները նշվում են բիոտինով, որը կապվում է բազմակենտրոն ավիդինին և առաջացնում ֆերմենտային նիշերի միացման բազմաթիվ կենտրոններ: Այսպիսով՝ հետազոտվող թիրախ ՀԾ-ի կամ ՀՄ-ի մեկ մոլեկուլը իմունային համալիրի կազմում կապվում է 20-25 ֆերմենտային նիշի հետ և առաջացնում սուբստրատի գունափոխման 25 անգամ ուժեղացված ազդակ (նկ. 4.18):

+ -

-

• ••

UlllflհUjlllակfl'ալյ Uttft'ltifյ PftոlllftCյ

l 2-ր,iՀlյ

Ptiոllltifյաglj_ա6

Ճ

I Uրiա2ftf.i _,,A...._ հակաilաfliltlfյ հ.յgflկt'I հաlllակ

Նկ. 4.18. Ցածր խտության ՀԾ-ների բացահայտում ավիդին-բիոտինային համալիրի օգտագործմամբ (https://www.researchgate.net/figure/Avidin-biotincomplex-method_fig3_51620447):

2. Իմունավերլուծություն ֆլուորեսցենտ նշադիրների կիրառմամբ: Իմունաֆլուորեսցենցիայի ռեակցիան՝ ԻՖՌ, առաջին անգամ առաջարկել է օգտագործել 1942 թ. Կումբսը: Մշակվել և կիրառվում են ՌԻՖ-ի ուղղակի և անուղղակի տարբերակները: Մեթոդները օգտագործվում են ինչպես օրգանիզմի արյան նմուշներում սեփական ՀՄների և ՀԾ-ների բացահայտման, այնպես էլ հարուցիչների ՀԾ-ների հայտնաբերման նպատակով: ԻՖՌ-ն բնութագրվում է բարձր հասանելիությամբ, ստացված արդյունքների մակարդակի ճշգրտությամբ և կատարման արագությամբ: Ռեակցիայում օգտագործվում են մոնո- և պոլիկլոնալ ՀՄ-ները, ֆլուորեսցենտ արձագանքը ապահովում է ֆլուորեսցինի իզոտիոցիանատը: Հարուցիչների արագ բացահայտման համար հիվանդից ստացված նմուշից առարկայական ապակու վրա պատրաստվում է պատրաստուկ, ֆիքսվում նմուշը որևէ նյութով (ացետոն, մեթիլային սպիրտ և այլն): Ֆիքսված պատրաստուկը մշակում են համապատասխան ՀՄներով: Փոխազդեցությունից հետո պատրաստուկը լվացվում է: Հաջորդ փուլում ավելացվում է մարդու իմունոգլոբուլինների հետ փոխ404

ազդող նշադրված ՀԾ-ների լուծույթը: Ձևավորված իմունային համալիրները կապվում են նշադրված ՀԾ-ների հետ, և լյումինիսցենտ մանրադիտակի տակ դիտվում է յուրահատուկ լուսարձակում: Մեթոդը շատ արդյունավետ է խոշոր հարուցիչների կամ մարդու փոփոխված բջիջների հետազոտման համար, բայց լյումինիսցենտ մանրադիտակի օգնությամբ մանր հարուցիչները դժվար են հետազոտվում: 1984 թ. առաջարկվեց ՌԻՖ-ի կատարման հետերոգեն սենդվիչ տարբերակ (R. Etkins, O. Wallac): Որպես նիշ այս դեպքում օգտագործվում էին լանտոնոիդների խելատները: Մեթոդը շատ զգայուն է և ճշգրիտ: Այս եղանակով աշխատում է ԱՄՆ-ի Perkin Elmer ֆիրմայում ստեղծված Delfia համակարգը, որի զգայունությունը հավասար է հետազոտվող նյութի 10-17 Մ խտության: 4.3.5.1. Էլիսպոտ (ELIspot) իմունաֆերմենտային բծերի մեթոդ՝ ԻԲ 1983 թ. հետերոգեն ԻՖ վերլուծության մեթոդի զարգացման արդյունքում մշակվել է նոր մեթոդ, որը թույլ է տալիս in vitro բացահայտել ՀՄ-ներ, ՀԾ-ներ, ցիտոկիներ և այլ կենսաակտիվ գործոններ, մեդիատորներ արտադրող լիմֆոցիտները: Որպես օրինակ հետազոտության թիրախ են ընտրվել ցիտոկիններ արտադրող T լիմֆոցիտները: Բջիջներում արտադրվող ցիտոկինների խումբը և դրանց խտությունը թույլ են տալիս որոշել T լիմֆոցիտների տարատեսակը՝ Th1, Th2 կամ Th3: Դրա հիման վրա որոշվում է օրգանիզմում ձևավորվող իմունային պատասխանի տեսակը և բացահայտվում է դրա զարգացման աստիճանը: Այս հետազոտությունները կարևոր են ալերգիաների, աուտոիմուն հիվանդությունների, փոխպատվաստային իրավիճակների, ուռուցքային հիվանդությունների ախտորոշման և բուժման ընթացքի վերահսկման համար: Հետազոտությունը կատարվում է Սենդվիչ եղանակով, բայց հետազոտվող ցիտոկինները արտադրում են ռեակցիայի մեջ ընդգրկված հետազոտվող բջիջները:

Տհlilոl.lհն յորiահաlilոi.l ՀU-նե րlհ աllրiացոնl tնցհ հաlilաljհն

~

Ah

y __ y

./t ո._, /յ

l(:,,~ՊՊ'" ~ա~ա~! ·~ .<ղ<'""''¥'

""'(I(>

"-

1. Պլանշետի բոլոր 96 խցիկների հատակին ֆիքսում են տարբեր ցիտոկինների նկատմամբ յուրահատուկ ՀՄ-ներ: 2. Նույն խցիկներում ցիտոկինների արտադրությունը գրգռող միջավայրում կուլտիվացվում են T լիմֆոցիտները: 3. T լիմֆոցիտները արտադրում են ցիտոկիններ, և խցիկում ֆիքսված յուրահատուկ ՀՄ-ները կապվում են ցիտոկինների հետ ու առաջացնում իմունային համալիրներ: 4. Հաջորդ փուլում խցիկների մեջ ներմուծվում են հետազոտվող ցիտոկինի նկատմամբ ակտիվ և ֆերմենտային նշադիր կրող յուրահատուկ ՀՄ-ներ: Նշադրված ՀՄ-ները կապվում են իմունային համալիրների հետ և խցիկներ ավելացվող չլուծվող սուբստրատը գունափոխվում է նիշեր պարունակող համալիրների

հարևանությամբ,

անցնում

նստվածք՝ առաջացնելով գունավորված բծեր (նկ. 4.19) Առանձին խցիկում միաժամանակ մի քանի ցիտոկին բացահայտելու նպատաՆկ. 4.19. ԻԲ մեթոդի կատարման սխեման: (https://en.pptonline.org/348534):

կով ստեղծվել և օգտագործվում են տարբեր գույների բծեր առաջացնող սուբստրատներ:

4.3.5.2. Իմունահյուսվածքային կամ իմունաբջջային քիմիական մեթոդ՝ ԻՀՔՄ ԻՀՔ մեթոդը թույլ է տալիս բացահայտել ՀՄ-ները, ՀԾ-ները կամ այլ ակտիվ նյութերը անմիջապես դրանց բնական տեղում, նորմալ կամ պաթոլոգիկ փոփոխված բջիջներում կամ հյուսվածքներում: ԻՀՔՄ-ն կատարվում է in situ, այսինքն՝ անմիջապես բջջային կամ հյուսվածքային պատրաստուկների վրա՝ ԻՖՎ մեթոդով: Արդյունքում չլուծվող ներկանյութով գունավորված թիրախ սպիտակուցը բացահայտվում է էքսպրեսիայի վայրում և ախտորոշվում լուսային մանրադիտակով: Աշխատանքը կատարվում է հետևյալ փուլերով. 1) նմուշի ստացում կամ անջատում, 2) հյուսվածքային կամ բջջային պատրաստուկի պատրաստում, 3) պատրաստուկի ֆիքսում, 4) նշադրված կոնյուգատի ներմուծում, 5) ստացված արդյունքների ուսումնասիրություն, նկարահանում և վերլուծություն: Մեթոդի կիրառությունը ընդլայնում է մորֆոֆիզիոլոգիական հետազոտությունների հնարավորությունները, թույլ է տալիս ավելի ճշգրիտ հասկանալ ուռուցքների աճի, զարգացման և մետաստազների առաջացման մեխանիզմները, հետազոտել դրանց փոփոխման աստիճանը (նկ. 4.20):

Liրցրագtրi~~ ոաոցր~ հjոtUtjաOjlայ~U lljաlրlրանոո~: ՔՇNՃ

Հն-~

ացահաոtlանյ նjնttlանյ

Նկ. 4.20. 1 - ԻՀՔՄ-ի կատարման սխեման (https://studfile.net/preview/3053831/page:7/), 2 - կրծքագեղձի ուռուցք առաջացնող ՀԾ-ի բացահայտումը հյուսվածքի բջիջներում (https://studfile.net/preview/1473771/page:5/):

Բացի օնկոլոգիական հետազոտություններից՝ ԻՀՔ մեթոդը կիրառվում է նաև որոշ վարակիչ ու աուտոիմուն հիվանդությունների բացահայտման, արյան և գլխուղեղի բջիջների ֆենոտիպավորման և այլ գիտական հետազոտություններում: 4.3.5.3. ԻՖ վերլուծության հոմոգենային մեթոդները Հոմոգենային մեթոդները կատարվում են մեկ ֆազային՝ հեղուկ միջավայրի պայմաններում, մրցակցային եղանակով և չեն պահանջում առաջացող համալիրների մեխանիկական անջատում: Փորձի կատարման այս եղանակի դեպքում ՀՄ-ները զուգահեռ փոխազդում են հետազոտվող անալիտի և նշադրված ՀԾ-ների հետ: Իմունաքիմիական համալիրի ձևավորումից հետո կատարվում է ֆերմենտային ազդեցությամբ առաջացող գունային փոփոխություն, որը չափվում է և օգտագործվում անալիտի խտության որոշման համար: Կիրառվող մեթոդներից մեկը EMIT վերլուծությունն է (enzyme monitored immunoassay technique): EMIT վերլուծությունը հիմնվում է իմունային համալիրների ձևավորման արդյունքում ֆերմենտային ակտիվության փոփոխման երևույթի վրա: Սովորաբար նոր կապը առաջացնում է ակտիվության նվազում, որը պայմանավորված է ֆերմենտի տարածական կազմության փոփոխությամբ, որոշ դեպքերում ֆերմենտի ակտիվությունը բոլորովին արգելակվում է ֆերմենտի ակտիվ կենտրոնների անհասանելի դառնալու պատճառով: Մեթոդի առավելություններից է դրա արագությունը՝ տևում է ընդամենը մի քանի րոպե: Թերություններից կարևորագույնը ճշգրտության ցածր աստիճանն է: 4.3.5.4. Լյումինիսցենտ իմունային վերլուծություն՝ ԼԻՎ Արդեն 70-ական թվականներից սկսած լյումինիսցենտ նյութերը օգտագործվում են որպես նշադիր ԻՖ վերլուծություններում: Ժամանակակից մեթոդները թույլ են տալիս կիրառել լյումինիսցենցիան ՀՄ-ների և ՀԾ-ների նշադրման համար: Որպես նշադիր, սովորաբար, օգտագործվում են կենսա- կամ քեմալյումինիսցենտ ռեակցիայի տարրերից մեկը՝ կոֆակտորները, կատալիզատորները, ֆերմենտները

կամ սուբստրատները: Լյումինիսցենտ ռեակցիաները դասվում են դեզօքսի գործընթացների շարքին, որոնց ընթացքում առաջանում են կարճ ապրող, գրգռված, անկայուն նյութեր: Կայուն վիճակի վերականգնման ընթացքում արձակվում է ալիքների որոշակի երկարությամբ լույսի ազդակ, որը հեշտությամբ ճանաչվում և կլանվում է հատուկ սարքերի՝ ֆոտոբազմապատկիչների, ֆոտոդետեկտորների կողմից: Ռեակցիան կատարվում է հետևյալ սխեմայով. ՀԾ+ՀՄ-լյումինոֆոր=ՀԾ-ՀՄ-լյումինոֆոր +hν (ֆոտոն) ԼԻԱ մեթոդի առավելությունն են դրա անկախությունը լույսի արտաքին աղբյուրից, լայն դինամիկ միջակայքը, ճշգրիտ քանակական արդյունքների ստացման հնարավորությունը, բարձր զգայունությունը: Տարբերում են լյումինիսցենտ վերլուծության երկու եղանակ՝ կենսալյումինիսցենտ և քեմալյումինիսցենտ: Կենսալյումինիսցենտ վերլուծություն Ռեակցիոն խառնուրդի կազմում առկա են ԱԵՖ կամ NAD կոֆակտորները, որպես սուբստրատ օգտագործվում է լյուցիֆերին նյութը, իսկ ֆերմենտը՝ լյուֆիցերազն է: Հնարավոր են ռեակցիայի երկու տարբերակներ՝ լյումինիսցենտ իմունագործոնային վերլուծություն՝ ԼԻԳՎ, կամ լյումինիսցենտային իմունաֆերմենտային վերլուծություն՝ ԼԻՖՎ: Ընդհանուր առմամբ այս եղանակները բնութագրվում են բարձր ճկունությամբ և հարմար են հոմոգենային վերլուծություններում կիառելու համար: Միակ թերությունը ռեագենտների բարձր ինքնարժեքն է: Քեմիլյումինիսցենտ վերլուծություն Քեմալյումինիսցենտ վերլուծության համակարգում ընդգրկվում են սուբստրատը, օքսիդացնող նյութը և ֆերմենտ-կատալիզատորը: Քեմալյումինիսցենտ իմունաֆերմենտային վերլուծություն՝ ՔԻՖՎ:

Որպես նշադիր օգտագործվում են պերօքսիդազ կամ միկրոպերօքսիդազ ֆերմենտները, սուբստրատի համար՝ լյուցիֆերինը և լյումինալը: Մեթոդի զգայունության մակարդակը հավասար է ՀԾ-ի 10-13 Մ, իսկ փորձի տևողությունը՝ 30 րոպե: 4.3.6. ԻՖՎ-ի արդյունքների դետեկցիա ԻՖՎ տիպի հետազոտությունների խնդիրը ՀՄ-ների և ՀԾ-ների որակական և քանակական որոշումն է: Որակական ախտորոշումը կատարվում է ռեակցիայի նշադիրների կիրառման և դրանց ազդեցությամբ առաջացող ազդակների դիտարկման կամ սարքավորումների օգնությամբ գրանցման միջոցով: Հետազոտման միջոցները համապատասխանում են օգտագործվող նշադիրների բացահայտման և գրանցման մեթոդներին: Ընդհանուր առմամբ օգտագործվող նշադիրները ոչ միայն բացահայտում են թիրախ գործոնի առկայությունը, այլ հաճախ ուժեղացնում ձևավորվող ազդակը, դարձնում այն ըմբռնելի հետազոտվող տարրի ցածր խտության դեպքում: Նշենք, որ հետազոտման մեթոդների բարելավումը և անվտանգության բարձրացումը շարունակական է և իրականացվում է մեթոդների կիրառման ամբողջ ընթացքում: Այս հարցում մեծ նշանակություն ունեն նշադրման համար օգտագործվող բազմազան գործոնների կիրառման նորանոր եղանակները: Թիրախ նյութի մոտավոր խտության քանակական որոշումը կատարվում է կալիբրային կորերի՝ ԿԿ-ների կառուցման միջոցով: Կալիբրային կորը թույլ է տալիս դատել նմուշում առկա թիրախ նյութի հարաբերական խտության մակարդակի մասին: ԿԿ-ները կառուցվում են լաբորատորիայի աշխատակիցների ջանքերով կամ համակարգչային եղանակով:

4.3.6.1. ԻՖՎ-ի որակական դետեկցիայի նշադիրները Անդրադառնանք ՀՄ-ՀԾ ռեակցիաների հիման վրա մշակված հետազոտական մեթոդների և կիրառվող նշադիրների հակիրճ պատմությանը: Պատմականորեն առաջինը որպես նշադիր օգտագործվեցին ռադիոակտիվ նյութերը: Անցյալ դարի մինչև 80-ական թվականները այս նշադիրները օգտագործվում էին աշխարհի լաբորատորիաների մեծ մասում: Բայց ռադիոակտիվ նյութերի օգտագործումը վտանգավոր է և աշխատանքի համար, և ստացված պատրաստուկների չեզոքացման կամ անվտանգ պահման համար: Titteriոց ԲՄՏՃ

u2ա1111կա6 2-1111 ՀU A

►•

Uզրiա~ti QլlաUgոu ն ԷաUա~ա~աU ո11ո2ոu

UորuU1! աU1 ն~ նաttiոiuո~

Շ

Նկ. 4.21. Դետեկցիայի համար գունափոխման, ֆլուորեսցենցիայի և հեմիլյումինիսցենցիայի երեևույթների օգտագործման սխեման (https://rockland-inc.com/elisa.aspx?ref=driverlayer.com):

Ուստի մշակվեցին այլ տիպի նշադիրների օգտագործման վրա հիմնված դետեկցիայի նոր եղանակներ, այդ թվում՝ սուբստրատի գունափոխում առաջացնող ֆերմենտներ, քեմո- և ֆլուորեսցենցիա

առաջացնող նյութեր: Տարբեր բնույթի նշադիրների ազդեցության եղանակները ներկայացվում են նկար 4.21 -ում: Նշադիրների բնութագրական տվյալները ներկայացվում են աղյուսակ 4.1 -ում: Աղյուսակ 4.1 ԻՖՎ-ի դետեկցիայի տարբերակները '1րո uոզեC. կո1որոuեո -flliկ ո զայոuոյoյոLUլ!

■II

Uuհլ1ամt:iշU1 UոաC.,iարո uuաC.2եոC.ե11ti Uա(lQti(lլ! լ!C.րերglյ!

u շարitiրutiրլ!

U11աLլt:i1ոյoյոuut:iրլ!

Lրաgոgli! ոերiեlյորյոC.C.եր

յյ1ոորt:iugt:iuU1

■1111

-

ll1ոոր1յuեոր լ!C.րերglյ!

HRP ljաu AF lյոutiutiugt:iuU1 u2արiti11 ljաu HՔԲ. '1եutiuոu. UոLլ!Ulilլlաlil ո ո1.աtiti րitiոարljոu. ~աflնլl կրկC.tյ.ե1tiորյոC.

'1եutiuոutiC.tiugեC.ո

HRP ljաu AP

Pարaր կրկC.Lյ.ե· 1tiորյոC., uե6 րitiC.աutilյ լայC.ոtյր

Pարaր զզայոC.որյոC., uե6,itiC.աutilյ լայC.նLյյՀl

UL. ulյկրոL111աC.2եոC.եր

UL.ljաu աC.րաt.րաC.gtյlj L11tաC.2եոC.եր

4.3.6.2. Կիսաքանակական դետեկցիայի հիմունքները Ընդհանրապես յուրաքանչյուր կատարված ԻՖՎ հետազոտության արդյունքների ճշգրտության մակարդակը ստուգվում է ընդունված միջոցներով: Սակայն թե նմուշները վերցնելու և մշակելու, թե փորձի կատարման փուլում հնարավոր են բազմաթիվ սխալներ, որոնք կարող են ձախողել կատարվող հետազոտությունը և բերել սխալ արդյունքների ստացման: Սխալների պատճառ կարող են լինել միջավայրի ջերմաստիճանը, խոնավության մակարդակը, օգտագործվող լուծույթների

ոչ ճիշտ կազմը և pH, լաբորատոր սարքերի, ամանեղենի և մակերեսների աղտոտումները և այլն: Նշված գործոնների բացառումը և փորձի անթերի կատարումը ունեն մեծ նշանակություն, քանի որ սխալ արդյունքների մեծամասնությունը պայմանավորված է հենց այս պատճառներով: Մեծ է նաև փորձի ընթացքում կատարվող սխալների ազդեցությունը, մարդկային գործոնը, երբ այս կամ այն պատճառով շեղվում է ներմուծվող տարրերի քանակը կամ սխալ է կազմվում լուծույթը և այլն: Նման բազմաթիվ խնդիրների հաղթահարման ամենաազդեցիկ եղանակը հնարավոր չափով պրոցեսների ավտոմատացումն է և ռեագենտների պատրաստի հավաքածուների օգտագործումը: Բայց նույնիսկ ավտոմատացված պրոցեսներում հնարավոր է լուծույթների, մակերեսների և ամանեղենի աղտոտում կամ սարքերի անճիշտ աշխատանք, այդ պատճառով բոլոր ռեագենտների պատարաստի հավաքածուների կազմում առկա են հատուկ՝ ստուգիչ նշանակություն ունեցող նմուշներ՝ դրական և բացասական ստուգիչներ: Մեկ այլ խումբ են կազմում վերահսկիչ ստանդարտ նմուշները: Վերահսկիչ ստանդարտ նմուշների կազմում սովորաբար գտնվում է առողջ մարդու հայտնի, բայց տարբեր խտություններով ներկայացված անալիտանման սպիտակուց: Վերահսկիչ ստանդարտները գրականության մեջ անվանում են կալիբրատորներ: Փորձի արդյունքում ստացված կալիբրատորների տվյալներով կառուցվում է կալիբրային կորը: Իսկ ԿԿ-ի օգնությամբ որոշվում է փորձնական նմուշի մոտավոր քանակը: Ոչ մրցակցային մեթոդների կիրառման դեպքում փաստացի տվյալներով կառուցված կալիբրային կորը հետզհետե աճող, դրական կորագիծ է: Մրցակցային ԻՖՎ-ի դեպքում կորագիծը հակված է արագ նվազել (նկ. 4.22): Օգտվելով ԿԿ-ի օպտիկական խտության ցուցանիշներից՝ հնարավոր է որոշել անալիտի խտությունը նմուշում: Օրինակ՝ ոչ մրցակցային հետազոտման (նկ. 4.22.1): արդյունքում ստացված օպտիկական խտության 1,0 ցուցանիշին համապատասխանում է անալիտի 40 նգ/մլ խտություն (նշված է կարմիր կետով):

կ0

UCiա1tuոti tuոոլՀ!յոtCiլ] Ciզ/111.

Նկ. 4.22. Մրցակցային և ոչմրցակցային ԻՖՎ-ի տվյալներով կառուցված ԿԿ-ներ: 1 - Ոչ մրցակցային ԻՖՎ-ի դեպքում նմուշում անալիտի խտության ցուցանիշների բարձրացմանը զուգահետ աճում է նշադրված համալիրների խտությունը և գունային ազդակի ինտենսիվության ցուցանիշները բարձրանում են, ուստի Կ կորը հետզհետե աճող կորագիծ է: 2 - մրցակցային ԻՖՎ-ի դեպքում անալիտի խտության բարձրացումը առաջացնում է կապված համալիրների քանակի նվազում, և ԿԿ-ն ստանում է նվազող կորագծի պատկեր (http://www.clinlabs.com/publications/metody):

Կորագիծը կարող է կառուցվել նաև մշակված, խտությունների լոգարիթմի տվյալներով, և այս դեպքում կստացվի այլ՝ ավելի կանխագուշակելի և ցածր փոփոխականությամբ բնութագրվող պատկեր (նկ. 4.23):

Նկ. 4.23. Մրցակցային ԻՖՎ-ի բնական լոգարիթմներով կառուցված ԿԿ: Լոգարիթմի տվյալների օգտագործման շնորհիվ կորը ձեռք է բերում հետզհետե նվազող տեսք և ավելի հարմար է անալիտի խտության ճշգրիտ որոշման համար (http://www.clinlabs.com/publications/metody):

Ընդհանուր առմամբ պլանշետի խցիկները օգտագործվում են հետևյալ եղանակով. ամեն մի խցիկ համապատասխանում է որոշակի նմուշի, և պլանշետի խցիկների պարունակությունը նշվում է համապատասխան ցուցակներում (նկ. 4.24): Առաջին 7 խցիկի նմուշները ունեն վերահսկիչ և կարգավորիչ ֆունկցիա. Բլանկ խցիկի մեջ ներմուծվում են փորձի ընթացքում օգտագործվող բոլոր ռեագենտները, բացի հետազոտվող նմուշից: Բացասական ստուգիչ խցիկի մեջ ներմուծվում է նմուշ, որը չի փոխազդում փորձում օգտագործվող ռեագենտների հետ: Որոշ դեպքերում բացասական ստուգիչ և բլանկ խցիկները ունենում են նույն կազմը: Բացասական ստուգիչը թույլ է տալիս բացահայտել չհետազոտվող, օտար նյութերի առկայությունը ռեակցիոն խառնուրդում և որոշել դրանց ազդեցության չափը փորձի արդյունքների վրա:

Շաոo Ճ Շ D E Ւ G H

Բ1ան~ Բաթանա~ան նU1ոթհs Yա1հt:!ոաU1ոո Ճ Yա1հt:!ոաU1ոո 8 Yա1հt:!ոաU1ոո Շ YաtհԲրlաlյlորl D 'lոա!յան Ulյlոtոհs Հհ~անրi 1

Հհitանրi 2 ՀհLlանրt 3 ՀհLlանրt կ liանն

Նկ. 4.24. Նմուշների դասավորությունը պլանշետի վրա (https://diameb.ua/manuals/rus/1446.pdf):

Դրական ստուգիչ խցիկ ներմուծվում է մարդու կամ կենդանիների սպիտակուցային բնույթի հայտնի նյութ, որը փոխազդում է օգտագործվող ռեագենտի հետ: Դրական ստուգիչը թույլ է տալիս գնահատել ռեագենտների որակը և ազդեցության ինտենսիվությունը, ռեակցիայի ճշգրիտ կազմակերպումը և կատարումը:

Կալիբրատորները պարունակում են հետազոտվող նյութի հայտնի խտություններ, և դրանց օգնությամբ կառուցվում են ԿԿ-ներ: ԿԿների կորը ստացվում է գրաֆիկի վրա կալիբրատորների տվյալներով կետերի որոշման և դրանք գծով միացնելու միջոցով: Նշենք, որ, սովորաբար, գրաֆիկը կորաձև է, և հաճախ դրա ճշգրիտ կառուցման համար կիրառվում են հատուկ հաշվարկային եղանակներ: Լաբորատոր պրակտիկայում ԿԿ-ները կառուցվում են համակարգչային ծրագրերով՝ հայտնի մաթեմատիկական մեթոդների կիրառմամբ: Սովորաբար կատարված հետազոտության ճշգրտության մակարդակը ստուգվում է նույն նմուշի 2-3 զուգահեռ կատարվող հետազոտությունների միջոցով: 4.3.6.3. ԻՖՎ-ի ավտոմատացումը և զարգացման հեռանկարները ԻՖՎ-ի կիրառման ամբողջ ընթացքում աշխատանքներ են կատարվել մեթոդի հուսալիության բարելավման և արագացման ուղղությամբ: Կարևորվում էր պրոցեսի յուրահատկության և զգայունության բարձրացումը, որը հատուկ հակամարմինների ու հակածինների արտադրության մեթոդների զարգացման և ռեագենտների հավաքածուների նպատակային օպտիմիզացման արդյունք է: Երկրորդ ուղղությունը նմուշի փոքր խտությունների բացահայտման մեթոդների մշակումն է դետեկցիայի մեթոդների բարելավման եղանակով: Այս ուղղությամբ կատարվող աշխատանքների շնորհիվ գրեթե լիովին հրաժարվել են ռադիոակտիվ նշադիրներից, ընդլայնել նշադրության համար օգտագործվող ֆերմենտների ցանկը, մշակել դետեկցիայի արդյունավետության բարձրացմանը նպաստող նոր սարքավորումներ: ԻՖՎ եղանակով կատարվող հետազոտությունների բարելավման ուղղություննիրից մեկը՝ փորձի կատարման արագացումը, լուծվում է առանձին փուլերի կամ ամբողջ հետազոտության պրոցեսի ավտոմատացման եղանակով: Կատարվող հետազոտության զգայունության և յուրահատկության բարձրացման գործում մեծ է նաև մոնո416

կլոնալ ՀՄ-ների արտադրության մեթոդների բարելավման նշանակությունը: Վերջին տարիներին մեծացել է դետեկցիայի համար օգտագործվող ֆերմենտների ցանկը, ստեղծվել և արտադրվում են ստանդարտ ռեագենտների հավաքածուներ որոշակի սպիտակուցների բացահայտման համար: Ժամանակակից ավտոմատ սարքերի օգտագործման համար մշակվել են բազմահազար խցիկներից կազմված միկրոպլանշետներ: Մեծ նշանակություն ունեն դետեկցիա կատարող սարքերի բարելավման եղանակները, որոնք ապահովում են միաժամանակ բազմահազարանոց խցիկներ ունեցող պլանշետների ընթերցումը: Ավելին՝ նույն ընթերցող սարքը կարող է մշակել ինչպես լուսային, այնպես էլ ուլտրամանուշակագույն, ֆլուորեսցենտ և լյումինիսցենտ ազդակները: Ընթերցող սարքը ավելի զգայուն է և ֆիքսում է անալիտի ավելի ցածր խտությունները, քան սպեկտրոֆոտոմետրը, մյուս կողմից դա ավելի արագ է աշխատում: Շնորհիվ սարքին միացված համակարգչի և համապատասխան ծրագրերի՝ ընթերցող սարքով ստացված ազդակները անմիջապես վերլուծվում են, մշակվում և վերածվում թվային ցուցանիշների: Համակարգիչը կատարում է կալիբրային կորերի կառուցումը, պահպանում է ստացված արդյունքները, ապահովում մեծաքանակ ինֆորմացիայի կարգավորում և համակարգում: Ստեղծված բազմաթիվ սարքերը թույլ են տալիս միաժամանակ վերլուծել 500-ից մինչև 1000 և ավելի նմուշներ, նույնիսկ նույն փորձի ընթացքում կատարել տարբեր տեսակի հետազոտություններ: Հետազոտությունները կատարվում են կամ հետերոգեն եղանակով՝ պինդ մակերեսի վրա, կամ հեղուկ միջավայրում՝ իմունահիստոքիմիական եղանակով, երբ որպես նմուշ օգտագործվում է հյուսվածքի միկրոշերտը՝ այսինքն in situ: Ավտոմատացված կամ մասամբ ավտոմատացված հետազոտությունները կատարվում են համապատասխան սարքավորումներով և

յուրաքանչյյուր փորձի համար անհրաժեշտ յուրահատուկ ռեագենտների պատրաստի հավաքածուների օգտագործմամբ (նկ. 4.25): Այսպիսով՝ ԻՖՎ-ի մեթոդները մշտապես բարելավվում են, ընդլայնվում են դրանց օգտագործման բնագավառները:

Նկ. 4.25. 1 - Իմունաֆերմենտային կիսաավտոմատ միկրոպլանշետային վերլուծող սարք INFINITE F50 (https://interlabservice.ru/catalog/oborud/?sid=16232), 2 - իմունաֆերմենտային թեստերի վերլուծող սարք SEAC, 3 - ութաուղի ֆոտոմետր (http://regionmednn.ru/product/planshetnyj), 4 - պլանշետային ֆոտոմետր, սպեկտրոմետր, սպեկտրոֆլուորոմետր, 5 - պլանշետների լցոնման և լվացման սարք (https://www.diam.ru/news/avtomatizatsiya-ifa/), 6 - իմունաֆերմենտային թեստերի վերլուծման ավտոմատ սարք Evolis (https://www.helicon.ru/catalog), 7 - հեպատիտ C-ի բացահայտման համար օգտագործվող ռեագենտների հավաքածու (https://kostanayobl.satu.kz/p802389), 8 - կորոնավիրուսի նկատմամբ արտադրվող IgG և IgM որոշման համար օգտագործվող ռեագենտների ErbaLisa հավաքածու (https://erbarus.com/products/immunologiya), 9 - հակակովիդային IgG որոշման համար օգտագործվող ռեագենտների հավաքածու (https://www.pasteurorg.ru/rubric/):

4.3.7. ԻՖՎ-ի կիրառման բնագավառները ԻՖՎ մեթոդի կիրառման բնագավառները բազմազան են և ընդլայնվում են ինչպես գիտության ու տեխնոլոգիաների ինքնուրույն զարգացման, այնպես էլ գիտական հետազոտություններում դրանց կիրառման շնորհիվ և այս եղանակով գիտության զարգացմանը նպաստող աշխատանքների արդյունքում: Այժմ արդեն ԻՖՎ մեթոդը կիրառվում է բժշկագիտության, գյուղատնտեսության, արդյունաբերական կենսատեխնոլոգիաների, բնության պաշտպանության ոլորտի գիտահետազոտական աշխատանքներում: 4.3.7.1. Բժշկագիտություն և անասնաբուժություն Այսպես՝ բժշկաբանության և անասնաբուժության բնագավառներում կարևոր է ինչպես յուրահատուկ ակտիվ օտար ՀԾ-ների, այնպես էլ օրգանիզմների սեփական ՀՄ-ների բացահայտումը: Առաջին դեպքում կատարվում է հարուցչի ախտորոշում տեր օրգանիզմի հյուսվածքներում, իսկ երկրորդում հետազոտվում է օրգանիզմի իմունային կայունությունը, պաշտպանվածությունը այս կամ այն հարուցիչների նկատմամբ: Սակայն կարևոր է ոչ միայն իմունային կայունությունը վարակիչ հիվանդությունների նկատմամբ, այլ նաև ունակությունը պայքարել համակարգային և ուռուցքային հիվանդությունների դեմ: Այսպիսով՝ բուն բուժական բնագավառում առանձնացվում են ԻՖՎ-ի կիրառման երեք բնագավառներ. վարակիչ հիվանդությունների ախտորոշում, էնդոկրինային հիվանդությունների ախտորոշում և քաղցկեղային հիվանդությունների ախտորոշում: Վարակիչ հիվանդությունների բացահայտման գործում ԻՖՎ օգտագործվում է բազմաթիվ վիրուսային, բակտերիաներով, մանրէներով կամ սնկայիններով առաջացվող հիվանդությունների դեպքում: Առանձնապես կարևոր է ԻՖՎ-ի օգտագործումը վիրուսների ախտորոշման գործում, երբ դրանց ուղղակի բացահայտումը այլ եղանակով

անհնարին է, օրինակ՝ տոքսոպլազմոզի, տոքսոկարոզի կամ տրիխինելյոզի դեպքերում: Օրգանիզմում արտադրվող ՀՄ-ների որակական և քանակական հետազոտությունը թույլ է տալիս ճշգրիտ բացահայտել հիվանդության ընթացքը և իմունային պատասխանի ստատուսը: Օրինակ՝ արյան մեջ IgM-ի առկայությունը համապատասխանում է վարակման վաղ փուլին, ավելի ուշ բացահայտվում է նաև IgA-ն: Իմունային պատասխանի լիարժեք դրսևորումը և հարուցչի հաղթահարումը համապատասխանում է IgG խտության զգալի բարձրացման ժամկետներին: Հիվանդության վերջնական բուժումից հետո արյան հոսքում մնում են միայն IgG դասի ՀՄ-ները: Կրկնակի վարակման դեպքում արագ աճում է IgA-ի և IgG խտությունները: Պատվաստումից հետո արյան հոսքում 4-6 ամիս բացահայտվում են IgG դասի ՀՄ-ները, ապա դրանց խտությունը նվազում է (А.А. Кишкун, 2009, П.В. Самойленков, 2009, S.D. Gan, K.R. Patel, 2013): Էնդոկրինային հիվանդությունների բացահայտման դեպքում հետազոտվում է հորմոնների խտությունը արյան կազմում: Այս դեպքում կիրառվում է քանակական ԻՖՎ, քանի որ անհրաժեշտ է ճշգրիտ որոշել հորմոնի մոլեկուլների խտությունը և ակտիվությունը: Այսօր արդեն մշակված են 9 թեստ-համակարգեր՝ վահանագեղձի հորմոնների ախտորոշման համար: Բացի դրանից՝ հետազոտվում են նաև գեղձի հյուսվածքների և որոշ հորմոնների նկատմամբ արտադրվող աուտո-ՀՄ-ները, դրանց խտությունը և քանակը: Այս շարքի հորմոններն են հիպոֆիզի թիրեոտրոպ հորմոնը՝ TTH, եռայոդթիրոնինը՝ T3, թիրոքսինը՝ T4, որոնց խտությունը արյան մեջ թույլ է տալիս գնահատել գեղձի ակտիվության մակարդակը և հիպեր-, նորմալ կամ հիպոթիրեոզային վիճակը (И.И. Дедов, 2013, И.И. Дедов, Г.А. Мельниченко, В. Пронин, 2006, И.И. Дедов, В.А. Петеркова, 2008): TTH-ի ախտորոշումը կատարվում է բոլոր հղիների և նորածինների մոտ, ինչպես նաև խորհուրդ է տրվում կատարել 35 տարեկանից բարձր կանանց և 50-ից բարձր տղամարդկանց մոտ:

Վահանագեղձի աուտոիմուն հիվանդությունների նշադիրներ են թիրեոիդ յուրահատուկ ՀՄ-ները: Թիրեոզային շեղումների գրեթե բոլոր տեսակները աուտոիմուն հիվանդություններ են: Վահանագեղձի կարևոր սպիտակուցներից են այն գործոնները, որոնց նկատմամբ արտադրվում են աուտո-ՀՄ-ներ. թիրեոգլուբուլինը՝ TG-ն, թիրեոիդային պերօքսիդազ ֆերմենտը՝ TPF, և TTH-ի ռեցեպտորը: Հիվանդների մոտ բացահայտվում է աուտո ՀՄ-ներից մեկի կամ մի քանիսի խտության բարձրացում: Քաղցկեղային հիվանդությունների բացահայտում: ԻՖՎ-ի կիրառումը շատ կարևոր և արդյունավետ է ուռուցքների ախտորոշման գործում: Ախտորոշումը կատարվում է ուռուցքային նշադիրների քանակական դետեկցիայի եղանակով: Ուռուցքային նշադիր են կոչվում ուռուցքի բջիջներում սինթեզվող և օրգանիզմի հեղուկների մեջ արտահանվող նյութերը: Ուռուցքային նշադիրների ախտորոշումը կիրառվում է ուռուցքների բացահայտման, բուժման պրոցեսի վերահսկման և ուռուցքների նախակլինիկական ախտորոշման համար (Л.М. Анцилевич, Л.А. Ягудина, 2014): Ուռուցքային նշադիրների խումբը կազմում են բազմաթիվ գործոններ, որոնց խտությունը օրգանիզմի հեղուկներում բարձրանում է ուռուցքների առաջացման և ակտիվ աճի փուլում: Այս գործոնները կամ ուռուցքայուրահատուկ են և սինթեզվում են միայն ուռուցքների բջիջներում, կամ ուռուցքների հետ ասոցացված՝ սինթեզվում են նաև այլ բջիջներում, բայց ուռուցքային բջիջներում դրանց կենսասինթեզը շատ ակտիվ է, իսկ խտությունը հեղուկներում՝ շատ բարձր: Արյան մեջ ներմուծվող ուռուցքային նշադիրները կարող են բացահայտվել ԻՖՎ մեթոդով: Նշադիրների խմբից են ուռուցքային բջիջներում սինթեզվող ՀԾ-ները, դրանց նկատմամբ սինթեզվող ՀՄ-ները, նյութափոխանակման տարրերը, ֆերմենտները, ցիտոկինները: Այսօր արդեն ուռուցքների կլինիկական ախտորոշման համար ընտրված են 20-ից ավելի նման նյութեր: Ուռուցքային նշադիրների յուրահատկության և զգայունության աստիճանը բավարար չէ դրանք հավաստի ախտորոշիչ համարելու

համար: Բայց որոշ երկրներում լայն տարածված ուռուցքային հիվանդությունների վաղ բացահայտման նպատակով օգտագործվում են համապատասխան նշադրային թեստեր: Օրինակ՝ Չինաստանում որոշվում է α- ֆետոպրոտեինը՝ AFP, հեպատոցելյար կարցինոմայի բացահայտման համար: ԱՄՆ-ում շագանակագեղձի ուռուցքի բացահայտման համար՝ շագանակագեղձի ՀԾ- PSA, Ռուսաստանում, բացի PSA-ից, հետազոտում են նաև ձվարանների քաղցկեղի հետ ասոցիացված CA-125 ՀԾ-ն (И.Е. Бахлаев, А.В. Ястребова и др., 2012): Ուռուցքային նշադրի խտությունը նմուշում պայմանավորված է ուռուցքի չափերով, և այս հանգամանքը թույլ է տալիս դատել ինչպես ուռուցքի սկզբնական չափերի, այնպես էլ բուժման արդյունքում առաջացած փոփոխությունների մասին: Նշենք, որ ԻՖՎ-ն օգտագործվում է նաև ալերգենների և աուտոիմուն հիվանդությունների բացահայտման և համաճարակների վաղ ախտորոշման համար: Վերջերս առողջապահության միջազգային կազմակերպությունը (ԱՄԿ) հրատարակել է վարակիչ և մեծ տարածում ունեցող հիվանդությունների ախտորոշման համար օգտագործվող թեստերի ցուցակը, որտեղ նշված է 113 անվանում, որոնցից 58-ը օգտագործվում են լայն տարածում ունեցող հիվանդությունների ախտորոշման համար, իսկ 55-ը՝ մեծ նշանակություն և ազդեցություն ունեցող հիվանդությունների: Երկրորդ խմբի հիվանություններից են ՁԻԱՎ-ը, սիֆիլիսը, մալարիան, հեպատիտ B և C, մարդու պապիլոմայի վիրուսը: Անասնաբուժության ոլորտում ԻՖՎ-ի կիրառությամբ բացահայտվում են բազմաթիվ, միայն կենդանիներին բնորոշ կամ դրանց միջոցով տարածվող հիվանդություններ: Այս խմբին են պատկանում բրուցելյոզը, տուբերկուլյոզը, լեյկոզը, ժանտախտը, դաբաղը և այլն: Յուրաքանչյուր կենդանատեսակի համար՝ խոշոր եղջերավորներ, ոչխարներ, խոզեր, ձիեր, հավեր և այլ թռչուններ, կիրառում են հատուկ տեսակայուրահատուկ թեստեր:

4.3.7.2. Գյուղատնտեսություն Գյուղատնտեսությունը արտադրության բարդ բազմակողմանի բնագավառ է, որն ուղղված է ինչպես սննդամթերքի արտադրման խնդրին, այնպես էլ թեթև արդյունաբերության համար անհրաժեշտ հումքի արտադրման և բնության պաշտպանության խնդիրների լուծմանը: Այսպիսով՝ սննդամթերք արտադրող կենդանիների, բույսերի և սնկայինների վարակվածության և հարուցիչների միջանկյալ տեր լինելու բացահայտումը գյուղատնտեսության առաջնային խնդիրներից է: Այս խնդրի լուծման ամենատարածված եղանակը իմունաբանական և հաճախ հենց ԻՖՎ վերլուծության մեթոդն է: Մեծ նշանակություն ունի սննդամթերքի որակի գնահատումը և վտանգավոր նյութեր պարունակող մթերքների ախտահանումը կամ վերամշակումը: Այսպես, սուլֆանիդային խմբի որոշ դեղամիջոցներ լայնորեն կիրառվում են անասնաբուժությունում, սակայն դրանք կարող են կուտակվել հյուսվածքներում և ազդել սննդամթերքի որակի վրա: Ուստի այդպիսի վտանգներից խուսափելու համար կարևոր է բուժում ստացած կենդանիների հյուսվածքի ստուգումը ԻՖՎ եղանակով: Նույն ազդեցությունը կարող են թողնել և այլ դեղամիջոցներ, օրինակ՝ հակաբիոտիիկները, որոնք նույնպես ախտորոշվում են ԻՖՎ եղանակով (А.А. Луговской, Д.С. Большаков, Т.Б. Никешина, 2016): ԻՖՎ մեթոդը կիրառվում է նաև սելեկցիոն աշխատանքներում, եթե սելեկցիան ուղղված է որոշակի նյութի խտության բարձրացմանը կամ նվազեցմանը: ԻՖՎ մեթոդով կատարվում է նյութի խտության վերահսկում ամեն նոր սերնդում և սելեկցիոն աշխատանքի արդյունավետության գնահատում: ԻՖՎ մեթոդը կիրառվում է նաև վիրուսազերծ սորտերի ստեղծման գործընթացում (Վ.Ա. Զորանյան, Ա.Ջ. Սահակյան, Լ.Մ. Մելքոնյան, 2007): Ձկնատեսակների վարակվածության և սննդային անվտանգության ստուգման համար նույնպես կիրառվում է վերահսկում ԻՖՎ մեթոդով:

Նշենք, որ ԻՖՎ մեթոդով բացահայտվում են սպիտակուցների կազմում տեղի ունեցող և հիվանդության պատճառ դարձող խոշոր մուտացիաները և նոր հատկանիշներով օժտված տրանսգեն օրգանիզմներն ու ԳՄՕ-ները: 4.3.7.3. Արդյունաբերական կենսատեխնոլոգիա Արդյունաբերական պրոցեսների էկոլոգիական անվտանգության, էներգետիկ տնտեսավարության, արժեքի նվազեցման և նորանոր նյութերի արտադրության համար կիրառվում են կենսատեխնոլոգիական՝ գենային ինժեներիայի մեթոդներ: Տեխնոլոգիական պրոցեսների բարելավումը կատարվում է կենսաբանական մեխանիզմների օգտագործման եղանակով, որոնք ապահովում են և ավելի հասանելի, և արագ, և միջավայրը չաղտոտող արդյունաբերական տեխնոլոգիաների ստեղծում: Այս նպատակով արդյունաբերական պրոցեսներում լայնորեն օգտագործվում են ֆերմենտային նյութեր, որոնք և ապահովում են նոր տեխնոլոգիաների զարգացումը: Արդեն հայտնի և նոր ձևավորվող ֆերմենտները, օժտված լինելով էնզիմային ակտիվությամբ, ավելի նվազ էներգետիկ և նյութական ներդրումների պայմաններում ապահովում են ավելի մաքուր և անվտանգ արտադրության հնարավորություն: Ինչպես ֆերմենտների, այնպես էլ դրանց արտադրության համար օգտագործվող նյութերի և արդյունաբերական պրոցեսների վերահսկումը հաճախ կատարվում է ԻՖՎ մեթոդների կիրառմամբ: Կենսատեխնոլոգիական արդյունաբերության մեծ բնագավառ է պարարտանյութերի արտադրությունը, որտեղ կիրառվում են կենսատեխնոլոգիական մեթոդներ, և որի վերահսկումը նույնպես իրականացվում է իմունաբանական վերլուծության միջոցով: Արդյունաբերության մեկ այլ նշանակալի բնագավառ է դեղամիջոցների, մոնոկլոնալ ՀՄ-ների, վիտամինների, հորմոնների, սպիտակուցների և ամինաթթուների արտադրությունը, որը անմիջականորեն իրականացվում է կենսատեխնոլոգիական մեթոդներով և ԻՖՎ-ի կիրառությամբ:

Մեկ այլ մեծ նշանակություն ունեցող ուղղություն է ԻՖՎ վերլուծության համար ռեագենտների համախմբերի արտադրության բնագավառը: Այս բնագավառում կատարվող աշխատանքներն ուղղված են մոնոկլոնալ ՀՄ-ների արտադրությանը և սուրվարակիչ հարուցիչների ՀԾ-ների փոխարինմանը ռեկոմբինանտ՝ սինթեզված ՀԾ-ներով (А.В. Сухоедова, В.В. Меньшиков, 2016): Գիտական հետազոտություններում իմունային վերլուծության մեթոդները նույնպես մեծ կիրառություն ունեն: Նոր հարուցիչների բացահայտման և դրանց ՀԾ-ների առանձնացման և հետազոտման գործում այս մեթոդներն անփոխարինելի են: Վերջին տարիներին ստեղծված նոր տեխնոլոգիաների շնորհիվ հնարավորություն է ընձեռվել բացահայտել հետազոտվող նմուշում նույնիսկ մի քանի ՀԾ կամ ՀՄ: Այդ մեթոդների շնորհիվ հարուցիչը կարող է բացահայտվել հիվանդության տարածման սկզբնական փուլում: Նոր տեխնոլոգիաները հիմնվում են իմունաֆերմենտային վերլուծության և, օրինակ, ՊՇՌ-ի համատեղման եղանակի վրա: Հետազոտությունների հնարավորությունների ընդլայնման նպատակով կիրառվում են նաև այլ մեթոդների համախմբման տեխնոլոգիաները այդթվում՝ նանոմասնիկների օգտագործումը, լիպոսոմների կիրառությունը, էլեկտրաքիմիական մեթոդները, ֆագային դիսփլեյի մեթոդը: 4.3.7.4. ԻՖՎ-ի թերությունները և առավելությունները ԻՖՎ մեթոդի առավելությունները ապահովում են մեթոդի լայն կիրառման հնարավորություն բազմաթիվ բնագավառներում: Կարևորագույն առավելություններն են՝ - 90 %-անոց զգայունություն, - անհրաժեշտ նյութերի կայունություն, որի շնորհիվ դրանք կարող են պահվել մինչև մեկ տարի, - ախտորոշիչ հետազոտության կատարման արագություն, հարմարություն և պարզություն, - նմուշների նվազագույն քանակի օգտագործման հնարավորություն,

-

թեստային ռեակտիվների գնի հասանելիություն, ինֆեկցիաների վաղ բացահայտման հնարավորություն, հետազոտության կատարման փուլերի ունիվերսալություն, որի շնորհիվ հնարավոր են միասնական հետազոտություններ, - ինֆեկցիոն պրոցեսի զարգացման վերահսկման հեշտություն, - ավտոմատացված հետազոտությունների կատարման հնարավորություն, - ստացված արդյունքների համակարգչային գնահատման հնարավորություն: Իմունաֆերմենտային մեթոդի թերություններից են՝ - օրգանիզմի իմունային պատասխանը, բայց ոչ հարուցիչը բացահայտելու հնարավորությունը, - ռեակցիոն խառնուրդի ֆոնային դրսևորումների ազդեցությունը վերջնական արդյունքի վրա, որը պայմանավորված է ֆերմենտների ինհիբիտորների առկայությամբ հետազոտվող խառնուրդում, - արտաքին ազդեցությունների ներքո ֆերմենտների բնափոխման հնարավորությունը, - մեթոդի կիրառությունը պահանջում է բարձրորակ մաքրված ՀՄների և ՀԾ-ների օգտագործում: Կեղծ արդյունքների ստացման հավանականությունը նվազեցնելու համար օգտագործվում են զուգահեռ կատարվող քրոմատոգրաֆիկ կամ վեստերն բլոտ տիպի ախտորոշումներ:

4.4. ՍՊԻՏԱԿՈՒՑՆԵՐԻ ԻՄՈՒՆԱԲԱՆԱԿԱՆ ՎԵՐԼՈՒԾՈՒԹՅԱՆ

ՆՈՐ ՏԵԽՆՈԼՈԳԻԱՆԵՐ

Վերջին տարիներին մշակվել և կիրառության մեջ են ներդրվել իմունաբանական հետազոտությունների նոր տեխնոլոգիաներ: Դրանք ապահովում են ճշգրիտ քանակական դետեկցիայի հնարավորություն, թույլ են տալիս միաժամանակ վերլուծել մի քանի տարբեր անալիտ, կատարել հետազոտությունը անմիջապես հյուսվածքի վրա՝ in situ: 4.4.1. Մոլեկուլային գաղութների հիբրիդացման մեթոդ՝ թվային ԻՖՎ Նոր տեխնոլոգիաներից մի քանիսը ապահովում են անալիտի խտության ճշգրիտ որոշման հնարավորություն: Տարբերակներից մեկը թույլ է տալիս կատարել անալիտի մոլեկուլների անմիջական հաշվարկ և սկզբունքորեն նմանվում է թվային ՊՇՌ-ի մեթոդներին: Մեթոդը ստացել է մոլեկուլային գաղութների հիբրիդացման մեթոդ կամ թվային ԻՖՎ անվանումը: Հետազոտության այս տարբերակը պահանջում է բարդ սարքավորումներ, հատուկ միկրոպլանշետներ և համակարգչային ծրագրեր: Անհրաժեշտ է նաև CCD-խցիկ ունեցող ֆլուորեսցենտ մանրադիտակ: Փորձի առաջին փուլում հետազոտվող նմուշը՝ անալիտը ինկուբացվում է համապատասխան ՀՄ-ներով պատված միկրոգնդերի հետ: Երկրորդ փուլում ավելացվում է դետեկտավորող ՀՄ՝ կոագուլյանտ, որը կապված է բիոտինի մոլեկուլների հետ: Ինկուբացիայից հետո երրորդ փուլում միջավայր ավելացվում են բիոտինի հետ կապվող, դետեկտորային՝ ոչ ֆլուորեսցենտ սուբստրատի մոլեկուլները ֆլուորեսցենտի փոխակերպող ֆերմենտ: Առաջանում են սուբստրատի հետ փոխազդեցության հնարավորությամբ օժտված, միկրոգնդերի մակերեսին կապված իմունային համալիրներ: Չորրորդ փուլում ռեակցիոն խառնուրդը բաժանվում է 200 000 խցիկներ պարունակող պլանշետի խցերի միջև այնպես, որ ամեն մի խցի մեջ անցնի մեկ միկրոգունդ: Ապա խցերի մեջ ավելացվում է սուբստրատը: Այն խցերում, որոնք

պարունակում են միկրոգնդերի հետ կապված իմունային համալիրներ կատարվում է սուբստրատի ակտիվացում և առաջանում է ֆլուորեսցենտ ազդակ: Լվացումից հետո պլանշետները հետազոտվում են ֆլուորեսցենտ միկրոմանրադիտակով և ազդակ արձակող խցերը հաշվարկվում են (նկ. 4.26): 1-pf.r tրոL[

3 -[11) lրոL[

2-րH) lրոL[

I

.նU

~ .նU

կ ոՇյյո-

զաiո

րt,ոiոt,ն. .(U

PաԸtաoոa aր,կրոtugր,կot.րոl

u 11կրոuոաoշt.iո

Uն

~ U~~ոգոն.'} . յոր ա աո. Հ -ոt • Uնա1tiոtiՀtյ ~, Pր,ոոtյնաgljա6 յոր ահաո. .(U

.$, toզ,aա1ոo 0112 tրր.i~ո րա ց~ա

tրր.i~ո րաց~ա

Նկ. 4.26. Թվային ԻՖՎ-ի կատարման սխեման (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22370429/):

Հետազոտման ճշգրտության աստիճանի բարձրացման համար փորձում օգտագործվում են կոնյուգատի երեք նոսրացումներ՝ ցածր, միջին և բարձր: Տարբեր նոսրացումների ուսումնասիրման շնորհիվ հնարավորություն է ստեղծվում որոշել խտության մոտավոր աստիճանը, ապա կատարել թվային վերլուծությունը: 4.4.2. Իմունային ՊՇՌ՝ ԻՊՇՌ ԻՊՇՌ մեթոդը զգայունության և ճշգրտության տեսակետից ամենաարդյունավետներից է: Այս մեթոդը թույլ է տալիս բացահայտել անալիտի միկրոսկոպիկ խտությունները և կատարել դրա քանակական որոշում՝ հիմնվելով ՀՄ-ՀԾ համալիրների նշադրման նոր տարբերակի վրա, որտեղ որպես նշադիր օգտագործվում է ԴՆԹ-ի յուրօրինակ շղթա ռեպորտերը: Ռեպորտերի ամպլիֆիկացիան ՊՇՌ-ի պրոցեսում թույլ է տալիս բացահայտել անալիտի նվազագույն քանակ428

ները և, բացի դրանից, հնարավորություն է տալիս նույն հետազոտության ընթացքում տարբեր ռեպորտերների կիրառման եղանակով միաժամանակ հետազոտել մի շարք նպատակային թիրախներ՝ անալիտներ: Օրինակ՝ եթե հետազոտվում է հիվանդի արյան նմուշը և պետք է բացահայտել մի շարք հնարավոր հարուցիչներ, ամեն հարուցչի ՀԾ-ին յուրահատուկ ՀՄ-ն նշվում է հատուկ ռեպորտերով: ԻՖՎ-ի կատարման այն փուլում, երբ ձևավորվում են իմունային համալիրները, ամեն մի ՀԾ կապվում է միայն դրան բնորոշ ռեպորտերի հետ: Հետագա ՊՇՌ-ի ընթացքում ռեպորտերները ամպլիֆիկացվում են, ապա բաժանվում թորամասերի և ախտորոշվում: Այս հետազոտությունը կարող է կատարվել նաև ռեալ թայմ ՊՇՌ-ի տարբերակով՝ ախտորոշելով այս կամ այն ՀԾ-ի նիշ-ներկանյութի խտությունը անմիջապես փորձի ընթացքում: Իմունային ՊՇՌ մեթոդը 100-ից 10 000 անգամ բարձրացնում է անալիտի բացահայտման սահմանը, բայց կապված է որոշ դժվարությունների հետ՝ պահանջում է ՀՄ-ռեպորտերի կոնյուգացում հատուկ մեթոդների կիրառությամբ, որոնք ապահովում են ՀՄ-ի ակտիվության պահպանումը իմունային ռեակցիայում: Իմունային ՊՇՌ մեթոդը կատարման բարդության և ավտոմատացման հետ կապված դժվարությունների պատճառով կիրառվում է գրեթե միայն գիտական հետազոտություններում (C.M. Niemeyer, M. Adler, R. Wacker, 2005) և հարմար չէ հարուցիչների բժշկական ախտորոշման համար: Որպես ռեպորտեր կարող են օգտագործվել և միա-, և երկշղթա ԴՆԹ հատվածներ, քանի որ դրանց արդյունավետությունը քիչ է տարբերվում: ԴՆԹ-ռեպորտերները կապվում են դետեկտավորող ՀՄ-ների հետ երեք եղանակով: 1. Ռեպորտերը կապվում է բիոտինի հետ քիմիական սինթեզի եղանակով, երկրորդ քայլով դրան միանում է A միջնորդ սպիտակուցի հետ կապված ստրեպտովիդինը, որն ունի բիոտին կապող 4 կենտրոն: Հաջորդ փուլում A սպիտակուցը կապվում է ՀԾ ճանաչող ՀՄ-ի Fc ծայրին (նկ. 4.27Ա):

ն

Pllոոll~

ր

·

Pllրոոll~ Ճ

u11.1ti1յ1ա~ոg

ՀU

Հն

Q

!

Uu,րtԸy1ո-

~ ՀU

ՀO

Նկ. 4.27. ՀՄ-ների և ԴՆԹ ռեպորտերի կոնյուգացիայի եղանակները (Н.А. Лисицын и др., 2014):

2. Ռեպորտերը կապվում է բիոտինի հետ քիմիական սինթեզի եղանակով, ՀԾ ճանաչող ՀՄ-ն նույնպես կապվում է բիոտինի հետ, և երկուսն էլ փոխազդում են ստրեպտովոդոնի հետ (նկ. 4.27Բ): Այս դեպքում մեկ ՀՄ մոլեկուլը կարող է կապվել մի քանի ստրեպտովիդինների հետ և առաջացնել մեծ վերմոլեկուլային համալիրներ: Բայց նման կապը կարող է նվազեցնել ՀՄ-ի աֆինությունը ՀԾ-ի նկատմամբ: 3. Ռեպորտերը կովալենտ կապով անմիջապես կապվում է ՀԾ ճանաչող ՀՄ-ի հետ (նկ. 4.27Գ): Աշխատանքի խնդիրներին համապատասխան Ի ՊՇՌ ռեակցիան կարող է կատարվել ուղղակի, անուղղակի, սենդվիչ կամ անուղղակի սենդվիչ եղանակներով: ԴՆԹ ռեպորտերները դետեկտավորվում են կամ էլեկտրաֆորեզի, կամ ռեալ թայմ ՊՇՌ-ի եղանակով: Սենդվիչ եղանակներով կատարվող հետազոտություններում խցիկներում ֆիքսվում են կապող ՀՄ-ները: Այս մեթոդներն առավել արդյունավետ են և զգայուն, բացառում են ՀՄ-ների ակտիվության նվազեցումը միջանկյալ նյութերի հետ կապվելու պատճառով: Բիոտին-ստրեպտավիդինային համալիրների օգտագործումը թույլ է տալիս նախօրոք պատրաստել ռեպորտերբիոտին համալիրներ և արագացնել կոնյուգացիան, խուսափել երկարատև ինկուբացիոն փուլից: Այժմ արդեն կենտրոնացած ձևով արտա430

դրվում են ռեպորտեր-դետեկտավորող ՀՄ կոնյուգատներ՝ տարբեր հետազոտությունների համար (օրինակ՝ Thunder-LinkR Innova Biosciences և Imperacer R Chimera Biotec ֆիրմաները արտադրում են պատրաստի կոնյուգատներ): Սենդվիչ մեթոդի առավելությունն այն է, որ այս դեպքում անալիտը նախօրոք չի անջատվում նմուշից և ֆիքսվում պինդ մակերեսի վրա: Այդպիսի ֆիքսումը կարող էր դառնալ կողմնակի նյութերի շեղող ազդեցությունների պատճառ: Վերջին տասնամյակներում մշակվել են ԻՊՇՌ-ի նոր տարբերակներ, որոնցում դետեկցիայի մեթոդը մոդիֆիկացվում է լիպոսոմների, ֆագային մասնիկների կամ մետաղյա նանոմասնիկների օգտագործման եղանակով: Ներկայացվող մեթոդը ստացավ իմունոլիպոսոմային պոլիմերազային շղթայակցված ռեակցիա անվանումը՝ ILPCR (նկ. 4.28):

f... _} {

'YuԹ ոtթ.ljո[llllե[l

Ujա[lոt0ակորittil.կոU~ ~~ ~

-....~y,"f.r

'·,i.-- .

y/'- '"'-1 , , , ~ ~ Y , ; ; " --r,-;-..;,.., 'f"

·, -

~ - ? ո ' ո ''''' ~

'1\ոttit~tiLt.(յզ1t,կոt/

(

~

•·

,

Pt,ոոt,ն -

Ulll[lեUjlllաtjt,ր)t,0

~ 'lեlllեկlllաtjորiորi ՀՄ

Նկ. 4.28. ILPCRմեթոդի կիրառման սխեման (J.He, D.L. Evers, T.J. O’Leary, J.T. Mason, 2012):

Լիպոսոմների օգտագործման դեպքում ԴՆԹ ռեպորտերները ներմուծվում են դրա կազմ, իսկ մակերեսին ամրացվում են բիոտինինի հետ կապված պոլիէթիլենգլիկոլի մոլեկուլներ: Կապող ՀՄ-ն ֆիքսվում

է միկրոխցիկում և կապվում նմուշի կազմում առկա անալիտի՝ ՀԾ-ի հետ: Հաջորդ փուլում խցիկ է ավելացվում բիոտինի հետ կապված դետեկտավորող ՀՄ, որը ներմուծվող ստրեպտավիդինի միջոցով կապվում է լիպոսոմի բիոտինի հետ: Հատուկ պատրաստված ռեագենտը ապահովում է լիպոսոմի ճանաչումը և ընտրությունը հետագա վերլուծության համար: Առաջացած համալիրի դետեկցիան կատարում են լիպոսոմների կազմում գտնվող ԴՆԹ-ների ամպլիֆիկացիայի եղանակով: Այս մեթոդը կիրառվել է մարդու արյան մեջ կարցինոէմբրիոնալ ՀԾ-ի (CEA) խտության հետազոտման համար: Կատարված հետազոտության զգայունության մակարդակը գերազանցում է կլինիկական հետազոտությունների մակարդակը 1500 անգամ: Նույն եղանակը կիրառվել է նաև ՁԻԱվ-ի p24 սպիտակուցի քանակական որոշման համար: ILPCR-ը մեթոդը իմունոՊՇՌ-ի այլ մեթոդների համեմատ ունի մի շարք առավելություններ. Ռեպորտերների կապսուլավորումը լիպոսոմների կազմում թույլ է տալիս ԴՆԹ պոլիմերազ 1 ֆերմենտի կիրառմամբ քայքայել անալիտում առկա այլ ՆԹ-ները: Լիպոսոմի կազմում մի քանի տարբեր ռեպորտերների առկայությունը թույլ է տալիս շրջանցել անալիտում առկա պոլիմերազ ֆերմենտի ինհիբիտորների ազդեցությունը: Բիոտինացված լիպոսոմներ բացահայտող ռեագենտը կարող է ավիդինային կամրջակի միջոցով կապվել բազմաթիվ բիոտինացված զոնդերի հետ և կատարել ունիվերսալ ռեագենտի ֆունկցիա: Լիպոսոմների մակերեսային ֆոսֆոլիպիդները և ՆԹ-ները ներքաշվում են լիպոսոմի կազմ անմիջապես կապի ձևավորումից հետո և չեն խոչընդոտում լիպոսոմների բացահայտմանը:

4.4.2.1. Իմունոսենսորներ՝ ԻՍ Իմունոսենսորները ՀԾ-ՀՄ համալիրներ են, որոնք ըմբռնում և փոխանցում են լիգանդի հետ կապվելու մասին ազդակ: Անուղղակի ԻՍ-ները լինում են կապված որևէ՝ ֆլուորեսցենտ կամ քեմալյումինիսցենտ նշադրի հետ: Ուղիղ ԻՍ-ները բացահայտվում են ֆիզիկական ցուցանիշների՝ էլեկտրաստատիկ, ջերմաստիճանային, զանգվածային, pH-ի և այլ գործոնների փոփոխման միջոցով (նկ. 4.29): Այս դեպքում ՀՄ-ՀԾ ռեակցիան կարող է հետազոտվել ռեալ թայմ ռեժիմում: Իմունոսենսորների կիրառմամբ կատարված հետազոտությունը թույլ է տալիս բացահայտել թիրախ մոլեկուլների 10-9-ից մինչև 10-13 Մ/լ խտությունները: Իմունոսենսորները բնութագրվում են մի շարք հատկանիշներով. 1) բացահայտում են բարդ ռեկոմբինանտ տեսակայուրահատուկ նյութեր՝ ՀՄ-ՀԾ համալիրներ, 2) քանակական արդյունքը կարող է ստացվել ռեալ թայմ ռեժիմում, 3) արդյունքների գնահատման համար օգտագործվում են բազմատեսակ սարքեր՝ օպտիկական ճառագայթման, ջերմաստիճանի, զանգվածի, էլեկտրաքիմիական պրոցեսների չափիչներ, ՊՇՌ հետազոտություն և այլն:

նllոշ

i

Lltննա գգայոLն

~

~

_ 2tր,lյ1

l

Մqriաlո օul.iա1ոri l.. ~ոtuաuցոri qոr,6ոu

Նկ. 4.29. ԻՍ-ների աշխատանքի սխեման (Д.А. Черношей, Т.А. Канашкова, 2007):

Իմունոսենսորների խմբին են դասվում նաև պլազմիդների, ֆագերի և վիրուսների փոփոխման եղանակով ձևավորվող համակարգերը: ԻՍ-ների առավելությունների թվին են պատկանում. - կրկնակի օգտագործման հնարավորությունը, - նշադիր լիգանդների անհրաժեշտության բացակայությունը, - արդյունքների գնահատման հնարավորությունը ռեալ թայմ ռեժիմում, - բարձր զգայունությունը և յուրահատկությունը: ԻՍ մեթոդները լայնորեն կիրառվում և բարձր են գնահատվում դասական հետազոտությունների ոլորտում, սակայն կլինիկական պրակտիկայում դրանց կիրառման հեռանկարները դեռ պարզ չեն: 4.4.3. Պլազմիդների օգտագործումը ԻՊՇՌ հետազոտություններում Իմունաբանական վերլուծության ճշգրտության և զգայունության մակարդակի բարձրացման նորանոր ուղիների մշակման ընթացքում գիտնականների ուշադրությանն արժանացավ նաև բնական ԴՆԹ-ի օղակաձև մոլեկուլների յուրահատուկ խումբը՝ պլազմիդները: Պլազմիդների օգտագործումը կենսասենսորների ստեղծման գործընթացում օրինաչափ է, քանի որ, լինելով ինքնուրյուն բազմացող և հեշտությամբ վերակառուցվող տարր, դրանք լայնորեն օգտագործվում են կենսատեխնոլոգիական աշխատանքներում: Աշխատանքի նպատակն էր ստեղծել այնպիսի պայմաններ, որ հետազոտվող անալիտի նվազագույն խտությունները բացահայտվեն պլազմիդի ԴՆԹ-ի ամպլիֆիկացիայի եղանակով: Պլազմիդային ԴՆԹ-ի կազմում ընտրվեց հատված, որի ծայրերի համար պատրաստվեցին համապատասխան պրայմերներ: Ապա ամբողջ պլազմիդային ԴՆԹ-ի շղթայի մակերեսին ամրացվեցին ավիդինի մոլեկուլներ, որոնք չեզոքացվեցին և կայունացվեցին պոլիէթիլենգլիկոլի՝ PEG մոլեկուլներով (նկ. 4.30Ա): Որպես հետազոտության անալիտ ընտրվեց մարդու քորիոնիկ գոնադոտրոպին հորմոնը՝ ՔԳՀ: Ապա ընտվեցին ՔԳՀ ճանաչող

բիոտինացված ՀՄ և կապող ՀՄ-ները: Նկար 4.30Բ-ում ներկայացված է փորձի կատարման սխեման: 1-ին փուլում ՔԳՀ կապող ՀՄ-ն ամրացվում է փորձնական խցիկի հատակին: 2-րդ փուլում ավելացվում է հետազոտվող նմուշը, և կատարվում է ինկուբացիա, որի արդյունքում անալիտը միանում է կապող ՀՄ-ին: 3-րդ փուլում ավելացվում են ճանաչող բիոտինացված ՀՄ-ները, և կատարվում է ինկուբացիա: 4-րդ փուլում խցիկ են ավելացվում նախապատրաստված պլազմիդները: ՀՄ-ՀԾ համալիրը կապվում է պլազմիդային սենսորի ավիդինին: Լվացումից հետո ավելորդ չկապված նյութերը հեռացվում են:

ն

0 • 0 1. ~~ ~

·~

eJ •

ՊՊՊՊՊՊՊ'

ՊՊՊՊՊՊՊ'

-

Մ

կաUjրՄ]

~-

"lրայilեր

ՀՄ

Պյeո

աilա1~1>~~աg~ա

Նկ. 4.30. Պլազմիդային կենսասենսորների օգտագործմամբ ԻՊՇՌ-ի կատարման սխեման (Д. Чаван, Х. Чен, М. Крам, Б. Ву, М. Сафари, М. Смит, П. Векилов, Дж.К. Конрад, К. Куренци, Р. Уилсон, 2020):

5-րդ փուլում ջերմային մշակման արդյունքում խցիկում առկա պլազմիդային ԴՆԹ-ն անջատվում է իմունային համալիրից և ենթարկվում ամպլիֆիկացիայի նախօրոք պատրաստված պրայմերով: ՊՇՌ-ի միջոցով կատարվում է անալիտի որակական և քանակական դետեկ435

ցիան: Դետեկցիայի եղանակներն են կամ ռեալ թայմ ՊՇՌ մեթոդը, կամ այլ եղանակներ՝ էլեկտրաֆորեզ, ԴՆԹ-ի հալեցում և այլն: Նշենք, որ ներկայացվող հետազոտությունը կարող է կատարվել սովորական լաբորատոր սարքավորումների օգնությամբ և չի պահանջում հատուկ պայմաններ: Մեթոդի զգայունության մակարդակը շատ բարձր է և թույլ է տալիս բացահայտել անալիտի՝ նույնիսկ ֆեմտոմոլար քանակներ (աղ. 4.2): Աղյուսակ 4.2 Նյութի քանակական բնութագիրը խտություններով և մոլերով

lնոոe1ո UIյ

10 - -llt,1t,llոնա11

8անաtո 0կoո11[111

'1երոեկցt,Lն]ti t.11անակ0

3x10 161 Lո1որոllt.րո11'1կ

ծ

10· - llհկ11ոllոնա11 3x1013

ELIՏՃ 8եllոնոllt,Շit,նցենրո կերl[ոծորթյոU

10-9-նանոllոնարl 3x10

10 -ն.it,կոllոնա11 3X10

10 -~եllրոոllt,նա11 3x 10

կ

կ1::.UUա· ն:!արl կոt1 րոեtննո1ոգt,անt.11

- 1Ց

10 -արորոոllոնա11 30 -2 1

ր

10 -ցt.ն.iրոոllոնա11 0,3

4.4.4. ԻմունոՊՇՌ-ի մեթոդ՝ biobarcode assay ուռուցքների շիճուկային սպիտակուցների ախտորոշման համար Ինչպես հայտնի է, ուռուցքային բջիջները արտադրում են փոփոխված, տեր-օրգանիզմի բջիջների և հյուսվածքների համար օտար սպիտակուցներ և կարող են բացահայտվել այդ սպիտակուցների հայտնաբերման եղանակով: Ուռուցքների վաղ ախտորոշումը հաճախ կատարում են այդպիսի սպիտակուցների բացահայտման եղանակով: Ինչքան ավելի վաղ ժամկետում է կատարվում օտար սպիտակուցների՝ ՀԾ-ների բացահայտումը, այնքան ավելի հավանական է ուռուցքի հաղթահարման հնարավորությունը: Բայց վաղ ժամկետում օտար ՀԾների խտությունը աննշան է, և դրանց բացահայտումը պահանջում է

հետազոտման նոր տեխնոլոգիաների կիրառում: Այս նպատակով մշակվել է իՊՇՌ-ի մեթոդ, որը նախատեսում է ՀՄ-ների նշադրում ԴՆԹ-ռեպորտերով և բացահայտում ՊՇՌ-ի եղանակով: ՀՄ-ների ակտիվությունը պահպանելու նպատակով առաջարկվում է դետեկտավորող ՀՄ-ի և ԴՆԹ-ի շղթայի միավորումը կատարել հիմք ծառայող մեկ միկրոգնդի օգտագործման եղանակով: Այս դեպքում ՀՄ-ները պահպանում են իրենց կառուցվածքային յուրահատկությունները և աֆինությունը ՀԾ-ների նկատմամբ, իսկ ԴՆԹ-ի շղթաները անմիջապես կապվում են մագնիսային միկրոգնդերին (նկ. 4.31):

Նկ. 4.31. ԻՊՇՌ-ի եղանակով ուռուցքային էքզոսոմների դետեկցիայի սխեման (И.Г. Никитина, Е.Ю. Сабирова, O.Н. Солопова, С.А. Суржиков, Е.Н. Гринева, В.Л. Карпов, Н.А. Лисицын, С.Ф. Берестень 2014):

ոոոg12այt,ն tաոնո~

Մtllր11աՇ1

Հետազոտության թիրախ է ծառայում գրեթե բոլոր ուռուցքային բջիջներում սինթեզվող և արյան հոսք արտահանվող էքզոսոմների մակերեսային CDH17 սպիտակուցը:

Ուռուցքի աճին զուգահեռ աճում է էքզոսոմների խտությունը արյան մեջ, և այս ցուցանիշը օգտագործվում է ուռուցքների վաղ ախտորոշման համար: Փորձում օգտագործվում են երկու տեսակի ՀՄներ: Առաջին տեսակը՝ կապող ՀՄ-ները, պոլիկլոնալ են և կապում են էքզոսոմի մակերեսի CDH17 սպիտակուցի բոլոր էպիտոպները: Այս ՀՄ-ները կարող են ֆիքսվել խցիկի հատակին: Երկրորդ տեսակի ՀՄները մոնոկլոնալ են, միանում են միայն ուռուցքային էպիտոպներին: Իմունային համալիրի ձևավորումից հետո ԴՆԹ-շղթաները ենթարկվում են ՊՇՌ-ի համապատասխան պրայմերի հետ, և կատարվում է բացահայտված ՀԾ-ի քանակական դետեկցիա: Մեթոդի բարձր զգայունության և ճշգրտության շնորհիվ փոփոխված ուռուցքային բջիջների առկայությունը բացահայտվում է նույնիսկ աննշան խտության դեպքում: Այսպիսով՝

իՊՇՌ-ի

հնարավորությունները

ընդլայնվում

են

նանոգնդերի օգտագործման շնորհիվ: Մագնիսային կամ ոսկյա նանոգնդերը չեզոքացնում են խառնուրդային նյութերի ազդեցությունը և բարձրացնում

հետազոտության

զգայունության

ու

ճշգրտության

մակարդակը: Մագնիսային գնդերը պարունակում են երկաթի օքսիդ և ունենում են 15-ից 20 նմ տրամագիծ: Մագնիսային նանոգնդերը օգտագործվում են նաև ՄՌՏ-հետազոտություններում՝ կալցիումի աղերի և ուռուցքային բջիջների in vivo բացահայտման համար (Т.К. Джексон, Б.О. Патани и Д.Е. Экпа, 2017): Ոսկյա նանոգնդերը ավելի փոքր են՝ մինչև 13 նմ տրամագծով, պարունակում են ոսկե նյութ և նշվում՝ AuNP: Ոսկյա նանոգնդերը օգտագործվում են բիոշտրիխկոդ տեխնոլոգիաներում: Դրանց օգտագործման շնորհիվ զգալիորեն բարձրանում է կատարվող հետազոտության զգայունության և ճշգրտության աստիճանը: Դրանք օգտագործվում են տարբեր տեսակի բիոսենսորների ստեղծման

համար

(А.Дж. Мешавска, В.Дж. Малдер, З.А. Файад, Д.П. Кормод, 2013): Մեթոդը ստացավ բիոբարկոդ վերլուծություն՝ biobarcode assay անվանումը:

Հետազոտության պրոցեսում ընդունված է մագնիսային գնդերը միացնել կապող մոնոկլոնալ ՀՀՄ-ներին, իսկ ոսկյա գնդերը՝ դետեկտավորող պոլիկլոնալ ՀՄ-ներին և ԴՆԹ-նիշ ռեպորտերներին: Վերլուծությունը կատարվում է սենդվիչ եղանակով, ապա իմունային համալիրները հավաքվում են մագնիսով և ԴՆԹ-ն անջատում հաջորդ փուլում ՊՇՌ-ի կատարման համար: Մեթոդը կոչվեց բիոբարդինգ, քանի որ առաջին տարբերակում առաջարկվում էր դետեկցիան կատարել սկանոմետրիկ եղանակով: Այս դեպքում անջատված ԴՆԹ շղթաները կոնյուգացվում էին ապակե մակերեսին կապված և ռեպորտային ԴՆԹ-ի շղթայի կեսին կոմպլեմենտար ԴՆԹ-ի հատվածների հետ: Ապա ներմուծում էին ոսկյա արծաթապատ գնդեր, որոնց մակերեսին ամրացված էին ռեպորտային ԴՆԹ-ի երկրորդ կեսին կոմպլեմենտար հատվածներ: Եթե ռեպորտային ԴՆԹ-ն առկա էր, ռեակցիայի վայրում կատարվում էր միացում և համակարգը արձակում էր ազդակ (նկ. 4.32): Մեթոդի կարևոր առավելությունը այն է, որ այս եղանակով հնարավոր է միաժամանակ բացահայտել մի շարք տարբեր ՀԾ-ներ: Անհրաժեշտ է յուրաքանչյուր դետեկտավորող ՀՄ-ի տեսակին համապատասխան ընտրել յուրահատուկ նուկլեոտիդային հերթականություն՝ ԴՆԹ-նիշ: Մի քանի առանձին ՀՄ-ների համար ընտրված ԴՆԹ-նիշերը կկազմեն նիշերի գրադարան՝ շտրիխ կոդ: Հատուկ ԴՆԹ-նիշերը կօգտագործվեն հետազոտվող խառնուրդում որոշակի նպատակային պրոտեինի՝ թիրախ ՀԾ-ի բացահայտման համար: Օրինակ՝ Բարկոդ գրադարանի կիրառմամբ ադենոմա ուռուցքի ՀԾ՝ PSA-ի բացահայտման համար օգտագործվող ոսկյա նանո-զոնդերի պատրաստման սխեման ներկայացվում է նկար 4.33-ում: Նկարում պատկերված B պրոտեինը հակա-PSA ՀՄ է, որի ԴՆԹ-նիշը շտրիխ կոդերի գրադարանի 2-րդ շղթան է:

~

1.l.---5H

~-ր$""t

2.Ց1t, շt,llոljայt,ն ա1րոն~ ~ ~ 'luԹ շրն,ա

3. -

նանոգնրiաit,ն ննոշ

1.Մ 2.Ց1t, շt,ծոljայt,ն ա1րոնl. Uագնt,նե գնրit, հեո ljա1.կtjած ՀU ոնljյա նանոգոնրi

~N' Uոնո1յ1ոնա1

-ո·

հաljա- րsՃ

1...---ՏH-'1ն0-նt,շ Մ

_

'1ն0-t, Բարilյորi

Uագնt,նաit,ն նանոգոնրi

'llո1tilյ1ոնա1 հաljա-ԲՏՃ

1-t,[յ lflոlլ Uնա1t,ոo կա1.կtjոն նագնt,նաit,ն գնրit,ն

t

@ա"'" ': """'" @ ULLյաLոաljայրlU 1.կրiոոot,ն· անա1t,ո 3-րiրi lflոLլ ր.նոնաit,ն հանա1tiրio ան2աոtjոն t նագնt,նոtj, '1նԹ-t, նt,20 ա1.կահt,րրit,րiացtjոն t

----- - -+--------'

աri1յոri%@ =!կ

Հllոգ կ. '1եոեljցt,ա ար,անց 'llա-t,

Uագնt,նաit,ն րiաշո

Նկ. 4.32. 1 - Դետեկցիայի համար մագնիսային և ոսկյա նանոգնդերի ձևավորում: 2 - biobarcode assay մեթոդի սխեման (J.M. Nam, C.S. Thaxton, C.A. Mirkin, 2003):

Պlրiոոtրն Ճ 8 Շ D E .. .

~

'luրa 2'1.Pա ~ 1 ~ 2 ~3 ~կ5 ... ~ ; : ~ '1նրթ րարilյորi.ր tրնորiաljո Տարiրtրi LllրՊlոոtրննtրiր 1որiահաոոկ'1նրթ րարiljորi.tրiր

գրiարi.արiան

y Շl ~:,..,,,,..., ,,. ..,. . , ՊՊ'Պ' ~I~ 1~'"

Պlրiոոեt,ն B-ti րացահայLiltlան հաtlարi oգLI1ագորiծL[որi. յորiահաlllոl.j 'lնԹ-հաLI1L[ածներi Iյ.1ար1ոնաl.jորi նանոգոնրi

ոնկ1ա նանոգոն11

1...,,--sH Llա1յ.1L[ած 'lնԹ -

'lliԹ րարiLiորi

Մ

ՀաLiա-ԲՏՃ

Նկ. 4.33. PSA բացահայտման համար օգտագործվող հատուկ նանոգնդի պատրաստ շտրիխ կոդերի օգտագործման եղանակ (փոփոխված, https://www.cheric.org/files/education/cyberlecture/e201402/e201402-901.pdf):

4.4.5. Էլեկտրաքիմիական վերլուծություն Էլեկտրաքիմիական վերլուծությունը կատարվում է նանոմասնիկների օգտագործման եղանակով: Որպես կանոն՝ կապող ՀՄ-ները միացվում են միկրոխցիկի հատակին, իսկ դետեկտավորող ՀՄ-ները՝ ոսկյա նանոգնդերին: Վերլուծությունը կատարվում է սենդվիչ եղանակով: ՀՄ-ՀԾ կապի ձևավորման պահին էլեկտրոդները ֆիքսում են էլեկտրական հոսանք: Բոլոր օգտագործվող տարրերը միկրոսկոպիկ են, այսինքն՝ օգտագործվում են ածխաջրային նանոխողովակներ, քվանտային կետեր կամ նանոբյուրեղներ, ոսկյա նանոգնդեր: Փորձի կատարման սխեման ներկայացվում է նկար 4.34-ում:

Նկ. 4.34. Էլեկտրաքիմիական վերլուծության կատարման փուլերը (Н.А. Лисицын, А.А. Чёрный, И.Г. Никитина, В.Л. Карпов, С.Ф. Берестень, 2014, փոփոխված):

Ուռուցքների վաղ ախտորոշման մեթոդների բարելավման նպատակով Վան Դոնգը աշխատակիցների հետ մշակել է լյարդի ցերոզի ախտորոշման իմունաէլեկտրաքիմիական վերլուծության մեթոդ՝ SMIA, որը թույլ է տալիս միաժամանակ ախտորոշել երեք օնկոնշադիրների առկայությունը: Մեթոդը աչքի է ընկնում արագ կատարման, տնտեսվարության, ՀԾ-ների քանակական որոշման և արդյունքների ճշգրտության բարձր մակարդակով: Փորձի կատարման համար ընտրվել են 3 էլեկտրաքիմիական օքսիդացվող-վերականգնվող նյութեր, որոնք տարբերվում են վոլտամպերմետրային ցուցանիշներով: Այդ նյութերը օգտագործվել են տարբեր ՀՄ-ներ նշադրելու համար: Ապա դրանք տեղափոխվել են փորձի ճշգրտության աստիճանը բարձրացնող ոսկյա նանոմասնիկներով պատված նանոխողովակների վրա: Գրանցելով ՀՄ-ՀԾ 3 տիպի համալիրների ձևավորման դեպքերը՝ գիտնականները ապացուցել են

օնկոնշադիրների առկայությունը նմուշում, ապա կատարել ՀԾ-ների քանակական դետեկցիա (նկ. 4.35): Այսպիսով՝ վոլտամպերմետրը ֆիքսել է երեք տարբեր ուժի ազդակներ տարբեր իմունային համալիրների ձևավորման պահին, ինչը և ապացուցել է մեթոդի արդյունավետությունը: Ուստի տեխնոլոգիան առաջարկվել է որպես տարբեր տեսակի ուռուցքային հիվանդությունների վաղ ախտորոշման և ուրեմն բարձր հավանականությամբ բուժելու արդյունավետ ու հասանելի մեթոդ:

Նկ. 4.35. Էլեկտրաքիմիական վերլուծության սխեման 3 նմուշների ախտորոշման դեպքի համար (https://blogs.rsc.org/cc/2011/11/09/once-twicethree-times-a-potential-life-saver):

4.4.6. Մուլտիպլեքսային ԻՖՎ՝ multiplex assay Կենդանի օրգանիզմների բջիջներում կատարվող պրոցեսները սովորաբար բարդ են և բազմագործոնային: Երբեմն պրոցեսի ըմբռնման համար անհրաժեշտ է բացահայտել մի քանի տասնյակ տարբեր սպիտակուցներ: Սովորական մեթոդներով կատարվող հետազոտությունը կլինի շատ աշխատատար և երկարատև: Վերլուծությունների արագ և ճշգրիտ կատարման համար կիրառվում է մուլտիպլեքս վերլուծություն միկրոգնդերի տեխնոլոգիաների մեթոդը: Մի շարք կազմակերպություններ արտադրում են համապատասխան սարքավորումներ, որոնց օգնությամբ կատարվում է հետազոտությունը և դետեկտավորվում են ստացված արդյունքները՝ Merсk (Millipore),

Luminex - MAGPIX, Luminex 200, Bio-Plex 3D: Հետազոտության համար օգտագործվում է Bio-Plex Manager ծրագրի 6-րդ տարբերակը: Նշված սարքավորումների կիրառմամբ հնարավորություն է ստեղծվում նույն հետազոտության պրոցեսում դետեկտավորել մի քանի տասնյակ անալիտ: Մուլտիպլեքսությունը՝ բազմաթիվ գունային երանգների ստեղծումը, կատարվում է միաժամանակ 2-3 ֆլուորեսցենտ ներկանյութերի օգտագործման եղանակով: Արդյունքում ներկանյութերի տարբեր խտություններ պարունակող խառնուրդները արձակում են յուրահատուկ ազդակներ, որոնք և ճանաչում է համապատասխան վերլուծող և գրանցող սարքը՝ Luminex - MAGPIX կամ որևէ այլ անալիզատոր: Ամեն միկրոգունդ միացվում է որոշակի անալիտի նկատմամբ յուրահատուկ ՀՄ-ի և կատարվում է, օրինակ, բջջային լիզատի հետազոտում: Փորձը կատարվում է միկրոգնդերի հոսող ֆլուորոմետրիայի եղանակով: Մուլտիպլեքսային վերլուծող սարքերը թույլ են տալիս բացահայտել նույն տեսակի՝ ԴՆԹ, ՌՆԹ, սպիտակուցների բազմաթիվ տարատեսակներ: 2-3 ներկանյութերի խառնուրդը ապահովում է ամեն միկրոգնդի յուրահատուկ նշադրում և ամեն մի գնդի անհատական ճանաչման հնարավորություն: Ամեն մի գնդի վրա գտնվող սպիտակուցներ դետեկտավորող ՀՄ-ները կապված են յուրահատուկ ֆլուորեսցենտ նիշերի հետ: ՆԹ-ների դետեկցիայի համար օգտագործվում են ֆլուորեսցենտ նիշ կրող միաշղթա ԴՆԹ-ներ: Այսպիսով՝ վերլուծող սարքը ճանաչում է ամեն մի գունդը և դրա վրա առկա ֆլուորեսցենտ նիշը: Ֆլուորեսցենտ նիշի ազդակի ուժը բացահայտում է կապված անալիտի քանակը՝ խտությունը նմուշում (նկ. 4.36): Վերլուծության համար օգտագործվում են սովորական 96 խցիկ պարունակող պլանշետները: Մեթոդը կոչվում է Luminex xMAP և թույլ է տալիս մեկ հետազոտության ընթացքում բացահայտել մինչև 500 տարբեր անալիտներ:

ti

Նկ. 4.36. 1 - Մուլտիպլեքսային հետազոտության կատարման քայլերը և փուլերը: 2 - Luminex xMAP տեխնոլոգիայի կատարման համար օգտագործվող սարքերի համալիրը (https://www.ld.ru/multiplex/ilist-4286.html):

Ա. Luminex xMAP տեխնոլոգիայի կատարման համար օգտագործվում են 5,6 մկմ տրամագծով պոլիստիրոլային գնդեր: Գնդերը ներկվում են երկու լյումինիսցենտ կարմիր ներկանյութերի տարբեր խտություններով: Ստացվում են 100 տիպի ներկված և տարբեր լուսային ազդակներ արձակող գնդերի տարբերակներ: Բ. Կապող գործոնների ամրացում գնդերի մակերեսին: Կապող գործոնները համապատասխանում են հետազոտվող անալիտին: Որոշակի գունային նիշ կրող գնդերին միացվում են միայն մեկ թիրախ անալիտին համապատասխանող կապող գործոններ: Գ. Պլանշետի խցիկներում գտնվող նմուշին ավելացնել 2500 նախապատրաստված միկրոգնդեր: Յուրաքանչյուր տիպի միկրոգունդը կրում է որոշակի կապող գործոն և կարող է կապել միայն որոշակի անալիտ: Դ. Ավելացնել դետեկտավորող, ֆլուորեսցենտ նիշ կրող գործոններ:

Ե. Դետեկցիան կատարվում է հոսող եղանակով: Վերլուծող սարքը ճանաչում է ամեն մի գունդը, դրանով իսկ արձակվող ազդակի տիպով թիրախ անալիտը և դետեկտավորող գործոնի ֆլուորեսցենցիայի մակարդակով որոշում կապված անալիտի քանակը: Մուլտիպլեքսային ԻՖՎ՝ multiplex assay տեխնոլոգիայի առավելությունները Multiplex assay տեխնոլոգիան ունիվերսալ է, ճշգրիտ և թույլ է տալիս կարճ ժամկետում՝ 1 ժամում կատարել 85000 վերլուծություն: Ստացված արդյունքների ճշգրտության մակարդակը բարձր է և ստուգելի. փորձը կարող է կրկնվել նույն հետազոտության սահմաններում: Տեխնոլոգիան տնտեսվարական է՝ պահանջում է ռեագենների նվազագույն քանակ: Ստացված արդյունքների վերլուծությունը կատարվում է համակարգչային եղանակներով, հատուկ ծրագրերով: Մուլտիպլեքսային ԻՖՎ՝ multiplex assay տեխնոլոգիայի կիրառման բնագավառները Multiplex assay տեխնոլոգիան կիրառվում է հիստոհամատեղելիության համալիրի գեների ուսումնասիրման համար: ՀՀ համալիրի գեները կազմում են բարդ համախումբ, գերպոլիմորֆ են և բազմալելային: Դրանց հետազոտությունը և ախտորոշումը կարևոր է ինչպես գիտական հետազոտությունների, այնպես էլ փոխպատվաստման խնդիրների լուծման համար: Multiplex assay տեխնոլոգիայի կիրառմամբ կատարվում են գենոմի հետազոտությունները, գեների կազմի և կառուցվածքի, առանձին տարրերի ֆունկցիայի ուսումնասիրությունները, գենետիկական, պրիոնային և այլ մոլեկուլային բնույթի հիվանդությունների ախտորոշումը: Լուծվում են էկոլոգիական և այլ խնդիրներ:

4.4.7. Մոլեկուլյար-կենսաբանական մեթոդ Ֆագային իմունահամալիրային վերլուծություն (PHAIA) Գերզգայուն իմունահամալիրային վերլուծության մեթոդների զարգացման աշխատանքների սկզբնական շրջանում որպես ճանաչման համակարգի միջնորդ տարր առաջարկվեց օգտագործել ֆագեր և վիրուսներ: Ֆագի մակերեսին ամրացվում էր կարճ պեպտիդային շղթա, որը միանում էր ՀՄ-ՀԾ համալիրին: Ավելի ուշ մեթոդի հնարավորությունների ընդլայնման նպատակով կիրառվեցին գենային ինժեներիայի տեխնոլոգիաները: Այս աշխատանքները հիմք դարձան բացարձակ նոր մոլեկուլյար-կենսաբանական հետազոտման մեթոդի ստեղծման համար: Քսաներորդ դարի 80-ական թվականներին Ջորջ Սմիթը տեղափոխեց М13 ֆագի pIII մակերեսային սպիտակուցի ընթերցման շրջանակի կազմ EcoRI էնդոնուկլեազ ֆերմենտի գենի հատվածը: Ապա ապացուցվեց ֆագի EcoRI–pIII քիմերային սպիտակուցի ունակությունը կապվել էնդոնուկլեազի նկատմամբ զգայուն պոլիկլոնալ ՀՄ-ների հետ: Այս մեթոդի կիրառությունը թույլ տվեց ստեղծել ֆագային տարատեսակներ, որոնք էքսպրեսավորում են մակերեսային բազմազան հիբրիդային սպիտակուցներ (106–1011 տարբերակներ): Յուրաքանչյուր կլոնի յուրահատուկ սպիտակուցը ճանաչում է որոշակի անալիտ և կարող է օգտագործվել դրա բացահայտման համար: Ֆագային մասնիկների կարևոր առանձնահատկությունն այն է, որ դրանք միավորում են մեկ տարրի կազմում մակերեսային պեպտիդը և դրան կոդավորող գենոմային հերթականությունը: Ֆագերի բազմազան տարատեսակներից կազմված պոպուլյացիաները անվանեցին ֆագային գրադարաններ: Ֆագային գրադարանները կազմված են ֆագերի պոպուլյացիաներից, որոնք ստեղծվում են դրանց գենոմի կազմ օտար հերթականությունների ներմուծման եղանակով: Ներմուծումը կատարվում է հատուկ վեկտորների՝ ֆագմիդների միջոցով: Որպես ներմուծվող հատված օգտագործում են ՀԾ ճանաչող ՀՄ-ների յուրահատուկ

զգայուն ֆրագմենտները կոդավորող նուկլեոտիդային հերթականությունները: Ֆագային գրադարանները լինում են բնական, որոնք ստացվում են դոնորների արյան տարբեր B լիմֆոցիտային ռեցեպտորների ՀՄները կապող հատվածներից, կամ սինթետիկ (կոմբինատոր), որոնք ստեղծվում են նպատակային մուտագենեզի եղանակով (A.D. Griffiths, A.R. Duncan, 1998): Ֆագերի մակերեսային սպիտակուցների կազմում օտար պոլիպեպտիդների էքսպրեսիան ստացավ ֆագային դիսպլեյ (phage display) անվանումը: Մշակվեց նաև բիոպեննինգի եղանակը (biopanning), որը թույլ տվեց ֆագային տարատեսակներից ընտրել այն տարբերակները, որոնք ամուր ձևով՝ բարձր աֆինությամբ փոխազդում են որոշակի անալիտի հետ (S. Parmley, G. Smith, 1988): Ֆագի կապսիդում առկա է pIII սպիտակուցի միայն 5 մոլեկուլ, որը բավարար չէ արդյունավետ իմունոգեների ստեղծման համար: pVIII սպիտակուցի պատճենների քանակը կապսիդում հասնում է 3 000-ի: Ուստի այս սպիտակուցի վերակառուցումներն ավելի արդյունավետ կյինեն ֆագային դիսպլեյի եղանակով կատարվող աշխատանքներում: Երկարատև հետազոտությունների արդյունքում ռուս գիտնականներին հաջողվեց գտնել pVIII սպիտակուցը կոդավորող գենի N ծայրում հատված, որի կազմ ներմուծվող հավելյալ ԴՆԹշղթան առաջացնում է հիբրիդային իմունոգեն սպիտակուցի էքսպրեսիա և չի խոչընդոտում ֆագի նորմալ զարգացումը (А. Ильичев и др., 1989, O. Minnenkova, A. Ilyichev, G. Kishchenko, 1993): Արդեն 90-ական թվականներին հաջողվեց ֆագային դիսպլեյի մեթոդով ստեղծել ֆագերի գծեր, որոնց մակերեսային սպիտակուցների կազմում առկա էին տարբեր ՀԾ-ներ կապող ԻԳ-ների ակտիվ կենտրոններ: Արդյունքում մշակվեց հիբրիդոմային տեխնոլոգիան փոխարինող ռեկոմբինանատ ՀՄ-ների արտադրության նոր՝ ռեկոմբինատոր մեթոդ: Ֆագային դիսպլեյի մեթոդի հաջող զարգացումը պայմանավորված է թելիկային ֆագերի կառուցվածքային առանձնահատկություն448

ներով: Այս խմբին են պատկանում F-պլազմիդ պարունակող Escherichia coli-ի լավ ուսումնասիրված հարուցիչներ՝ М13, f1 և fd ֆագերը: Ներկայացվող ֆագերի գենոմները հետազոտվել են և պարզվել է, որ դրանց նմանության աստիճանը հասնում է 98 %: Նշված պատճառներով բոլոր նման ֆագերը միավորվել են Ff խմբի մեջ: Ֆագերի օղակաձև գենոմը ներկայացված է միաշղթա + ԴՆԹ-ով և կազմված է մոտ 6400 ն-ից: Գենոմի կազմում առկա են 11 սպիտակուց կոդավորող գեներ: Գեները հավաքված են խմբերով՝ ռեպլիկացիայի սպիտակուցներ կոդավորող գեներ (II, V, X), կապսիդի սպիտակուցների գեներ (III, VI, VII, VIII, IX), վիրիոնի կազմավորման և ԴՆԹ-ի դրական+ և բացասական- շղթաների ռեպլիկացիայի ori-ները (I, IV, XI): Բացի դրանից՝ գենոմում առկա է նաև միջգենային չկոդավորող հատված: Ֆագը նման է խողովակի և կազմված է մոտ 2700 VIII սպիտակուցի պատճեններից կազմված կապսիդից, իսկ ծայրերում գտնվում են մնացած գեներով կոդավորվող սպիտակուցների 5-ական պատճեններ (նկ. 4.37):

րill

րՄI

րՄIII

Ut)աշրtiթա oրtաt.iած1.. 'luրa

րՄII

րlX Նկ. 4.37. Ա - թելիկայյին ֆագերի կազմության սխեման: Բ - Թելիկային ֆագի տրանսֆորմացիայի եղանակով ձևավորված ֆագային ՀՄ (https://ppt-online.org/498534):

Escherichia coli-ի վարակումը ֆագերով կատարվում է բակտերիայի թաղանթի վրա գտնվող խողովակաձև F պիլերի պիլինի և III սպիտակուցի փոխազդեցության արդյունքում, որն առաջացնում է

պիլերի ապապոլիմերացում և ներքաշում ֆագը բջջի մեջ: E.coli-ի ցիտոպլազմում ֆագի միաշղթա ԴՆԹ-ի վրա բջջի ռեպլիկացիայի ֆերմենտների ակտիվությամբ սինթեզվում է զույգ շղթան, և ձևավորվում է պլազմիդանման RF ռեպլիկատիվ մոլեկուլ: RF մոլեկուլը ունակ է կրկնապատկվել, և դրանից ընթերցվում են ֆագային սպիտակուցներ կոդավորող իՌՆԹ-ները: Ֆագային գրադարանի ստեղծման համար բակտերիայի բջիջ են ներմուծվում տարբեր պեպտիդների հատվածներ կոդավորող ֆագմիդներ, որոնք ֆագերի կրկնապատկման փուլում միավորվում են ֆագի գենոմի հետ և դառնում դրա մասը: Ապա բջջում կուտակվում են կապսիդային սպիտակուցներն ու ֆագային ԴՆԹները: Երբ pV սպիտակուցի խտությունը հասնում է որոշակի սահմանի, սինթեզվում է միաշղթա ֆագային ԴՆԹ, որը միավորվում է pV-ի հետ, տեղափոխվում բակտերիայի թաղանթի մոտ և ձևավորում կապսիդ: Կապսիդի ձևավորման ավարտից հետո ֆագերը դուրս են գալիս բջջից (Լ.Մ. Մելքոնյան, 2016): Բակտերիան չի քայքայվում և շարունակում է կենսագործել միգուցե մի փոքր ավելի դանդաղ, քան չվարակված բջիջը (P. Model, M. Russel, 1988): 4.4.7.1. Թելիկային բակտերիոֆագերից ձևավորվող վեկտորների տեսակները Ֆագմիդ կոչվող՝ ֆագի և պլազմիդի ժառանգական նյութ պարունակող վեկտորը ձևավորվում է թելիկավոր ֆագերի ԴՆԹ-ի հիման վրա (B. Kay, G. Winter, J. McCafferty, 1996): Դրա կազմում միավորվում են ֆագի և պլազմիդի ori հատվածները, ֆագի կապսուլավորում առաջացնող Ff հատվածը, pIII գենը, պոլիլինկերը և հակաբիոտիկի նկատմամբ կայունության գենը (D. Mead, B. Kemper, 1988): Ֆագային դիսպլեյի համար մշակվել են կապսիդային 5 սպիտակուցների վեկտորային համակարգեր, սակայն հաճախ օգտագործվում են III և VIII սպիտակուցների համակարգերը: Այդ վեկտորային համակարգերը նշվում են համապատասխանաբար 3 և 8 համարներով (նկ. 4.38):

:: : : :::::'

:111~

~•: 1 2 2::::i:::: 11:::l~

::::~ i : : : :

• 8 8

~

Նկ. 4.38. Սպիտակուցների և պեպտիդների դիսպլեյի համար օգտագործվող ֆագային վեկտորների տեսակները: Գենոմում այլ գույնով նշված են ներմուծված օտար հատվածները (https://ppt-online.org/498534):

Պարզվել է, որ ֆագմիդի կազմում ներմուծվող գենի չափսերը ազդում են ֆագի կապսիդի ձևավորման և բջիջը վարակելու ունակության վրա, այդ պատճառով կամ ֆագի կազմում պահպանում են նաև սեփական սպիտակուցներ կոդավորող՝ 33 կամ 88 գեների տարբերակները, կամ մոդիֆիկացված ֆագի հետ միասին օգտագործում են նաև սովորական՝ «օժանդակ ֆագը» և դրանով ապահովում մոդիֆիկացված ֆագի նորմալ գործունեությունը՝ 3+3 կամ 8+8 տարբերակները: 8+8 համակարգերը պոլիվալենտ են, պարունակում են կապսիդի կազմում և վայրի և մոդիֆիկացված սպիտակուցներ: Բայց VIII-րդ սպիտակուցի բարձր խտության պայմաններում յուրաքանչյուր ֆագի վրա առկա է մի քանի հարյուր մոդիֆիկացված սպիտակուց, որի շնորհիվ ֆագի ընդհանուր աֆինությունը բարձր է, և այս համակարգը թույլ է տալիս բացահայտել նույնիսկ ցածր աֆինություն դրսևորող անալիտներ: Ֆագի կապսիդում համար 3 սպիտակուցը ներկայացված է առավելագույնը 5 պատճեններով, բայց միայն ֆագերի 10 %-ն է կրում գոնե մեկ ռեկոմբինանտ սպիտակուց, այնպես որ այս գենոտիպով ֆագերի աֆինությունը շատ թույլ է և դրանք կապում են միայն շատ բարձր աֆինությամբ ՀՄ-ներ: Ուստի այս մոդիֆիկացիաները օգտագործվում են բարձր աֆինությամբ օժտված մոլեկուլների ընտրության համար: Այսպիսով՝ 3+3 համակարգը օգտագործվում է բարձր աֆինությամբ ՀՄ-ների ընտրության համար:

4.4.7.2. Ֆագային դիսպլեյի հիմնական փուլերը Թիրախ ՀՄ-ների ճշգրիտ ընտրության համար անհրաժեշտ է առաջին հերթին կազմել ֆագային ՀՄ-ների գրադարան և ապա ճշգրիտ կատարել բիոպեննինգը: ՄH

ՄL

,J'

Lեն~երi

sԸՒv

Ւթե

Նկ. 4.39. Բնական ԻԳ-ի կառուցվածքը և հակածին կապող հատվածները (https://ppt-online.org/498534):

ՀՄ-ների գրադարանը ստեղծվում է ֆագի գենոմի ֆագմիդային ռեկոմբինացիայի եղանակով, որի ժամանակ ֆագմիդի կազմում ֆագի գենոմի рIII սպիտակուցը կոդավորող գենի կազմ է ներմուծվում որոշակի ՀԾ կապող ՀՄ-ի ճանաչման կենտրոնը կոդավորող ԴՆԹ հերթականություն: Պոլիկլոնալ ՀՄ-ների ճանաչման կենտրոնները տարբեր են, և համապատասխանաբար ֆագերի գենոմ են ներմուծվում տարբեր կոդավորող հերթականություններ: Այսպիսով՝ առաջացած ՀՄ-ների կոմբինատոր ֆագային գրադարանը ֆագերի պոպուլյացիա է, որի կազմի ամեն մի ֆագ էքսպրեսավորում է рIII սպիտակուցի կազմում որևէ ՀՄ-ի ճանաչման կենտրոնի կամ Fab-ֆրագմենտի հատված (single chain variable fragment – scFv) (նկ. 4.39): Մոդիֆիկացված ֆագերով վարակում են բակտերիաները, դրանք բազմանում են՝ առաջացնելով բազմանդամ կոմբինատիվ ֆագային գրադարան (նկ. 4.40):

Ծ

Qt:ե[յt:.րր նt:.րilոծոlll Թ )H :jlագilրրlր ljագil ՄL Ճրr րHԲN Պ'Պ' E.Ըoli-ր Բ2ր2նt:.11ր Ul[lաUն:jlորilացրա

Ծ

րlll

Բ.cօli T61

Նկ. 4.40. ՀՄ-ների հատվածների ֆագային գրադարանի ստեղծման սխեման (https://pptonline.org/498534):

Ստեղծված գրադարանի ֆունկցիոնալ ծավալը համարվում է լիարժեք կազմակերպված և անթերի, եթե կազմված է բավարար քանակությամբ թիրախ գեներ կրող ֆագային կլոնների հանրագումարից: Գրադարանի ֆունկցիոնալ ծավալը ավելի փոքր է, քան ստացված կլոնների քանակը, բայց հենց այս կլոններն են օգտագործվում որպես անալիտը ճանաչող տարրեր (Т. Батанова и др., 2006): Թիրախ անալիտի նկատմամբ բարձր աֆինություն դրսևորող ռեկոմբինանտ ֆագային ՀՄ-ների ընտրության համար կատարում են բիոպեննինգ (նկ. 4.41): 1. Բիոպեննինգը՝ ընտրությունը, կատարում են ամրացված, իմոբոլիզացված ՀԾ-ների օգտագործմամբ: Այդ նպատակով ՀԾ-ները ֆիքսվում են կամ իմունափորձանոթներում (Maxisorb tubes, Nalge Nunc Intl., Naperville, IL), ԻՖՎ համար օգտագործվող պլանշետների կամ բիոչիպերի վրա:

ա

բ Նկ. 4.41. ա - Բիոպեննինգի կատարման ընթացքը (https://ppt-online.org/498534), բ - ռեկոմբինանտ ֆագերի ընտրության փուլերի սխեման (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15703290/):

Որոշ դեպքերում այս եղանակով կապված բնական ՀԾ-ները չեն ճանաչվում ֆագային ՀՄ-ներով, այդ պատճառով կարող է կիրառվել ՀԾ-ների անուղղակի ֆիքսման եղանակը. փորձանոթում ֆիքսվում է յուրահատուկ ՀՄ-ն, որը և կապում է թիրախ ՀԾ-ն: Յուրահատուկ

կապված ՀՄ-ների էլուցիայի կամ լուծման համար օգտագործվում են մի շարք լուծույթներ՝ գլիցինային բուֆեր, հիմնային լուծույթներ, HCl և այլն (J. Marks, et al., 1991, A. Kang, et al., 1991, B. Roberts, et al., 1992): ՀՄ-ների էլյուցիան կատարվում է նաև պրոտեազներով կամ ՀԾ-ների բարձր խտությունների օգտագործման եղանակով: 2. Բիոպեննինգի զգայունության և ճշգրտության աստիճանի բարձրացման նպատակով օգտագործվում է բիոպեննինգ ՀԾ-ների լուծույթում մեթոդը: ՀԾ-ի իմոբիլիզացիան կարող է առաջացնել մոլեկուլի կառուցվածքային՝ կոնֆորմացիոն փոփոխություն, որն իր հերթին ազդում է դրա աֆինության մակարդակի վրա և շեղում իմունային համալիրի առաջացման բնական ընթացքը: Այսպիսի փոփոխություններից խուսափելու նպատակով հաճախ կիրառվում են մեթոդներ, որոնք նախատեսում են ՀԾ-ՀՄ համալիրի ձևավորումը լուծույթում: Ինկուբացիայի արդյունքում բիոտինացված ՀԾ-ի և ֆագային ՀՄ-ի միջև կապի ձևավորումից հետո ֆագերը անջատվում են լուծույթից ստրեպտավիդինով կամ ավիդինով պատված պարամագնիսային գնդիկների օգնությամբ: Անջատված համալիրները քայքայվում են, և ՀՄ-ները գնահատվում: 3. Բիոպեննինգը կարող է կատարվել նաև բջիջների վրա: Բիոպեննինգը կատարում են կամ բջջային սուսպենզիայում կամ բջջային միաշերտի վրա: Այս դեպքում թեստավորվում են բջջի թաղանթային ռեցեպտորների հետ կապված ՀԾ-ների նկատմամբ յուրահատուկ ֆագային ՀՄ-ները: Չկապված ֆագային ՀՄ-ները լվացումով հեռացնում են բջջային միաշերտից, իսկ սուսպենզիան ցենտրիֆուգում: Ֆագային ՀՄ-ների ընտրության օպտիմիզացումը կատարվում է բացասական ընտրության եղանակով, որը կարող է կիրառվել հիմնական դրական ընտրության հետ զուգահեռ, դրանից առաջ կամ հետո: Բացասական և դրական ընտրության համատեղման դեպքում փորձում օգտագործվում են փոքր քանակությամբ նպատակային՝ թիրախ ՀԾ կրող բջիջներ և մեծ քանակությամբ այլ, ոչ նպատակային ՀԾ-ներ կրող բջիջներ: Երկրորդ տիպի բջիջների ՀԾ-ները կապում են անա455

լիտի նկատմամբ անտարբեր ֆագային ՀՄ-ները, իսկ նպատակային ՀԾ կրող բջիջները միայն յուրահատուկ ՀՄ-ներով ֆագային մասնիկները: Այսպիսի մրցակցային ընտրությունը թույլ է տալիս արագ ընտրել միայն այն ֆագային ՀՄ-ները, որոնց աֆինությունը թիրախ ՀԾ-ի նկատմամբ շատ բարձր է: Նպատակային կապված բջիջները առանձնացվում են ընդհանուր խմբից ֆլուորեսցենտ նշադիրների օգնությամբ: Նպատակային բջիջները նախօրոք մշակում են նշադրի հետ կապված և տվյալ բջիջների մակերեսային հայտնի ՀԾ-ների նկատմամբ յուրահատուկ ՀՄ-ներով: Փորձի վերջում նշադրված բջիջները առանձնացվում են հոսքային ցիտոմետրիայի (FACS) եղանակով: Ընտրության այս եղանակը կիրառվել է ուռուցքային բջիջներին բնորոշ, հիվանդությունը նշադրող ՀԾ-ների նկատմամբ յուրահատուկ ՀՄ-ների scFv հատվածների բացահայտման և առանձնացման համար: Օրինակ՝ այս եղանակով ստեղծվել են ֆագային գրադարաններ՝ աճի վաղ փուլում միելոմաները բացահայտելու համար (J. Kupsch, et al., 1999): 4. Բիոպեննինգ in vivo: Ֆագային ՀՄ-ները ներմուծվում են կենդանիների օրգանիզմ, ապա անջատված հյուսվածքների և օրգանների բջիջների վրա բացահայտվում են կապված ֆագերը: Այս մեթոդի շնորհիվ հնարավորություն է ստեղծվում անմիջապես բացահայտել մի շարք տարբեր յուրահատկություններ ունեցող ֆագային ՀՄ-ներ և հայտնաբերել բջիջների թաղանթի վրա առկա դեռ անհայտ ռեցեպտորներ (J. Ayriss, et al., 2009): 4.4.7.3. Թելիկային ֆագերի դիսպլեյ մեթոդի խնդիրները և նվաճումները Ֆագային ՀՄ-ների մեթոդի հիմնախնդիրների մեծ մասը պայմանավորված է յուրահատուկ В-լիմֆոցիտների պոպուլյացիաների ցածր բազմազանությամբ և անբավարար խտությամբ: Բավարար քանակությամբ բազմազան ՀՄ-ների ակտիվ կենտրոններ հայտնաբերելու համար կիրառվում է նպատակային որոնման մեթոդը՝

ընտրություն մագնիսային միկրոզոնդերով նշադրված յուրահատուկ ՀԾ-ների միջոցով: Երկրորդ խմբի խնդիրները պայմանավորված են պատրաստված ֆագմիդային վեկտորների և իրականում ձևավորվող ռեկոմբինատ պեպտիդներ կրող ֆագերի բազմազանության տարբերությամբ: Առաջինը՝ ոչ բոլոր նախապես պատրաստված ֆագմիդներն են կապվում ֆագերի գենոմի հետ: Ավելին, երբեմն ֆագմիդային պեպտիդը դառնում է ֆագի կործանման պատճառ: Բացի դրանից՝ ֆագմիդների որոշ մասը կարող է ստանալ ոչ յուրահատուկ, ՀԾ-ի հետ չփոխազդող պեպտիդների գեներ: Այնուամենայնիվ, ֆագային ՀՄ-ների տեխնոլոգիայի կիրառման ոլորտները բազմազան են, և այն հաջողությամբ զարգանում է: Ֆագային գրադարանների օգտագործման շնորհիվ կարելի է հրաժարվել քիմերային կամ հումանիզացված ՀՄ-ների օգտագործումից թերապիայի համար և դրանով իսկ խուսափել դրանց իմունոգենության հետ կապված խնդիրներից: Մարդու հակածին կապող ֆրագմենտների գրադարանները թույլ են տալիս արագ բացահայտել ՀԾները կապող տարբերակները՝ չօգտագործելով երկարատև աշխատանքներ պահանջող բջջային հիբրիդոմների տեխնոլոգիան: Այդպիսի գրադարանների մյուս առավելությունն այն է, որ դրանք կարող են մշտապես օգտագործվել տարբեր ՀԾ-ներին համապատասխանող ՀՄ-ների բացահայտման համար: Մեծ նշանակություն ունի նաև այն հանգամանքը, որ ֆագային գրադարանների օգտագործումը թույլ է տալիս բացահայտել ՀՄ-ները նույնիսկ այն դեպքում, երբ հիբրիդոմային տեխնոլոգիայի կիրառումը վտանգում է իմունիզացվող օբյեկտների կենսունակությունը: Ֆագային դիսպլեյի տեխնոլոգիայի արդյունավետությունը ապացուցվել է թերապևտիկ ՀՄ-ների ստեղծման և արտադրության բնագավառում, և այսօր արդեն ԱՄՆ-ում արտադրվում են թերապևտիկ կիրառման համար օգտագործվող 14 ՀՄ-ներ (H. Azzazy, W. Highsmith, 2002): Վերջին տարիներին մի շարք կազմակերպություններ լայն կիրառում են ֆագային դիսպլեյի մեթոդը դեղամիջոցների արտադրու457

թյան համար և ստեղծվել ու օգտագործվում են ՀՄ-ների ֆրագմենտների կոմբինատոր ֆագային գրադարաններ (Morphosys GmbH, Գերմանիա, http://www.morphosys.com, Cambridge Antibody Technology, Մեծ Բրիտանիա, http://www.catplc.co.uk, Dyax, ԱՄՆ, http://www.dyax.com): 4.4.7.4. Ֆագային ռեկոմբինանտ ՀՄ-ների օգտագործման եղանակները և բնագավառները Ֆագային տեխնոլոգիաների առավելություններից մեկն այն է, որ բազմամոլեկուլային կազմությունը ապահովում է ֆագային մասնիկի կայունությունը ֆիզիկական գործոնների՝ pH-ի, ջերմաստիճանի տատանումների և մեխանիկական ազդեցությունների նկատմամբ և պահպանում նուկլեազների և պրոտեազների քայքայիչ ազդեցություններից: Այսպիսով՝ ապահովվում է ֆագային ՀՄ-ների մեթոդի արդյունավետությունը և կայունությունը: Դրա շնորհիվ լավ ուսումնասիրված T7 և M13 ֆագերը հաճախ օգտագործվում են հակածին յուրահատուկ պատվաստների և մոնոկլոնալ ՀՄ-ների արտադրության համար: Մեթոդի առավելություններից մեկը նաև այն է, որ հետազոտվող ՀԾ-ի բացահայտման համար ֆագային ռեկոմբինանտ ՀՄ-ները ծառայում են որպես արդյունավետ միջնորդ՝ ինտերֆեյս անալիտի և դետեկցիայի համալիրի միջև: Նշենք, որ ֆագային մասնիկների փոքր չափսը և անհամեմատ մեծ մակերեսը ճանաչմանը նպաստող կարևոր գործոններ են: Դետեկցիայի համար կարող են կիրառվել ֆագի մակերեսին ամրացվող սովորական ֆերմենտային կամ որևէ այլ բնույթի, օրինակ, լյումինիսցենտ նշադիրներ (Kim et al., 2009) (նկ. 4.42): M13 ֆագի դեպքում, սովորաբար, կիրառվում է պերօքսիդազ ֆերմենտը, իսկ կովերի, ոլոռի խճանկարի վիրուսի CPMV մակերեսին ամրացվում է նշադրող Cy5 ներկանյութը (նկ. 4.42): Համապատասխանաբար դետեկցիան կարող է կատարվել կոլորիմետրիկ, ֆոտոկատալիզի կամ այլ նշադրին համապատասխանող եղանակով:

րati11աlu

ll1Plilալjոg. P2P2, հյոuա6

~

Թtiրաtuo l.յա~որt . Lաlltiuut11 Նկ. 4.42. Կոմբինատիվ ֆագի մասնիկի դետեկցիան կատարելու համար դրանք կարող են նշվել դետեկցիայի գործոններով՝ միկրոգնդերով, ավիդին կապված էնզիմով, ֆլուորոքրոմով, CNT՝ ածխաջրային նանոխողովակներով և այլն (Хван Инсон, 2014):

Ֆագմիդային տեխնոլոգիայի միջոցով նույն ֆագի կապսիդի կազմում առկա մի քանի սպիտակուցների մոդիֆիկացիայի շնորհիվ մեկ մասնիկը կարող է օգտագործվել տարբեր թիրախների բացահայտման համար: Ուստի մոդիֆիկացված ֆագերը լինում են կամ բազմավալենտ՝ կապսիդի կազմում ունեն մի քանի տարբեր մոդիֆիկացված սպիտակուց, կամ միավալենտ՝ ունեն մի տիպի մոդիֆիկացված սպիտակուց: Ֆագի բազմավալենտ տարբերակը ավելի հարմար է իմունավերլուծական աշխատանքների համար և ունի ավելի լայն կիրառություն: PHAIA մեթոդը հաջողությամբ զուգակցվում է մագնիսային միկրոգնդերի, ՊՇՌ-ի և մագնիսային իմունաքիմիական վերլուծության եղանակների հետ (Arevalo F.J., Gonzalez-Techera A., Зон Массачусетс, Gonzalez-Sapienza G., Фернандес, Х., 2012, Kim H.J., Ан KC., Gonzalez-Techera A., Gonzalez-Sapienza G.G., Джи S.J., Hammock B.D., 2009, Kim H.J., Маккой М., Джи S.J., Gonzalez-Sapienza G.G., Hammock B.D., 2011):

Ինչպես ներկայացված է նկար 4.43-ում, ֆագի մասնիկը պատված է պերօքսիդազ ֆերմենտով նշադրված հակածիններով, ինչի շնորհիվ հեշտությամբ բացահայտվում է լուծույթում: Անալիտը լուծույթում է, իսկ յուրահատուկ ՀՄ-ները կապված են մագնիսային միկրոգնդերին: Անալիտը կապվում է լուծույթի ՀՄ-ների հետ, իսկ ֆագի ծայրում գտնվող յուրահատուկ ՀՄ կենտրոնը փոխազդում է իմունային համալիրի կազմում գտնվող ՀՄ-ի հետ: Մագնիսային գնդերի հետ կապված ձևավորված մոլեկուլային համախումբը հեշտությամբ առանձնացվում է լուծույթից: Ապա պեպտիդային կապսիդը քայքայվում է, և անջատված ֆագի ԴՆԹ-ն ենթարկվում է ամպլիֆիկացիայի: ՊՇՌ մեթոդը գերզգայուն է և թույլ է տալիս բացահայտել ՆԹ-ի նվազագույն խտությունները: Ռեալ թայմ ՊՇՌ-ի եղանակով կատարվում է անալիտի բացահայտումը նմուշում և դրա քանակի որոշումը:

ն

~f

~~;~~} tեոաtjաt~~Ul

'

UՇiաt~Ul

~

հա~աt~ր

t:թ-կU1~~

UագՇi~նաi~Շi tl~~րոգոՇi~

Նկ. 4.43. Ա - Ֆագային մասնիկների կառուցվածքը, Բ - ՊՇՌ-ի միջոցով PHAIA դետեկցիայի սխեման (Хван Инсон, 2014):

Ֆագային իմունահամալիրային վերլուծություն՝ PHAIA: Դետեկցիայի այս մեթոդը շատ հարմար է in vivo ուռուցքների ախտորոշման համար: Փոփոխված բջիջների թաղանթային ռեցեպտորները ներկայացնում են փոփոխված սպիտակուցները, և դրանց բացահայտումը թույլ է տալիս ախտորոշել հիվանդությունը դեռ սկզբնական փուլում, նույնիսկ փոփոխված բջիջների ցածր խտությունների պայ460

մաններում: Ֆագային մասնիկները կարող են օգտագործվել որպես բուժիչ գործոններ, որոնք, կապվելով փոփոխված բջջի մակերեսին, դարձնում են այն ճանաչելի իմունային համակարգի գործոնների համար և առաջացնում կամ ՀԾ-պայմանավորված բջջային՝ ADCC, կամ կոմպլեմենտ-պայմանավորված ցիտոտոքսիկություն՝ CDC (Zhou, Y., Чжао, LQ, Marks, JD. 2012): 4.4.7.5. Թելիկային բակտերիոֆագերի դիսպլեյի մեթոդի առավելությունները և օգտագործման բնագավառները Ֆագային դիսպլեյի մեթոդին բնորոշ են մի շարք յուրահատուկ առավելություններ; Ֆագային դիսպլեյը ապահովում է ՀՄ-ների բոլոր անհրաժեշտ տարբերակների ստացումը առանց մարդու կամ կենդանիների բջիջների օգտագործման: Ուստի բացառվում է լաբորատոր կենդանիների օգտագործումը: Ֆագային գրադարանը ունիվերսալ է և կարող է օգտագործվել տարբեր անալիտների սկրինինգի համար: Բակտերիոֆագերի դիսպլեյի մեթոդը թույլ է տալիս կուտակել ՀՄ-ներ բազմաթիվ հարուցիչների և տոքսինների նկատմամբ, նույնիսկ մահացու վիրուսների, որոնք անհնար է ստանալ իմունիզացիայի եղանակով: Ֆագային դիսպլեյը արդեն հաջողությամբ օգտագործվում է մի շարք բնագավառներում. - ռեցեպտորների ուսումնասիրություններում և ՀՄ-ների քարտեզավորման աշխատանքներում, - նանոպատվաստների և իմունոգենների ստեղծման ոլորտում, - կինազների և պրոտեազների սուբստրատ կապող սայտերի քարտեզավորման համար, - սպիտակուցների և սպիտակուցային դոմենների ֆագային դիսպլեյի համար, - որոշակի հատկանիշներով ՀՄ-ների ընտրության համար, - սպիտակուց-լիգանդ փոխազդեցությունների հետազոտման համար,

-

ներմուծվող վեկտորային ԴՆԹ-ի հատվածների սկրինինգի համար, - սպիտակուցների կարգավորված էվոլյուցիայի նպատակով: Ֆագային ռեկոմբինանտ ՀՄ-ները օգտագործվում են հորմոնների, ՀԾ-ների և այլ բնույթի մեծ ու փոքր մոլեկուլների դետեկցիայի համար: 4.4.8. Քրոմատինի համաիմունոպրեցիպիտացիա (ChIP) Իմունավերլուծության մեթոդների զարգացմանը զուգահեռ հետազոտություններում ներգրավվող նյութերի քանակը և տեսակները ընդլայնվում են: Ուսումնասիրություններում առաջադրվող խնդիրները դառնում են ավելի և ավելի բազմազան, տարածվում նոր թիրախների վրա: Վերջին տարիներին հետազոտություններում հաճախ օգտագործվում է քրոմատինի համապրեցիպիտացիայի մեթոդը, որը հետազոտում է ԴՆԹ-ի այն հատվածները, որոնք կապվում են հիստոնների, սպիտակուցային բնույթի կարգավորիչ գործոնների և այլ ֆունկցիոնալ պեպտիդների հետ: Մեթոդը կիրառվում է նաև ԴՆԹ-ի առանձին հատվածների նուկլեոտիդային հերթականությունների որոշման և քարտեզավորման համար: Մեթոդի փոփոխված տարբերակները թույլ են տալիս հետազոտել նաև ՌՆԹ-ների հետ կապվող սպիտակուցները (RNA-ChIP) և գենոմի եռամեռ կառուցվածքի (HiC-տեխնոլոգիա) կազմակերպման մեխանիզմները: Բացի դրանից՝ ChIP տեխնոլոգիայի DNAse-seq և FAIR-seq մոդիֆիկացիաները թույլ են տալիս ճանաչել նուկլեոսոմներից ազատ քրոմատինի հատվածները: Այսինքն՝ ակտիվ ընթերցվող հատվածները՝ պրոմոտորները, էնհանսերները, սայլենսերները և ինսուլյատորները: ChIP տեխնոլոգիայի եղանակով կատարվող հետազոտությունը կազմված է մի շարք հաջորդական փուլերից: 1. Սկզբում բջջի թաղանթը և կորիզաթաղանթը քայքայվում են, և ստացված խառնուրդին ավելացվում են հետազոտվող սպիտակուցների նկատմամբ զգայուն ՀՄ-ներ:

2. Ապա ԴՆԹ-ի մոլեկուլները ուլտրաձայնով բաժանվում են հատվածների: 3. Առաջացած բջջային լիզատը մշակվում է մագնիսային միկրոգնդերի հետ կապված յուրահատուկ ՀՄ-ներով, որոնք փոխազդում են ԴՆԹ-ի հետ կապված սպիտակուցների հետ: 4. Առաջացած իմունային համալիրները անջատվում են լիզատից, ապա հաջորդ քայլով ԴՆԹ-ն անջատվում է սպիտակուցներից և մաքրվում: Անջատված ԴՆԹ-ի հատվածները սեկվենացվում են, և հիբրիդացման եղանակով որոշվում է դրանց տեղը գենոմում (նկ. 4.44): Պետք է նշել, որ ԴՆԹ-ի նուկլեոտիդային կազմը կարող է որոշվել նաև միկրոչիպերի օգտագործման կամ յուրահատուկ պրայմերներով կատարվող ՊՇՌ-ի միջոցով: ChIP տեխնոլոգիաների կիրառության շնորհիվ ստացվել են կարևոր շոշափելի արդյունքներ. 1. Հետազոտությունների արդյունքներով կորիզում բացահայտվել են տրանսկրիպցիոն գործարաններ, որտեղ կուտակվում են ֆերմենտային համալիրները, և իրականացվում է քրոմատինի ակտիվ տրանսկրիպցիան: 2. Պարզվել է, որ ամեն մի տրանսկրիպցիոն գործարան մակերեսի վրա պարունակում է ՌՆԹ-պոլիմերազ ֆերմենտներից մեկը, բացի դրանից` համալիրի կազմում գտնվում են տրանսկրիպցիայի ինիցիացիան և պրոցեսինգը առաջացնող սպիտակուցներ և հկՌՆԹ-ի սպլայսինգի պրոցեսին մասնակցող այլ գործոններ: 3. Ապացուցվել է, որ տրանսկրիպցիայի ազդակը ստանալուց հետո քրոմոսոմների համապատասխան հատվածները տեղափոխվում են տրանսկրիպցիոն գործարանների մոտ, ընդ որում՝ տեղափոխումը կատարվում է կորիզային կմախքի ակտինային թելիկների կրճատման միջոցով, դրանց դիրքի ուղղությամբ: Ակտինային թելիկների կրճատումները ակտիվացվում են միոզինով և կինեզինով (Z.W. Zhao, R. Roy, J.C. Gebhardt, D.M. Suter, A.R. Chapman, X.S. Xie, 2014): 4. Բացահայտվել է, որ քրոմոսոմների տարբեր հեռու հանգույցների գեները, նույն ժամանակում գտնվելով տրանսկրիպցիոն

գործարանի կազմում, զուգահեռ ընթերցվում են և ենթարկվում սպլայսինգի:

I '11.;0-~ t. uuitoՀոակոgll

..-oր,ացո,o

I '11.;0-fl i,անակոtն ... lllllllf\անաfոtl

li)րlր,արU UUlրllրlակոցր, Iյ.llt,gllui~աgt,ա

uոկրոզոuոt,րո~ - - - - ~------~ հl>lll կաuil(ա ՀU-~t,f\ր,lյ

Նկ. 4.44. ChIP հետազոտության կատարման սխեման (https://File:Chromatin_immunoprecipitation_sequencing):

Այժմ կատարվող հետազոտությունների խնդիրն է ուսումնասիրել քրոմատինային սպիտակուցների և կորիզի այլ ԴՆԹ-ի հետ փոխազդող սպիտակուցների դերը բջիջների ակտիվացման, բազմացման և տարատեսակման պրոցեսներում, հետազոտել չկոդավորող ԴՆԹ-ի հատվածների նշանակությունը օնտոգենեզի և պաթոգենեզի պրոցեսներում, բացահայտել բջջային ծերացման պրոցեսների ընթացքը:

ԳԼՈՒԽ 5. ՀԻԲՐԻԴԱՑՈՒՄ in situ (FISH)

Գիտության զարգացմանը և նոր խնդիրների առաջացմանը զուգահեռ զարգանում են նաև հետազոտման մեթոդներն ու տեխնոլոգիաները, ստեղծվում են ՆԹ-ների և սպիտակուցների հետազոտման նոր եղանակներ, որոնք և ապահովում են այս զուգահեռ ընթացող պրոցեսի միասնական շարժը: Վերջին տարիներին ձևավորվել են գենետիկական և բջջագենետիկական հետազոտությունների նոր տեխնոլոգիաներ, որոնցից մեկն է ՆԹ-ների ֆլուորեսցենտ հիբրիդացումը in situ, այսինքն՝ ՆԹ-ների հիբրիդացումը անմիջապես բջջի կորիզում՝ գտնվելու բնական վայրում: Դետեկցիան կատարվում է հիբրիդացման համար օգտագործվող և ֆրուորեսցենտ նյութերով նշադրված զոնդերի միջոցով: Նախկինում ՆԹ-ների հետազոտությունները սահմանափակվում էին անջատված քրոմոսոմների և դրանց տարբեր հատվածների ընտրողական գունավորումով: Նոր մեթոդները թույլ են տալիս հետազոտել ԴՆԹ-ի որոշակի հերթականությունները բջջային պատրաստուկների վրա, որի շնորհիվ ուսումնասիրման հնարավորությունները ընդլայնվում են և ստանում զարգացման նոր ուղղություններ: Այս մեթոդների կիրառման շնորհիվ ստեղծվեց հնարավորություն հետազոտել տարբեր տեսակների գենոմը, բացահայտել քրոմոսոմների վերակառուցումները, գնահատել դրանք էվոլյուցիոն և բժշկագիտական տեսանկյուններից, բացահայտել դրանց կապը բջիջների մալիգնացման պրոցեսների և ժառանգական պաթոլոգիաների հետ: Նոր մեթոդի կիրառության շնորհիվ զարգացավ գենետիկայի նոր բնագավառ՝ կորիզային արխիտեկտոնիկան կամ ինտերֆազային բջջագենետիկան, որն ուսումնասիրում է քրոմոսոմների դասավորությունը և ֆունկցիոնալ ակտիվությունը ինտերֆազային կորիզում: Որպես հետազոտական զոնդերի նշադիր՝ սկզբնական փուլում օգտագործվում էին ռադիոակտիվ իզոտոպները՝ 32Р (Дж.Г. Галл, М.Л. Пардью, 1969,): Բայց ռադիոակտիվ նշադիրների օգտագործումը կապված է բազմաթիվ դժվարությունների հետ՝ անվտանգության

խնդիրների լուծման անհրաժեշտությունից մինչև օգտագործված նյութերի չեզոքացումը: Բարդ լաբորատոր սարքավորումների օգտագործումը նույնպես խոչընդոտում է հետազոտությունների լայն օգտագործման գործընթացը: Մեթոդի բարելավման հաջորդ փուլում ռադիոակտիվ նշադրումը փոխարինվեց ֆլուորեսցենտ ներկանյութերով նշադրմամբ, որը ոչ միայն անվտանգ է և առավել արդյունավետ, այլև ավելի հարմար, տնտեսվարական և արագ կատարվող: Զոնդերի նշադրման եղանակի բարելավման շնորհիվ մշակվեց ԴՆԹ-ի կազմում չկրկնվող յուրօրինակ հերթականությունների բացահայտման մեթոդը (Takahashi et al., 1990): Այժմ քրոմոսոմների հետազոտությունները կատարվում են գրեթե միայն FISH մեթոդի կիրառմամբ և լայնորեն օգտագործվում են գենետիկական և բժշկագիտական հետազոտություններում և պրակտիկայում տարբեր բնույթի հիվանդությունների ախտորոշման համար: Բացի դրանից՝ FISH մեթոդը կիրառվում է հյուսվածքներում մՌՆԹների բացահայտման համար և կորիզային ակտիվության պրոցեսների կարգավորման մեխանիզմների հետազոտման աշխատանքներում: ՄՌՆԹ-ների հետազոտությունը թույլ է տալիս գնահատել հետազոտվող գեների էքսպրեսիայի ժամանակատարածական ակտիվության առանձնահատկությունները բջիջներում և հյուսվածքներում, բացահայտել դրանց փոփոխությունները օնտոգենետիկական զարգացման փուլերում: Զոնդերը կիրառվում են նաև բջիջներում օտար, օրինակ՝ բակտերիաների կամ վիրուսների ՆԹ-ների բացահայտման համար: Հետազոտման այս եղանակը հիմնվում է հիբրիդացման միջոցով քրոմոսոմային ԴՆԹ-ների յուրահատուկ հերթականությունների նշադրման մեթոդի վրա: Ընդ որում՝ հետազոտվում են քրոմոսոմային, բջջային կամ հյուսվածքային պատրաստուկները, այսինքն՝ նմուշները ուսումնասիրվում են իրենց կայացման բնական տեղում՝ in situ: 90ական թվականներին, ֆլուորեսցենտ ներկանյութերի օգտագործման շնորհիվ, զգալիորեն ընդլայնվեց մեթոդի կիրառման հնարավորությունը և բնագավառների ցանկը: Մեթոդը դարձավ անվտանգ, հեշտ

իրագործելի, ստացված արդյունքների վերլուծությունը, նշադրված նմուշների անմիջական բացահայտման շնորհիվ, ավելի պարզ և ճշգրիտ: Ձևավորված մեթոդը կոչվեց հիբրիդացում տեղում ֆլուորեսցենտ նշադիրների օգտագործմամբ՝ FISH (Fluorescent in Situ Hybridization) (նկ. 5.1): Երեք ֆլուորեսցենտ նյութերով նշադրված զոնդերի օգտագործումը հնարավորություն է ստեղծում բացահայտել ամբողջ գենոմային ԴՆԹ-ն և դրա կազմում գտնվող և յուրահատուկ հերթականություններ պարունակող առանձին քրոմոսոմները:

Նկ. 5.1. Մարդու կարիոտիպում 2-րդ և 5-րդ քրոմոսոմների բացահայտումը FISH մեթոդի միջոցով: Կապույտ գույնով ներկված է ամբողջ քրոմատինը, բոլոր քրոմոսոմները, կանաչ՝ ա և կարմիր՝ բ գույներով ներկվում են 2-րդ և 5րդ քրոմոսոմի հատուկ հերթականությունները: 1 - Interphase-FISH, 2 - Metaphase FISH (https://genschool.ru/wadata/public/site/1.8_Cytogenetics_FISH_KibanovMV.pdf):

FISH մեթոդի նոր տարատեսակների ձևավորման գործում մեծ է մանրադիտակային պատկերների գրանցման նոր մեթոդների նշանակությունը: Նախկինում օգտագործվող ֆոտոսարքերը փոխարինվել են CCD-խցիկներով, որոնք ունեն սառեցման, ազդակի երկարատև հասունացման և թույլ ազդակների ըմբռնման հնարավորություն: Դրանք պարունակում են համակարգչային մաս, որը ոչ միայն պարզեցնում և արագացնում է ստացված մանրադիտակային ազդակների գրանցումը, այլև հնարավորություն է տալիս կատարել թվային եղանակով

գրանցված արդյունքների բազմակողմանի վերլուծություն: Նոր սարքերի կիրառմամբ գրանցվում են նույնիսկ մարդու տեսողության սահմաններից դուրս գտնվող թույլ լուսային ազդակները:

5.1. FISH ՄԵԹՈԴԻ ԲՆՈՒԹԱԳԻՐԸ

FISH մեթոդը հիմնվում է երեք սկզբունքների վրա. - հետազոտությունը կատարվում է հիբրիդացման մեթոդով, - նմուշը նախապես ֆիքսվում է (in situ), - դետեկցիայի համար օգտագործվում են ֆլուորեսցենտ ներկանյութեր: Այս մասնագիտացված մեթոդը հիմնվում է քրոմոսոմային ԴՆԹի կազմում յուրահատուկ նուկլեոտիդային հերթականությունների հայտնաբերման սկզբունքի վրա: Փորձի ընթացքում օգտագործվում են հետազոտվող ԴՆԹ-ի յուրահատուկ հերթականություններին կոմպլեմենտար, ֆլուորեսցենտ նյութերով նշադրված միաշղթա ԴՆԹ-զոնդեր: Առաջացող կոմպլեմենտար կապը նշում է ԴՆԹ-ի հատվածը և բացահայտվում է համակարգչային խցիկ պարունակող ֆլուորեսցենտ մանրադիտակով: 5.1.1. Ֆլուորոֆոր նյութերը և դրանց օգտագործման եղանակները Ֆլուորեսցենտ նյութերը՝ ֆլուորոֆորները, բազմազան են և ունեն տարբեր գունային արձագանքներ: Հետազոտությունների համար ընտրվող նյութերի լուսային արձագանքի սպեկտրները պետք է լինեն տարբեր և հստակ տարբերակվեն դետեկցիայի ժամանակ: Ուստի ֆլուորոֆորների ընտրության հիմնական սկզբունքներից մեկը լուսային արձագանքների հստակ տարբերակումն է: Երկրորդ կարևոր հատկանիշը ֆլուորոֆորների հակվածությունն է կապվել հետազոտվող նյութի որոշակի հատվածների հետ: ԴՆԹ-ի նշադրման համար նշանակություն ունի ֆլուորոֆորի հակվածությունը ԴՆԹ-ի Ա-Թ կամ Գ-Ց հարուստ հատվածների նկատմամբ, ունակությունը կապվել մոլեկուլի մեծ կամ փոքր ակոսիկների հետ և այլն: Այս հատկանիշների հիման վրա, օգտագործելով համակարգչային տեխնոլո468

գիաները, հնարավոր է ամեն մի քրոմոսոմ նշել որոշակի կեղծ գույնով և տալ գենոմի հստակ գունավորված պատկեր: FISH հետազոտման համար օգտագործվող ֆլուորոֆորների թվին են պատկանում DAPI, FITC, Cy3, Cy5, Alexa, Texas Red: Մանրադիտակով տարբեր ֆլուորոֆորների ֆլուորեսցենցիայի գրանցման համար օգտագործվում են հատուկ նեղ շերտագիծ ինտերֆերենցիոն ֆիլտրեր (աղ. 5.1): Աղյուսակ 5.1 Ֆլուորոֆորների ազդակային բնութագիրը l ոuայt,Շ UtրuiՇերt> աոաlj. Շtl. lt>1"'րերll

!ե1ոորր>12րոtlՇերll

UյLQՇl!lրաՇl)այt,Շ "'արրերակՇերll

կ05

կ10-կ80

ԾAPI

Ale5a 350

կ55

կ95-5կ0

ՒITՇ

!\le5a կ55

566-556

Cy5

TAMRA, .'lle5a 555

59կ

600-625

Te5a5 Reմ

Cy5

655-800

Cy5

.'lle5a 633

Ֆլուորեսցենտ ներկանյութերը տարբեր են, տարբեր է նաև դրանց արձագանքի ինտենսիվությունը, ուժը և սպեկտրը: Դրանց ազդակի գրգռման և արձակման ալիքների երկարությունը տարբեր է, ուստի գրանցման հստակության բարձրացման համար օգտագործում են հատուկ ֆիլտրեր: Մի քանի ներկանյութի ազդակների կարգավորված գրանցման համար կազմվում են ֆիլտրերի համալիրներ:

5.1.2. FISH հետազոտություններում օգտագործվող զոնդերը Հետազոտությունների համար օգտագործվող զոնդերը կարող են լինել տարբեր չափսերի՝ մի քանի տասնյակ նուկլեոտիդից մինչև ամբողջական քրոմոսոմ: Մեծ՝ 300-ից մինչև 500 նուկլեոտիդից կազմված զոնդերը դժվար են հասնում հիբրիդացման կետին, առաջացնում են մեծ համալիրներ, և ֆլուորեսցենտ արձագանքը ստացվում է ցրված, ոչ հստակ: Կարճ՝ 20-100 նուկլեոտիդներից կազմված զոնդերից ստացված ազդակը ավելի հստակ է: Որպես զոնդ կարող են օգտագործվել արդեն պատրաստի ստանդարտ նշադրված կամ վեկտորների հետ միացած, հետազոտվող հատվածներին կոմպլեմենտար հերթականություններ: Զոնդերը ֆլուորեսցենտ ներկանյութի հետ կապվում են միջանկյալ նյութի միջոցով, քանի որ ԴՆԹ-ի հետ անմիջականորեն կապված նշադրի արձագանքը թուլանում է: Որպես միջանկյալ նյութ հաճախ օգտագործում են հակամարմինները: Հետազոտության նպատակի և նմուշի բնույթի յուրահատկությունների համաձայն զոնդերը լինում են՝ - Քրոմոսոմների համարը կամ ցենտրոմերը նշադրող զոնդեր՝ CEP (Chromosome Enumerator Probe), - Թելոմերային զոնդեր՝ SubTel (Subtelomere specific), - Ամբողջական քրոմոսոմներ նշադրող զոնդեր՝ WCP (WholeChromosome-Painting), - Քրոմոսոմային վերակառուցումներ բացահայտող զոնդեր՝ mBand (High Resolution Multicolor Banding), - Լոկուս յուրահատուկ զոնդեր՝ LSI (Locus Specific Identificator): Ցենտրոմերային և թելոմերային զոնդերը օգտագործվում են գենոմային շեղումների բացահայտման համար (մոնոսոմիաների և տրիսոմիաների): Այլ տեսակների զոնդերը օգտագործվում են քրոմոսոմային վերակառուցումների, ատիպիկ բջիջների, բջջային խճանկարների և քաղցկեղների բացահայտման համար:

5.1.3. Զոնդերի ստացում միկրոդիսսեկցիայի մեթոդով Հետազոտություններում հաճախ օգտագործվում են, այսպես կոչված, «միկրոդիսսեկցիոն զոնդեր»: Միկրոդիսսեկցիոն զոնդերը օգտագործվում են ամբողջական քրոմոսոմների, դրանց ուսերի կամ տարբեր չափսերի հատվածների նշադրման համար: Միկրոդիսսեկցիան ԴՆԹ-ի անջատման և հետազոտման շատ արդյունավետ և ճկուն մեթոդ է, որը լայնորեն կիրառվում է գենոմային գրադարանների և քրոմոսոմների կամ դրանց բոլոր հատվածների նշադիրների ստեղծման համար: Միկրոդիսսեկցիայի մեթոդը կիրառվել է մարդու, կենդանիների և կյանքի այլ ձևերի քրոմոսոմների ու գենոմների հետազոտման և ժառանգական հիվանդությունների նշադիրների հայտնաբերման աշխատանքներում (D. Rohme, et al., 1984, G. Bates, et al., 1986, (Langer-Giedion syndrome) Ludecke, et al., 1991 և այլն), ինչպես նաև մի շարք քաղցկեղային հիվանդությունների հետ ասոցացված քրոմոսոմային հատվածների հետազոտման հարցում (neurofibromatosis-2, լեյկեմիա, Senger, et al., 1990, Fiedler, et al., 1991): Միկրոդիսսեկցիայի պրոցեսում (Scalenghe, et al., 1981) մետաֆազ փուլում գտնվող քրոմոսոմների պատրաստուկից մանրադիտակի տեսադաշտում անջատվում են կամ ամբողջական քրոմոսոմները, կամ դրանց որոշակի հատվածները (ապակե ասեղի, միկրոմանիպուլյատորի օգնությամբ կամ լազերային ճառագայթով վառելով չհետազոտվող հատվածները) և կլոնավորվում վեկտորների կազմ ներմուծելու և տերբջիջներում բազմացնելու միջոցով: Այս մեթոդով ստացվում են քրոմոսոմ-, բենդ- և լոկուսյուրահատուկ ԴՆԹ զոնդերի գրադարաններ: Մեթոդը կիրառելի է տարբեր օբյեկտների նկատմամբ և չի պահանջում նմուշի մեծ խտություն: Scalenghe աշխատակիցների հետ փորձը կատարել են պտղաճանճի հսկայական քրմոսոմների վրա և միկրոմանիպուլյատորով անջատված հատվածները սկզբում ազատել սպիտակուցային տարրերից, ապա EcoRI ռեստրիկտազով մշակելուց հետո ստացված փոքր չափսի ֆրագմենտները ներմուծել լյամբդա 641 ֆագի կազմ և կլոնավորել: Ստացված կլոնները հիբրրիդացվել են

հսկայական քրոմոսոմի հետ: Կլոնավորված հատվածների լոկալիզացիան համընկել է անջատված հատվածի լոկալիզացիայի հետ: Այսպիսով՝ ապացուցվել է ստացված կլոնների համապատասխանությունը ԴՆԹ-ի նպատակային հատվածին և միկրոդիսսեկցիայի մեթոդի արդյունավետությունը գենոմային կլոնների գրադարանների ստեղծման համար: Կատարվող աշխատանքների հաջողության պայմաններն են հետազոտվող քրոմոսոմի կամ դրա որևէ հատված ճշգրիտ որոշումը, ԴՆԹ-ի անթերի անջատումը և հետազոտության կատարման ճշգրտությունն ու զգուշությունը: Միկրոդիսսեկցիայի մեթոդի կիրառմամբ մետաֆազային քրոմոսոմների բազմագույն ներկման առաջին փորձը կատարվել է 1989 թ.: Նույն հետազոտությունների պրոցեսում Davies L. և աշխատակիցները առաջարկել են աշխատանքի ճշգրտության մակարդակի բարձրացման նպատակով օգտագործել մանրադիտակային տեսադաշտի մեծացմանը նպաստող ինվերտավորող մանրադիտակը: Միկրոդիսսեկցիայի լայնածավալ իրականացման օրինակ է Davies L. և աշխատակիցների կողմից կատարված մարդու 11-րդ քրոմոսոմի р13 հատվածի հետազոտությունը: Գիտնականները կազմել են 11-րդ քրոմոսոմի այդ հատվածի հերթականություններից 20 000 կլոններից կազմված գենոմային գրադարան: Հեղինակների տվյալներով՝ յուրաքանչյուր կլոն համապատասխանում է 37 000 զ.ն-ին, և բոլոր կլոնների գումարային երկարությունը հավասար է ԴՆԹ-ի 13 Մբ հատվածին: Միկրոդիսսեկցիայի եղանակով ստեղծվում են ամբողջական քրոմոսոմների, դրանց ուսերի կամ որոշակի հատվածների զոնդերից կազմված գենոմային գրադարաններ: Գենոմային ԴՆԹ-ի առանձին հատվածների կլոնների գրադարանները օգտագործվում են կոնտինգների հավաքման և գենոմի հետազոտվող հատվածի ֆիզիկական քարտեզ կազմելու համար: Աշխատանքը բավականին բարդ է, երկարատև, բայց հաջող կատարման դեպքում թույլ է տալիս շատ արագ կատարել բոլոր տեսակի գենետիկական նմուշների քարտեզավորում:

Տարիների ընթացքում միկրոդիսսեկցիայի եղանակի բարելավման և արդյունավետության բարձրացման նպատակով մշակվել են մի շարք մեթոդական փոփոխություններ: Օրինակ՝ ՊՇՌ-ի օգտագործումը ԴՆԹ-ի հատվածների ամպլիֆիկացիայի համար թույլ տվեց, օգտագործելով ընդամենը մի քանի անջատված նմուշ, ստանալ դրանց բազմաթիվ պատճեններ: Բացի դրանից՝ ամպլիֆիկացված հատվածները նշադրվում են արդեն ՊՇՌ-ի ուշ ցիկլերի պրոցեսում՝ ֆլուորեսցենտ ներկանյութով նշված եռաֆոսֆոնուկլեոզիդների միացման եղանակով: Նշանակալի դեր է կատարում ԴՆԹ պոլիմերազ ֆերմենտի ճշգրիտ ընտրությունը: Այսպես՝ հետազոտությունների արդյունքում բացահայտվել է, որ Sequenase Ver. 2.0 օգտագործման դեպքում ՊՇՌ-ն ավելի արդյունավետ է և ապահովում է ամպլիֆիկացիայի բարձր մակարդակ նույնիսկ նախնական 10-15 նմուշի դեպքում: 2016 թ. Սանկտ Պետերբուրգի համալսարանի և Գերմանական Շիլլերի անվան համալսարանի մի խումբ գիտնականներ միասին մշակեցին նոր մեթոդներ, որոնք թույլ տվեցին օգտագործել միկրոդիսսեկցիայի եղանակը հսկայական քրոմոսոմների փոքրագույն հատվածների հետազոտման համար: Այս մեթոդի կիրառությամբ հաջողվում է անջատել 1,5-ից 4 մլն զ.ն. պարունակող հատվածներ և, օգտագործելով միայն մեկ նմուշ, նպատակային ՊՇՌ-ի օգնությամբ ստեղծել այս հատվածի գենոմային գրադարանը: Մեթոդի շնորհիվ հնարավորություն է ստեղծվում հետազոտել ոչ միայն գենոմի կազմը, այլ դրա առանձին հատվածների ֆունկցիոնալ նշանակությունը, դրանց գենային կազմը և կարգավորիչ տարրերի ակտիվության մեխանիզմները: Փորձի կատարման սխեման ներկայացվում է նկար 5.2-ում (Zlotina, et al., 2016): Այսպիսով՝ միկրոդիսսեկցիայի մեթոդի կիրառումը թույլ է տալիս հետազոտել գենոմի նուկլեոտիդային հերթականությունները՝ կիրառելով ստացված հատվածների սեկվենացման եղանակը, ճշգրիտ քարտեզավորել գեների դասավորությունը գենոմում, բացահայտել չկոդավորող կարգավորիչ հատվածները և դրանց ակտիվության մեխանիզմ473

ներն ու ժառանգական կամ քաղցկեղային հիվանդություններ նշադրող քրոմոսոմային վերակառուցումները:

/

UIյ.lակt աUեlր\

0,0

'2rmսոսոս

'11.յԹ-ti կu,րu,ո~

ոtaյt;րu,ազոյ

1! ',J

Նկ. 5.2. Միկրոդիսսեկցիայի եղանակով լամպային խոզանակների տիպի քրոմոսոմների առանձին հանգույցների հետազոտման սխեման (Zlotina, et al., 2016):

Վերջին տարիներին զոնդերի ստացման համար կիրառվում է գենոմային ԴՆԹ-ի մասնատման ռեստրիկտազային եղանակը: Ռեստրիկտազները կտրում են ԴՆԹ-ի շղթան հատուկ պոլինդրոմների սայտերում անհավասար հատվածների, որոնք էլեկտրաֆորեզի միջոցով բաժանվում են առանձին թորամասերի և նորից կտրտվում հարմար չափսերի՝ զոնդերի ձևավորման համար: Այս եղանակով ստացված զոնդերը նշադրվում են ֆլուորեսցենտ ներկանյութերով և քարտեզավորումից հետո օգտագործվում որոշակի սայտերի կամ ամբողջական քրոմոսոմների նշադրման համար: Նշադրման համար կիրառվում է կամ ուղղակի եղանակը, երբ ֆլուորեսցենտ ներկանյութը կապվում է անմիջապես շղթայի նուկլեոտիդներին, կամ անուղղակի եղանակը, երբ նուկլեոտիդները կապվում են ՀՄ-ների կամ բիոտինի հետ: Բջիջների կենսաքիմիական ակտիվության և գեների ակտիվացման և արգելակման մեխանիզմների հետազոտություններում կիրառվում են նաև միաշղթա ՌՆԹ զոնդերը:

Մեթոդի թերություններից են տեխնիկական բարդությունը և ստացված զոնդերով քրոմոսոմային քարտեզների կառուցման անհրաժեշտությունը: 5.1.4. FISH հետազոտության նախապատրաստման աշխատանքները FISH հետազոտությունների համար որպես ուսումնասիրվող նյութ օգտագործվում են արյան լիմֆոցիտները, ֆիբրոբլաստները, էպիթելիումի բջիջները, խորիոնի կամ ընկերքի մազախավի բջիջները: Պատրաստուկները ձևավորում են նախապես՝ 3 օր առաջ, սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում: Հիբրիդացումը կատարվում է առարկայական ապակու որոշակի հատվածի վրա: Անհրաժեշտ է, որ նմուշը պարունակի անվնաս, բաժանման փուլում գտնվող բավարար քանակով, մեկը մյուսից անջատված և մետաֆազային սկավառակների փուլում գտնվող բջիջներ: Լավ պատրաստուկի բջջիների ցիտոպլազմը քայքայվում է, մնում են միայն առանձին մետաֆազային կորիզներ: Պատրաստուկը գնահատվում է լուսային մանրադիտակով՝ x200 մեծացման պայմաններում: Բջջային սուսպենզիան մշակվում է թթվային, սպիտակուց քայքայող ֆերմենտներով, օրինակ՝ պեպսին կամ պրոտեազ պարունակող լուծույթով, ապա խառնուրդը բջջային սպիտակուցների քայքայման նպատակով ենթարկվում է ինկուբացիայի՝ 5 րոպե, լվացվում և մշակվում ֆորմամիդով: Ֆորմամիդով մշակումը անհրաժեշտ է ԴՆԹ-ի բնափոխման համար: Ինկուբացիայից հետո պատրաստուկը նորից լվացվում է: Վերջում կատարվում է պատրաստուկի ֆիքսում՝ մշակում սպիրտային լուծույթով:

5.1.5. FISH մեթոդի կատարման փուլերը 1. Փորձի կատարման համար նախապատրաստվում է քրոմոսոմի հետազոտվող հատվածի ԴՆԹ-ի նուկլեոտիդային հերթականությանը կոմպլեմենտար, ֆլուորեսցենտ ներկանյութով նշադրված զոնդ: 2. Հետազոտությունը կարող է կատարվել հյուսվածքային, բջջային և քրոմոսոմային պատրաստուկների վրա: Նմուշի մետաֆազային ԴՆԹ-ն մշակվում է ռիբոնուկլեազ տիպի ֆերմենտներով, որոնք քայքայում են մՌՆԹ-ները և բացառում զոնդի միացումը դրանց հետ: Այս փուլը անհրաժեշտ է գեների յուրահատուկ հերթականությունների բացահայտման դեպքում: Ոչ յուրահատուկ հերթականությունները չեն պահպանվում մՌՆԹ-ի կազմում, և ուրեմն մՌՆԹ-ները չեն խանգարում դրանց բացահայտմանը: 3. Հաջորդ փուլում ջերմային կամ հիմնային մշակման միջոցով կատարվում է պատրաստուկում առկա ԴՆԹ-ի և, անհրաժեշտության դեպքում, զոնդի բնափոխում՝ շղթաների բաժանում: Հիմնային մշակումը ֆորմամիդով քայքայում է պատրաստուկում գտնվող սպիտակուցները և նպաստում բնափոխմանը ցածր ջերմաստիճանի պայմաններում. 50 % լուծույթի օգտագործման դեպքում դենատուրացիան կատարվում է 30-45 ºC պայմաններում: Իսկ միայն ջերմային մշակման դեպքում անհրաժեշտ է բարձր ջերմաստիճան՝ 85-90 ºC, և ֆլուորեսցենտ ազդակը պետք է լինի ուժեղ: Նշենք, որ ֆորմամիդի կիրառումը անհրաժեշտ է նույնիկ միաշղթա նմուշների հետազոտման ժամանակ, քանի որ դրանք էլ հակված են առաջացնել համալիրներ և կապվել սպիտակուցների հետ: 4. Նմուշին ավելացվում են զոնդի բազմաթիվ պատճեններ, և առաջացած խառնուրդը 37 ºC պայմաններում պահվում է մի քանի ժամ: Այս ընթացքում նմուշի և զոնդի կոմպլեմենտար շղթաների նուկլեոտիդների միջև առաջանում են ջրածնային կապեր: Այժմ բնափոխումը և հիբրիդացումը կատարվում է հատուկ՝ հիբրիդայզեր կոչվող սարքերում: 5. Չկապված զոնդերի հեռացման համար պատրաստուկը լվացվում է նատրիում քլորիդ և ցիտրատ պարունակող լուծույթով (SSC):

6. Ֆլուորեսցենտ ազդակի կայունացման համար պատրաստուկը կարող է մշակվել անտիֆեյդի լուծույթով: Այս փուլը կոչվում է հականերկում, և օգտագործվում է, սովորաբար, DAPI (4,6-դիամիդին-2ֆենիլինդոլ կամ պրոպիդիում յոդիտ) ներկանյութը, որը ներկում է կորիզում գտնվող ամբողջ ԴՆԹ-ն (նկ. 5.3):

հ (յ 'll,յa 8ր,ոlոuոuայ,,

1 : !l~րuորl,1 ~Zա'lP~ .5յl,(յlյՀ 'l uրa o գոLll)

Հti1ոtiրi.ացոն

Նկ. 5.3. 1 - FISH-ի կատարման ընդհանուր պատկերը, 2 - նմուշ ԴՆԹ-ի և նշադրված զոնդի նուկլեոտիդների միջև կոմպլեմենտար կապերի առաջացում, 3 - FISH-ի ընթացքի մոլեկուլային պատկերը (https://present5.com/ genom-cheloveka-chast-2xromosomnyj-uroven-organizacii/):

7. Պատրաստուկը հետազոտվում է համակարգչի հետ կապված ֆլուորեսցենտ մանրադիտակով: Դիտարկվում են քրոմոսոմների հիբրիդացված, ֆլուորեսցենտ ներկայութերով նշված հատվածները: Ժամանակակից համակարգչային տեխնոլոգիաները կատարում են մանրադիտակային գունային պատկերների թվային գրանցում, մշակում և դասակարգում, որի շնորհիվ հնարավոր է դառնում ուսումնասիրել ինչպես առանձին քրոմոսոմները, այնպես էլ դրանց հատվածները:

5.1.6. FISH մեթոդի արդյունքների դետեկցիա Ֆլուորեսցենցիայի երևույթը հայտնաբերել է Ջոն Հերշելը 1845 թ.: Նա նկատել էր, որ քինինի անգույն թափանցիկ լուծույթը արևի ճառագայթների տակ արձակում է երկնագույն ճառագայթներ: Այս հայտնագործության հետագա ուսումնասիրությունները շարունակեց Ջորջ Ստոքսը, որը բացահայտեց, որ արձակվող լույսի՝ էմիսսիայի ալիքի երկարությունը գերազանցում է կլանված լույսի ալիքների երկարությունը: Կլանվող և արձակվող լույսի ալիքների առավելագույն երկարությունների տարբերությունը անվանվեց Ստոքսի շարժ (նկ. 5.4): Առաջին ֆլուորեսցենտ մանրադիտակները ստեղծվել են 19041911 թվականներին և օգտագործվել էին բնական ֆլուորեսցենցիայով օժտված նյութերի հետազոտման համար: 1930-ական թվականներին ստեղծվեցին ոչ ֆլուորեսցենտ նյութերի նշադրման համար օգտագործվող նշադիր ֆլուորեսցենտ զոնդեր:

Նկ. 5.4. Ֆլուորեսցենցիայի երևույթի ֆիզիկական բնույթի սխեման (https://hmong.ru/ru/%D0%A1%D1%82% D0%BE%D0%BA%D1%81%D0%BE%D0% B2_%D1%81%D0%B4%D0%B2%D0% B8%D0%B3):

Գենային ինժեներիայի մեթոդների կիրառությունը նպաստեց մեծ խումբ ֆլուորեսցենտ նյութերի արտադրմանը, և այսօր արդեն հայտնի են բազմաթիվ ֆլուորեսցենտ ներկանյութեր, որոնք օգտագործվում են բազմագույն հետազոտությունների համար: Նշենք, որ այս ներկանյութերի օգտագործումը պարտադիր նախատեսում է ամեն ներկանյութի կլանման և արձակման սպեկտրների ճշգրիտ որոշում: Կլանված ֆոտոնի էներգիայի որոշ մասը ցրվում է, և արձակվող լույսի ալիքի երկարությունը ավելի մեծ է, քան կլանվողինը: Նկար 5.5-ում

պատկերված է տարբեր էներգիա ունեցող ֆոտոնների արձակող լույսի ալիքների ֆիզիկական բնույթը: Տեսանելի լույսի սպեկտրի ամենաբարձր էներգիան բնորոշ է ՈՒՄ-ից հետո գտնվող կապույտ գույնին, իսկ ամենացածրը ավարտվում է ինֆրակարմիրի հարևանությամբ: Օգտագործվող ամեն մի ֆլուորեսցենտ ներկանյութին բնորոշ են կլանվող և արձակվող ալիքների յուրահատուկ երկարություններ, որոնք պայմանավորված են տվյալ նյութի կառուցվածքային առանձնահատկություններով:

Utiկ11ոա11յրl.ltր

ոար}/ոծաoագայՒ11ltր

t , ~ l l t i ր l II ոար}tiո1ոկաց

~

Նկ. 5.5. Ֆոտոնների էներգիայի տարբեր մակարդակներին համապատասխանող ալիքների երկարությունը և ֆիզիկական բնույթը (https://www.dia-m.ru/blog/fluorestsentnaya-mikroskopiya/):

Ֆլուորեսցենտ ներկանյութերը ավելի հստակ են դրսևորվում, քան սովորականները, ուստի ավելի հարմար են փոքր օբյեկտների նշադրման համար: Լուսային ազդակների հստակ բացահայտման համար արձակվող և գրգռող լուսային ազդակները բաժանվում են՝ մեկուսացվում իրարից:

5.1.7. Ֆլուորեսցենտ մանրադիտակի կազմությունը և կիրառման բնագավառները Ֆլուորեսցենտ մանրադիտակը (նկ. 5.6) կազմված է սովորական լուսային մանրադիտակի սկզբունքով, որում, ի լրացում սովորական արտացոլված կամ կլանված լույսին, օգտագործվում է ֆլուորեսցենցիան: Մանրադիտակի այս տարբերակը թույլ է տալիս հետազոտել 5 նմ չափսերի օբյեկտներ: ~ \ Տtնանt 1t, Լոiu արյ.ր:'յոLfl

Uaաll1կՇfl ~ո11աո որtրtնt,նt,ոն -l>tillllfl

_~luոոt,կ 1որրu.dաՇոri հաlttt,

Նկ. 5.6. Ֆլուորեսցենտ մանրադիտակի կազմության սխեման: (https://www.dia-m.ru/blog/fluorestsentnaya-mikroskopiya/):

1. Լույսի աղբյուր՝ սնդիկային կամ քսենոնային լամպեր, լազեր կամ LED: 2. Գրգռման շերտային ֆիլտր, որը բաց է միայն ֆլուորոֆորով կլանվող ալիքների համար և չեզոքացնում է ֆլուորեսցենցիայի այլ աղբյուրների ազդեցությունը: 3. Էմիսիոն ֆիլտր, որը բաց է թողնում միայն ֆլուորոֆորով արձակվող ալիքները և չեզոքացնում այլ ազդակները: 4. Դիխրոիկ հայելի կամ բարակ ժապավենային ֆիլտր, հստակ գունային ֆիլտր, որը բաց է թողնում միայն որոշակի գունային ազդակներ և փակ է բոլոր մնացածների համար:

Ֆիլտրերը լինում են գրգռող և արգելակող: Մի շարք ֆիրմաներ մշակել են և սկսել արտադրել ամեն մի ֆլուորոֆորին համապատասխանող ֆիլտրերի հավաքածուներ: Ֆիլտրերը տարբերվում են ընթերցման շերտագծերի քանակով՝ միա-, երկ-, եռա- և քառաշերտագիծ: Միկրոպատկերների ընթերցման համար անհրաժեշտ են նաև դիքրոն հայելիներ: Դրանք նույնպես տարբեր են օգտագործվող ամեն մի ֆլուորոֆորի և համապատասխանող ֆիլտրերի համար: Օտար արձագանքների հստակ արգելակման շնորհիվ ֆլուորեսցենտ մանրադիտակը ապահովում է մուգ ֆոնի և վառ ներկված պատկերի ձևավորում: Ֆլուորեսցենտ մանրադիտակը կիրառվում է կենսաբանական, բժշկագիտական և ֆիզիկական հետազոտություններում: Բայց կիրառման հիմնական բնագավառը բջջային կենսաբանությունն է: Ֆլուորեսցենտ մանրադիտարկումը թույլ է տալիս հստակ տեսնել բջջի առանձին տարրերը, հետազոտել դրանում կատարվող կենսաքիմիական, ֆիզիոլոգիական և մորֆոլոգիական պրոցեսները: Արդեն ստեղծվել են բազմաթիվ զոնդեր բջջային միտոքոնդրիումների, ռետիկուլումի և այլ տարրերի հետազոտման համար: Ծավալուն աշխատանքներ են տարվում բջջակորիզի և դրա տարրերի՝ քրոմոսոմների հետազոտման ուղղությամբ: Ֆլուորեսցենտ մանրադիտարկման մեթոդով հետազոտվում են վարակիչ հիվանդություններ առաջացնող հարուցիչները, արյան, ուղեղի, ոսկրային հյուսվածքի բջիջները: Ֆլուորեսցենտ մանրադիտարկման առավելություններից է բարձր զգայունությունը և տարբեր ֆլուորեսցենտ ներկանյութերի միասնական օգտագործումը: Այս դեպքում հնարավորություն է ստեղծվում միաժամանակ հետազոտել մի քանի տարբեր նյութեր, կատարել մուլտիպլեքսային ուսումնասիրություններ: Ֆլուորեսցենտ մանրադիտարկման թերություններից է ֆլուորեսցենտ նյութերի լույս արձակելու ունակության կորուստը և էլեկտրոնների կորստի արդյունքում առաջացող ֆոտոգունաթափումը: Բացի դրանից ներկանյութերը կարող են լինել տոքսիկ որոշ բջջային տարրերի համար: Որպես ելք այս իրավիճակից առաջարկվում է օգտագործել

լազերային ճառագայթումը, որի ալիքները շատ մոտ են ինֆրակարմիր սպեկտրին ու չեն առաջացնում տոքսիկ ազդեցություն, երկարացնում են հետազոտության անվտանգության ժամկետը: Ժամանակակից ֆլուորեսցենտ մանրադիտակներում պատկերները ստացվում են թվային ձևաչափով: Դիտարկման պրոցեսի կարգավորումը՝ ֆոկուսավորումը, տեսադաշտի բարձրացումը, լուսավորման, ֆիլտրերի և այլ օպտիկական տարրերի ղեկավարումը կատարվում է համակարգչի միջոցով, տեսադաշտի խորության փոփոխման եղանակով: Օգտագործվում են օպտոէլեկտրոնային մեխանիզմներ, որոնք թույլ են տալիս կառավարել բջջային գործոնները օպտիկական պինցետներով: Ստացված արդյունքների արձանագրումը, վերամշակումը և ելքային պատասխանի ձևավորումը նույնպես կատարվում է համակարգչային ծրագրերի կիրառմամբ: Ֆլուորեսցենտ մանրադիտակում պատկերը ստեղծում է համակարգիչը նմուշի սկանավորման արդյունքներով: Լույսը ուղղվում է նմուշի ամեն մի առանձին կետի վրա, և համակարգիչը գրանցում է յուրաքանչյուր կետին համապատասխանող ֆլուորեսցենցիայի տեսակը և մակարդակը: Պրոցեսի ավարտից հետո համակարգչի մոնիտորի վրա ձևավորվում է գրանցված թվային ազդակներով վերականգնվող գունային պատկերը (J.W. Lichtman, J.-A. Conchello, 2005, П. Александр, 2008):

5.2. ՖԼՈՒՈՐԵՍՑԵՆՏ IN SITU FISH ՀԻԲՐԻԴԱՑՄԱՆ ՄՈԼԵԿՈՒԼԱՑԻՏՈԳԵՆԵՏԻԿԱԿԱՆ ՄԵԹՈԴ

5.2.1. Անհրաժեշտ սարքերի, ամանեղենի և նյութերի ցանկ - Ֆլուորեսցենտ, բինօկուլյար մասնագիտական մանրադիտակ իմերսիոն՝ x100, և x 20/40/60 օբյեկտիվներով և ֆլուորեսցենտ ֆիլտրերով - Լաբորատոր տաքացնող սարք՝ առնվազն մինչև 90 ºC - Ինկուբատոր՝ 37 ºC - Լաբորատոր ցենտրիֆուգա (1000-3000 պտ/րոպ 120g) - Վորտեքս - Լաբորատոր բաղնիք 90 ºC առավելագույն ջերմաստիճանով

-

Օդափոխիչ պահարան Ավտոմատ միկրոպիպետների հավաքածու Առարկայական ապակիներ Ծածկապակիներ Էպենդորֆի փորձանոթներ՝ 0,5-1 և 1-2 մլ տարողությամբ Հիբրիդացման սարք Ապակե բաժակներ՝ 80-100 մլ տարողությամբ Ռեագենտներ՝ Ֆլուորեսցենտ ԴՆԹ նմուշներ Հիբրիդացիոն բուֆեր Ախտահանված թորած ջուր Թթու HCL (1N) Պեպսին (ակտիվությունը 570 մ/մգ) Աղ MgCl2·6H2O (քիմ. մաքուր) Աղ NaCl (քիմ. մաքուր) Աղ KCl (քիմ. մաքուր) Աղ Na2HPO4 (քիմ. մաքուր) Աղ KH2PO4 (քիմ. մաքուր) Աղ Na3C6H5O7·2H2O (քիմ. մաքուր) Ֆորմալդեհիդ (37 %) NP-40, Tween DAPI, PI լուծույթներ Լուծույթ Vectashild Կաուչուկե սոսինձ Իմերսիոն յուղ

5.2.2. Աշխատանքի կատարման տեխնոլոգիան. Լուծույթների պատրաստում 1. Առաջնային լուծույթ՝ 0,2N HCl : 20 մլ HCl (1N) + 80 մլ H2O (պահել սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում): 2. Աշխատանքային լուծույթ՝ 10 մմոլ HCl : 5 մլ 0,2N HCl + 95 մլ H2O: 3. Պեպսինի աշխատանքային լուծույթ 20 մգ պեպսին + 1 մլ H2O (բաժանել 0,5 մլ չափաբաժինների, պահել -20 ºC պայմաններում): 4. Լուծույթ 1 Մ MgCl2 : 50,825 g MgCl ·6H2O նոսրացնել H2O

մինչև 250 մլ: 5. PBS pH 7,0 (№ 1 և № 2) լուծույթ: 0,1 M NaCl (8 գ/լ) 0,003 M KCL (0,2 գ/լ) 0,008 M Na2HPO4 (1,15 գ/լ) 0,00147 M KH2PO4 (0,2 գ/լ) 6. Ֆորմալդեհիդի լուծույթ PBS/MgCl2 250 մկլ 1 Մ MgCl2 150 մկլ ֆորմալդեհիդ 4,5 մլ PBS 7. 20xSSC рН=5,3 (կարգավորել рН-ը՝ օգտագործելով 1 Մ НCl): 175,3 գ NaCl 88,2 գ Na3C6H5O7·2H2O 800 մլ H2O Աղերը լուծել ջրում, հասցնելով ծավալը 1000մլ: Պահել սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում: Պիտանելիության ժամկետը մինչև 6 ամիս: 8. 2xSSC рН 7,0±0,2 (կարգավորել рН-ը՝ օգտագործելով 1 Մ NaОН): 100 մլ 20xSSC 850 մլ H2O

Աղերը լուծել ջրում, հասցնելով ծավալը 1000 մլ: Պահել սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում: Պիտանելիության ժամկետը մինչև 6 ամիս: 9. 2xSSC/0,1 % NP-40 рН 7,0±0,2 (կարգավորել рН-ը՝ օգտագործելով 1 Մ NaОН): 950 մլ 2xSSC 1 մլ NP-40 Աղերը լուծել ջրում, հասցնելով ծավալը 1000 մլ: Պահել սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում: Պիտանելիության ժամկետը մինչև 6 ամիս: 10. 0,4xSSC/0,3 % NP-40 рН=7,0–7,5 (կարգավորել рН, օգտագործելով 1 Մ NaОН): 20 մլ 20xSSC 950 մլ H2O 3 մլ NP-40 Աղերը լուծել ջրում, հասցնելով ծավալը 1000 մլ: Պահել սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում: Պիտանելիության ժամկետը մինչև 6 ամիս: 11. Ցպիրտերի հավաքածուն՝ (№ 1 և № 2) - 70, 85 և 96 % պահել հերմետիկ փակվող անոթներում սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում: 12. DAPI կամ PI աշխատանքային լուծույթ: 5.2.3. FISH ֆլուորեսցենտ հետազոտության համար ցիտոգենետիկական պատրաստուկների պատրաստում Ցիտոգենետիկական պատրաստուկների պատրաստման սկզբունքները FISH հետազոտություններում օգտագործվում են արյան բջիջները, ֆիբրոբլաստները, էպիթելիումի բջիջները, ամնիոտիկ հեղուկի և ընկերքի բջիջները: Կիրառվում են նմուշներ վերցնելու և բջիջների կուլտիվացիայի սովորական մեթոդներ:

in situ հիբրիդացումը կատարվում է առարկայական ապակու որոշակի հատվածում և փորձի հաջող կատարման համար օգտագործվող բջջային սուսպենզիան պետք է լինի սովորականից խիտ և պարունակի մեծ թվով մետաֆազ փուլում գտնվող բջիջներ: Եթե նմուշը հեղուկ չէ, անհրաժեշտ է ընտրել հյուսվածքի այն հատվածը, որում բացահայտվում են մեծ քանակությամբ բաժանվող բջիջներ: FISH հետազոտություններում օգտագործվող պատրաստուկը պետք է պատրաստ լինի փորձի կատարման ժամկետից 3 օր առաջ և պահվի սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում: Պատրաստուկի որակի ստուգում. Պատրաստուկի որակը ստուգվում է x200 մեծացում ապահովող մանրադիտակով: Բարձր որակի ցուցանիշներն են պատրաստուկի բարձր խտությունը, մետաֆազային սկավառակների բավարար քանակը և դրանց անվնասությունն ու մեկուսացումը մեկը մյուսից: Պատրաստուկի նախնական ֆերմենտային մշակումը Գործողությունը կատարվում է բոլոր տեսակի բջջային կուլտուրաների բացի օմնիոտիկ HCl-ի 10 Մմոլ լուծույթի 100 մլ տաքացնել մինչև 37 ºC: 1.Պատրաստուկի մշակումից առաջ HCl-ի լուծույթին ավելացնել 0,5 մլ պեպսինի աշխատանքային լուծույթ: 2. Ինկուբացնել պատրաստուկը պեպսինի աշխատանքային լուծույթում 37 ºC պայմաններում 5 րոպե: 3. Լվանալ պատրաստուկը PBS № 1 բուֆերում 5 րոպե սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում: 4. Ինկուբացնել պատրաստուկը ֆորմալդեհիդի լուծույթում սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում 10 րոպե (լուծույթի 100 մկլ ներմուծել հիբրիդացման համար նախատեսված հատվածում և ծածկել ծածկապակիով): 5. Լվանալ պատրաստուկը PBS № 2 բուֆերում 5 րոպե սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում: 6. Պատրաստուկը ֆիքսել սպիրտի № 1 (70, 85 և 100 %) խմբով՝ թողնելով ամեն մեկում 3 րոպե:

5.2.4. FISH ռեակցիայի գործընթացը Ֆլուորեսցենտ նյութերի հետ աշխատանքը պետք է կատարել խուսափելով բնական կամ արհեստական լույսի ուղիղ ճառագայթներից: Աշխատանքում օգտագործվում են LSI- լոկուս յուրահատուկ զոնդերը և WCP՝ ամբողջական քրոմոսոմներ նշադրող զոնդերը: Կարող են օգտագործվել հետազոտմանը համապատասխանող այլ զոնդեր: 1. Հալեցնել սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում նախապես սառեցված հիբրիդացիոն բուֆերը և նմուշը ու լավ խառնել: Ցենտրիֆուգել 1-3 վայրկյան: Խառնել վորտեքսի վրա: Կրկնել գործողությունը 2 անգամ: 2. Էպենդորֆի փորձանոթում խառնել արտադրողի ցուցակին համապատասխանող հերթականությամբ և քանակով հետևյալ տարրերը՝ հիբրիդացնող բուֆեր, ԴՆԹ զոնդերը, թորած ջուր: Հիբրիդացման համար ընտրված հատվածի չափսերը համապատասխանեցնել օգտագործվող խառնուրդի ծավալին հետևյալ հարաբերակցությամբ. 24x50 մմ2 — 10 մկլ, 18x18 մմ2 — 5 մկլ: 3. Նախապատրաստած հիբրիդացիոն խառնուրդը խառնել վորտեքսի վրա և ցենտրիֆուգել 1-3 վրկ: Համաբնափոխման և հիբրիդացման կատարում 1. Նախապես պատրաստել և դնել ինկուբատորի մեջ հիբրիդացնող սարքը: Այս նպատակով կարող է օգտագործվել 0.5 դմ3 ծավալով հերմետիկ փակվող և ջերմաստիճանն ու խոնավությունը 24 ժամ պահպանող որևէ անոթ: Խոնավության պահպանումը պարտադիր է: Անոթի ներսի պատերը պատվում են ֆիլտրաթղթով և մշակվում թորած ջրով: Հատակին լցնել է 0.5 սմ թորած ջուր, և այնպես հարմարեցնել պատրաստուկի դիրքը որ ապահովվի դրա կայուն հորիզոնական վիճակը: 2. Լաբորատոր ջերմասարքը տաքացնել մինչև համապատասխան ջերմաստիճան (աղ. 5.2):

3. Հիբրիդացնող լուծույթի անհրաժեշտ ծավալով մշակել պատրաստուկի հիբրիդացվող հատվածը և անմիջապես ծածկել ծածկապակով, խուսափել օդի պղպջակների առաջացումից: Աղյուսակ 5.2 Փորձի կատարման պարագաները WCP և LSI զոնդերի կիրառման դեպքում

Pնաl/lո!U- Pնաl/lո!U- (րրրր11աg Հրրրր11աg~աo ~ան Ulliո- ~ան2tր~աu Uluորլոlf3յոl0 :2ոuri~ lllեսա~օ ~ան2t ր~- l\ոlf3յոl0 u,ր6ա0 աUU1ր6ա0 աՇԲ LՏI

68-75° 73-75°

5ո. 3-5 ո.

3]0 37°

18մ 18մ

4. Ծածկապակու ծայրերը մշակել կաուչուկե սոսինձով և չորացնել: 5. Դնել պատրաստուկը լաբորատոր տաքացուցիչ սարքի վրա և կատարել բնափոխումը համապատասխան պայմաններում (աղ. 5.2): 6. Դնել պատրաստուկը նախապատրաստված հիբրիդացման սարքի հորիզոնական հիմքի վրա և փակել, թողնել ինկուբատորում անհրաժեշտ ժամանակի համաձայն (աղ. 5.2): Պատրաստուկի կարճատև լվացում. Հիբրիդացման ժամկետի ավարտից հետո պատրաստուկը լվացվում է: Հստակ և որակյալ ֆլուորեսցենտ ազդակների ստացման համար անհրաժեշտ է՝ - խուսափել ուղիղ լուսային ճառագայթներից, - բոլոր փուլերում պահպանել ճշգրիտ ջերմաստիճանային ռեժիմ, - մշտապես ստուգել նաև լուծույթների ջերմաստիճանը: Լվացող լուծույթի ծավալը համապատասխանում է չորս պատրաստուկի լվացման ծավալին: Ուստի, եթե պատրաստուկների թվաքանակը այլ է, ջերմաստիճանային ռեժիմի պահպանման նպատակով առարկայական ապակիների թիվը ավելացնել մինչև 4: Լվացման տևողությունը հաշվարկել վերջին պատրաստուկի դնելու ժամկետից: Լվացումը կատարել 3 հաջորդական փուլերով:

ա) լվացման բաժակի մեջ լցնել 70 մլ 0,4xSSC/0,3%NP-40 լվացող լուծույթ, բարձրացնել ջերմաստիճանը մինչև 73±1 ºC: Փորձը սկսելուց 30 րոպե առաջ լվացման բաժակը դնել ջրային բաղնիքի վրա : բ) լվացման բաժակի մեջ ավելացնել 70 մլ 2xSSC/0,1%NP-40 սենյակային ջերմաստիճանի լուծույթ, գ) լվացման բաժակի մեջ ավելացնել 70 մլ սենյակային ջերմաստիճանի թորած ջուր: Լվացման լուծույթները օգտագործել մեկ օրվա ընթացքում: 1. Լվացումը կատարելու համար հանել պատրաստուկի ծածկապակին և տեղադրել պատրաստուկը 0,4xSSC/0,3% NP-40 պարունակող բաժակի մեջ: բաժակը թափահարել 1-3 վայրկյան, ապա լվանալ 2 րոպե: 2. Դնել պատրաստուկը 2xSSC/0,1%NP-40 պարունակող բաժակի մեջ, բաժակը թափահարել 1-3 վայրկյան, ապա լվանալ այն 1 րոպե: 3. Դնել պատրաստուկը 2xSSC/0,1%NP-40 պարունակող բաժակի մեջ, թափահարել բաժակը 5 վայրկյան: 4. Պատրաստուկը հերթականությամբ տեղափոխել № 2 սպիրտային լուծույթներով հետևյալ հերթականությամբ՝ 70, 85 и 96 %, պահելով ամեն մեկում 1 րոպե: 5. Լրիվ չորացնել պատրաստուկը: Ծանոթագրություն. երբեմն պատրաստուկի մակերեսը ծածկվում է թափանցիկ թաղանթով: Թաղանթը չի կլանում ֆլուորեսցենտ ճառագայթները և չի շեղում հետազոտության արդյունքները:

6. Հիմնական ներկանյութի 10 մկլ ծածկել հիբրիդացման հատվածը և դնել վրան ծածկապակի: green կամ aqua ֆլուորոքրոմների համար կարող է օգտագործվել PI կամ DAPI, orange համար՝ միայն DAPI: 7. Պատրաստուկները պահել մթության մեջ -20 ºС ջերմաստիճանի պայմաններում:

5.2.5. FISH ցիտոգենետիկական վերլուծությունը և ստացված արդյունքների մեկնաբանությունը Հետազոտությունը կատարվում է ֆիլտրերի հավաքածու պարունակող ֆլուորեսցենտ մանրադիտակով: Ֆլուորեսցենտ ազդակները առանձին քրոմոսոմներից պետք է լինեն հստակ և ինտենսիվ, ունենան ընդգծված սահմաններ: Քրոմոսոմային խճանկարի բացակայության դեպքում հետազոտվում են առնվազն 20-25 մետաֆազներ: Խճանկարի դեպքում հետազոտվում են մոտ 100 մետաֆազներ: Հետազոտման արդյունքները հաշվարկվում են 2 հոմոլոգ քրոմոսոմների նշադիրների հստակ արտահայտմամբ: Այն դեպքում, երբ ուսումնասիրվում են ինտերֆազային քրոմոսոմները, հետազոտությունների քանակը ավելանում է համապատասխանաբար 2-4 անգամ: Եթե հետազոտվում են հոմոլոգ քրոմոսոմների որոշակի թիրախ հատվածներ պարունակող լոկուսները, դրանք բացահայտվում են երկրորդ յուրահատուկ նշադրի օգտագործմամբ (նկ. 5.7):

Հtոոագոո.[որi. հանն.[ած~ ագ11ակ

ն

ր

Նկ. 5.7. Ա և Բ քրոմոսոմները արձակում են քրոմոսոմյուրահատուկ ազդակ, բայց սայտյուրահատուկ հատվածներ բացահայտվել են միայն Ա քրոմոսոմում: Բ քրոմոսոմում այդ հատվածը բացակայում է՝ միկրոդելեցիա (http://med.by/methods/pdf/118-1109.pdf):

Ցիտոգենետիկական վերլուծության ավարտական փուլում ստացված արդյունքները և նկարները գրանցվում են համակարգչային բազաներում:

5.3. FISH ՄԵԹՈԴԻ ԺԱՄԱՆԱԿԱԿԻՑ ՏԱՐԱՏԵՍԱԿՆԵՐԸ

5.3.1. Բազմագույն FISH՝ M-FISH Գենոմիկայի զարգացման ժամանակակից փուլում մեծ նշանակություն ստացան գենոմների կազմակառուցվածքի և ակտիվության կարգավորման խնդիրներին ուղղված հետազոտությունները: Գենոմների այսպիսի բազմակողմանի հետազոտությունը պահանջում էր դրա կազմի բազմաքանակ տարրերի նշադրման եղանակների ընդլայնում և հստակեցում: Խնդրի լուծման համար անհրաժեշտ էր գտնել նշադրման ավելի բազմագործոն միջոց, որը թույլ կտար միաժամանակ տարատեսակել մի քանի տասնյակ տարրեր, բացահայտել դրանց կազմային բազմազանությունը և դասավորությունը քրոմոսոմներում և բջիջների կորիզում: Մեծ նշանակություն ունեին նաև գեների ակտիվացման և արգելակման, կորիզի սահմաններում քրոմոսոմների տեղափոխման մեխանիզմների հետազոտությունները: Ֆլուորոֆորների քանակի սահմանափակությունը և նոր տիպի նշադիրների հայտնաբերման հետ կապված դժվարությունները հաղթահարվեցին նոր տեխնոլոգիաների մշակման միջոցով: Ինչպես արդեն ասվել է, նոր տիպի ֆլուորեսցենտ մանրադիտակները, ազդակների թվային գրանցման եղանակի և շերտավոր ֆիլտրերի առկայության շնորհիվ, հնարավորություն տվեցին օգտագործել նույն հետազոտվող հատվածի կամ կետի նշադրման համար ոչ թե առանձին ներկանյութեր, այլ դրանց խմբեր՝ 2 կամ ավելի ֆլուորոֆոր: Այսպիսով՝ մեկ նմուշի նշադրման համար ֆլուորոֆորների խմբի օգտագործումը և դրանց համապատասխանող ֆիլտրերի հավաքածուի կիրառումը այն տեխնոլոգիան է, որի շնորհիվ ապահովվում է բազմաթիվ տարրերի յուրահատուկ նշադրման հնարավորություն: Նույն կետից երկու կամ ավելի նիշերից ստացված ազդակները միասնական ձևով գրանցվում են որպես մեկ ինքնուրույն նիշ և օգտագործվում ելքային պատկերի վրա որպես պայմանական որոշված կեղծ գույնի ազդակ (տես 5.3.2):

Բազմագույն FISH (M-FISH - multitarget, multifluor, multicolor կամ multiplex FISH) մեթոդի կիրառությունը հնարավորություն է տալիս նույն փորձի ընթացքում օգտագործել մի քանի տասնյակ զոնդեր: Հետազոտության այս եղանակը կոչվեց M-FISH, և այս անվանումը օգտագործվում է բազմագույն FISH-ի բոլոր տարատեսակների համար: 5.3.2. Կեղծ գունային բազմագունություն Գունային ազդակը գրանցող ժամանակակից սարքերը ունակ են ոչ միայն որոշել ազդակի ինտենսիվությունը, այլ նաև գրանցել ամեն մի կետում արձակվող լուսային ալիքների ամբողջ սպեկտրը: Հետազոտման այս եղանակը կիրառվում է սպեկտրալ կարիոտիպավորման՝ SKY (Spectral karyotyping) համար: Այսօր բազմագույն FISH պատկերների ստացման համար բավարար է թվային ազդակի սև-սպիտակ արձանագրումը, բայց ժամանակակից տեխնիկան ունակ է գրանցել ոչ միայն ազդակների ինտենսիվությունը, այլև գունային սպեկտրի առանձնահատկությունները: Յուրաքանչյուր կետում գտնվող ֆլուորոֆորներից ստացված ինֆորմացիան գրանցվում է առանձին՝ դրանց բնորոշ գրգռող և արգելակող ֆիլտրերի յուրահատուկ խմբերի ընտրության շնորհիվ: Այս ձևով գրանցված յուրաքանչյուր տեսակի ազդակային խմբին համապատասխանեցվում է առանձին անկրկնելի կեղծ գույն: Անհրաժեշտ ֆիլտրերի առկայության դեպքում ազդակների գրանցման այս եղանակը թույլ է տալիս միաժամանակ օգտագործել գրգռման և արգելակման տարբեր սպեկտրներ ունեցող տարբեր ֆլուորոֆորներ (նկ. 5.8): Մի քանի ֆլուորոքրոմների միաժամանակ օգտագործմամբ ձևավորվում են մեծ քանակությամբ կեղծ գույներ: Օրինակ՝ եթե A ֆլուորոքրոմով նշված կետը համարվի առաջին՝ 1 կեղծ գույն, իսկ B ֆլուորոքրոմով նշված կետը համարվի երկրորդ՝ 2 կեղծ գույն, ապա A և B ֆլուորոքրոմներով նշված կետը կհամարվի երրորդ՝ 3 կեղծ գույն:

Նկ. 5.8. Ֆիլտրերի հավաքածուների գրաֆիկ պատկերները. ա - միաշերտագիծ ֆիլտրերի հավաքածու, բ - երկշերտագիծ ֆիլտրերի հավաքածու, գ - եռաշերտագիծ ֆիլտրերի հավաքածու, դ - քառաշերտագիծ ֆիլտրերի հավաքածու www.bionet.nsc.ru/vogis/vestnik. php?f=1999&

Այսպիսով՝ երկու ֆլուորոֆորների օգտագործումը թույլ է տալիս նշել ԴՆԹ-ի 3 նմուշ և ստանալ քառագույն պատկեր, քանի որ երրորդ ֆլուորոֆորը օգտագործվում է բոլոր քրոմոսոմների ընդանուր գունավորման համար (նկ. 5.9):

■ ■ ■■ ■ ■■ ■■

:եLոոր,ո.1:ոոն 1

կերiծ գոյն 1

:եLոոր,ո.1:ոոն 2

կերiծ գոյն

:եLոոր,ո,1եոոններ, 1+ 2

կերiծ գոյն 3

:եLոոր,որոոն 3

կերiծ գոյն կ

:եLոոր,ոQր,ոններ, 1+3

կերiծ գոյն 5

:եLոոր,ոQր,ոններ, 2+3

կերiծ գոյն ծ

■ ■ ■:bLmnr,nQr,nuubr, 1+2+3

կերiծ գոյն 7

■ ■ ■

■ ■ ■ ■

Նկ. 5.9. Կեղծ գույների ձևավորման սխեման (www.bionet.nsc.ru/vogis/vestnik.php?f=1999&):

Այսպիսով՝ ֆլուորոֆորների քանակի աննշան ավելացման շնորհիվ հնարավոր է դառնում ստեղծել մեծ քանակությամբ կեղծ գույներ՝ n ֆլուորոֆորների օգտագործմամբ ստեղծվող կեղծ գույների քանակը որոշվում է 2n-1 բանաձևով, օրինակ՝ 5 ֆլուորոֆորների օգտագործման դեպքում հնարավոր է ստեղծել 25-1, այսինքն՝ 32-1=31 կեղծ գույն, որոնք բավարար են մարդու 23 զույգ քրոմոսոմների նշադրման համար (նկ. 5.10):

Նկ. 5.10. Քրոմոսոմների բացահայտում բազմագույնանի insitu (FISH) եղանակով՝ կեղծգույնանի մեթոդի կիրառման միջոցով. Ա - կեղծ գույների ձևավորում 7 ֆլուորոֆորների տարատեսակ խմբավորման միջոցով, Բ - քրոմոսոմները միտոտիկ և ինտերֆազային բջիջներում, Դ - կորիզի կտրվածք հասարակածով, Գ - կորիզի կտրվածք հասարակածից 2 մկմ բարձր (Walteretal. J., 2006):

Կեղծգույնանի բազմագույնության մեթոդի կիրառությամբ կատարվում են ԴՆԹ-ների և դրանց հատվածների ուսումնասիրություններ:

5.4. 24-ԳՈՒՅՆԱՆԻ FISH (MULTICOLOR FISH) ՄԵԹՈԴ

Մարդու կարիոտիպը կազմված է 23 զույգ քրոմոսոմներից, որոնցից 22 զույգը աուտոսոմներ են, իսկ 1-ը՝ սեռական X և Y քրոմոսոմները: Այսպիսով՝ մարդու բոլոր քրոմոսոմների իդենտիֆիկացիայի՝ նույնականացման համար անհրաժեշտ է ունենալ 24 յուրահատուկ նշադրված քրոմոսոմ՝ յուրահատուկ ԴՆԹ-նմուշներ: Ինչպես արդեն նշել ենք, 24 քրոմոսոմի նշադրման համար բավարար է 5 ֆլուորոքրոմ: Քրոմյուրահատուկ ԴՆԹ-ի գրադարանները նշադրվում են 5 ֆլուորոֆորների յուրահատուկ խմբերով: Այս մեթոդով՝ in situ ֆլուրեսցենտ հիբրիդացման արդյունքում մարդու յուրաքանչյուր քրոմոսոմ ստանում է իրեն բնորոշ կեղծ գույն (նկ. 5.10 և 5.11):

Նկ. 5.11. Մարդու քրոմոսոմների 24-գույնանի FISH պատկերները. ա - մետաֆազային սկավառակ, բ - քրոմոսոմների կարիոգրամ, գ - մարդու 8-11-րդ քրոմոսոմների տրանսլոկացիաների վերլուծությունը (https://www.slideshare.net /DrAkshayJoshi/aj-seminar-crd):

Ամբողջական քրոմոսոմների նշադրման համար անհրաժեշտ են նախապես առանձնացված, տեսակավորված և նշադրված ԴՆԹ զոնդեր:

Նկ. 5.12. Քրոմոսոմների 24 գույներով ներկման կարգը և փուլերը. HUMAN CYTOGENETICS (NatureReviewsGenetic, 2002, փոփոխված):

Անջատված և դասակարգված քրոմոսոմները ստացվում են բջիջների կարիոտիպի անջատման միջոցով: Օրինակ՝ լիմֆոցիտների բջիջները պայթեցվում են որևէ՝ օսմոտիկ ճնշման փոփոխման կամ թաղանթի քայքայման եղանակով, և դրանցից անջատվում են քրոմոսոմները: Ապա հոսքային լազերային բջջամետրիայի եղանակով (Flow cytometry) խառնուրդները ենթարկվում են լազերային ճառագայթման, որը տեսակավորում է քրոմոսոմները մոլեկուլային զանգվածի համաձայն: Զուգահեռ նախապատրաստվում են ֆլուորոքրոմների խառրնուրդներով նշադրված քրոմոսոմյուրահատուկ 25 զոնդեր: Քրոմոսոմների կազմի ոչ յուրահատուկ հերթականությունները չեզոքացվում են Cot-1 DNA չնշադրված ԴՆԹ-ի հատվածներով: Հիբրիդացման համար օգտագործվող լուծույթի մեջ ավելացվում է Cot-1 DNA, որը կապվում է ոչ յուրահատուկ հերթականությունների հետ և նշադրված

զոնդերը նպատակային ձևով կապում են միայն քրոմոսոմ յուրահատուկ հատվածները (նկ. 5.12): Օգտագործելուց առաջ երկշղթա զոնդերը պետք է բնափոխվեն: Ամբողջական քրոմոսոմների նշադրման բազմագույն եղանակը բացահայտում է ոչ հոմոլոգ քրոմոսոմների միջև կատարվող բոլոր տեսակի տրանսլոկացիաները: Տարբեր քրոմոսոմների յուրահատուկ գունավորման շնորհիվ, այլ քրոմոսոմի հատվածը ստանում է դրան բնորոշ գունավորում, և քրոմոսոմը ներկվում է զոլերով՝ սեփական և տրանսլոկացիայի արդյունքում միացած հատվածի գույներով: Հիմնական քրոմոսոմի և այլ քրոմոսոմի միացած հատվածի գույները թույլ են տալիս ճշգրիտ որոշել տրանսլոկացիային մասնակցող քրոմոսոմները: Նույն վերլուծության սահմաններում հնարավոր է որոշել քրոմոսոմներում կատարված կտրվածքների և միացումների լոկուսները: Մինչև վերջին ժամանակները, ցավոք, նման զոնդեր պատրաստվել են միայն մարդու բոլոր և մկների մի քանի քրոմոսոմների համար (Kosyakova, et al., 2013): Նշենք, որ ներքրոմոսոմային վերակառուցումները՝ դելեցիաները, դուպլիկացիաները և ինվերսիաները այս եղանակով չեն բացահայտվում (Christian, et al., 1998):

5.4.1. RxFISH ՄԵԹՈԴ

1997 թ. Քեմբրիջի համալսարանի մի խումբ գիտնականներ՝ Ֆերգյուսոն-Սմիթ, Վայենբերգ, և Մյուլլեր, մշակեցին նախահիմքեր մարդու քրոմոսոմների բազմագույն բենդինգի՝ օղակակապման համար: Աշխատանքի նպատակն էր նշադրել մարդու քրոմոսոմների առանձին հատվածները և հետազոտվող կարիոտիպերում համեմատության եղանակով բացահայտել քրոմոսոմային վերակառուցումները: Այս մեթոդի հիմքում ընկած է միջտեսակային բազմագույն in situ հիբրիդացման եղանակը: RXFISH հետազոտություններում օգտագործվող ԴՆԹ զոնդերը նշադրվում են 3 ֆլուորոֆորներից կազմված խմբերով և առաջացնում 7 կեղծ գույն: ԴՆԹ-ի որոշակի հերթականությունների նկատմամբ կոմպլեմենտար նշադրող զոնդերը կապվում են

քրոմոսոմների համապատասխան հատվածների հետ և առաջացնում դրանց զոլավոր գունավորված պատկերներ: Զոլավորության առաջացման պատճառները զուտ գենետիկական են և պայմանավորված են օգտագործվող զոնդերի բնույթով: Հայտնի է, որ մարդանման կապիկների և մարդու քրոմոսոմների նուկլեոտիդային հերթականությունների գումարային կազմը գրեթե նույնն է, բայց էվոլյուցիայի ընթացքում՝ տեսակների ձևավորման պրոցեսում, կատարվել են ընդհանուր նախնու քրոմոսոմների տեսակայուրահատուկ վերակառուցումներ և ձևավորվել են այժմ առկա տեսակների քրոմոսոմները: Մարդանման կապիկների կարիոտիպերը կազմված են 48 քրոմոսոմներից, մարդու կարիոտիպում քրոմոսոմների քանակը հավասար է 46: Քանակի այս փոփոխության պատճառը Ռոբերտսոնի տրանսլոկացիան է, որը կատարվել է մարդու կարիոտիպի ձևավորման պրոցեսում: Նույն եղանակով վերակառուցումներ են կատարվել նաև բոլոր քրոմոսոմների կազմում: Տեսակայուրահատուկ վերակառուցումների արդյունքում, օրինակ, հիբբոնների կարիոտիպի քրոմոսոմների կազմը տարբերվում է այլ տեսակների կազմից, և հիբբոնի որոշակի քրոմոսոմի հատվածները, մեծ հավանականությամբ, կոմպլեմենտար են շիմպանզեի կամ մարդու մի քանի տարբեր քրոմոսոմների հատվածներին: Նաշվի առնելով այս հանգամանքը՝ մեթոդի հեղինակները ընտրել են երկու տեսակի հիբոնների՝ Hylobates concolor և Hylobates syndactylus քրոմոսոմյուրահատուկ ԴՆԹ-ի գրադարաններից առանձին քրոմոսոմներ և օգտագործել դրանց հատվածները որպես զոնդեր: Հիբոնների որոշակի քրոմոսոմի տեսակայուրահատուկ զոնդը նշում է այդ քրոմոսոմում առկա ԴՆԹ-ի բոլոր հատվածները: Մարդու էվոլյուցիայի պրոցեսում կատարվող քրոմոսոմային հատվածների վերակառուցումների արդյունքում այդ հատվածները առաջացրել են նոր խմբավորումներ: Հիբբոնի ԴՆԹ-ի զոնդերի օգտագործմամբ կատարվող հետազոտության արդյունքում հաջողվել է ուսումնասիրել մարդու քրոմոսոմների հատվածների կազմը և ստանալ նորմալ քրոմոսոմի կազմության պատկերը (նկ. 5.13):

Otiրոն Շ 2կ

~ - -• - d օtipոս Շ5

f lipոս C12

~

Ըea5 e,

Նկ. 5.13. Մարդու քրոմոսոմների զոլավորումը RXFISH գունավորման դեպքում: 1 - Մարդու քրոմոսոմների գունային զոլավորումը RXFISH դեպքում. ա - մետաֆազային սկավառակ, բ - դասակարգված կարիոգրամ: 2 - Մարդու 1-ին քրոմոսոմի գենետիկորեն պայմանավորված գունային զոլավորում https://textarchive.ru/c1090512-p2.html

Ինչպես տեսնում ենք, քրոմոսոմների զոլավորման աստիճանը շատ տարբեր է: Հետազոտման RXFISH մեթոդի ինֆորմատիվությունը ուստի տարբեր է տարբեր քրոմոսոմների դեպքում, քանի որ մի շարք

քրոմոսոմների մեծ հատվածներ ներկվում են նույն գույնով, իսկ քրոմոսոմների որոշ մասը, օրինակ՝ 15, 18, 19, 21, 22, X և Y-ը ամբողջովին ներկվում են մեկ գույնով: Նշանակում է՝ մարդու այս քրոմոսոմների հատվածները չեն ենթարկվել միջքրոմոսոմային վերակառուցումների, իսկ մեկ գույնով ներկված քրոմոսոմի կազմում կատարվող ներքին վերակառուցումները հետազոտման այս եղանակով չեն բացահայտվում: Մեթոդը կարող է բարելավվել, եթե հետազոտությունում օգտագործվեն ավելի փոքր չափսերի ու մեծ քանակությամբ զոնդեր և ֆլուորոֆորային խմբերի ներկանյութերի ավելի մեծ քանակ: Այլ քրոմոսոմներում ձևավորվել է գունավոր զոլավոր պատկեր և դրանով հնարավոր է դատել քրոմոսոմների ներ- կամ միջմոլեկուլային վերակառուցումների մասին: RXFISH մեթոդը թույլ է տալիս մեկ հետազոտության սահմաններում կատարել ամբողջ գենոմի բազմագունային FISH վերլուծություն, բացահայտել ներ- և միջ- քրոմոսոմային խոշոր վերակառուցումները: Մարդու ամեն մի քրոմոսոմի համար մշակվել է սեփական գունային կոդ՝ բարկոդ: RXFISH մեթոդը կատարվում է նաև ավտոմատ եղանակով և լայնորեն կիրառվում է քրոմոսոմային հետազոտություններում: Մարդու և տարբեր տեսակի հիբոնների 1-ին քրոմոսոմի կառուցվածքային համեմատական պատկերը ներկայացվում է նկար 5.13.2ում: Ինչպես տեսնում ենք, մարդու 1-ին քրոմոսոմի կազմում առկա են հիբբոնի չորս՝ 5-րդ, 9-րդ, 12-րդ և 24-րդ քրոմոսոմների հատվածներ:

5.4.2. Բազմագույն FISH օղակակապ (MuliColor Banding - MCB) Յենա քաղաքի համալսարանի և MetaSystems GmbH կազմակերպության համատեղ ջանքերով 1999-2000 թվականներին ստեղծվեց քրոմոսոմային ԴՆԹ-ների միկրոդիսեկցիոն զոնդերի հավաքածու, որի օգտագործումը ապահովում էր ազդակների ինտենսիվության բավարար մակարդակ (Chudoba, et al., 1999b, Rubtsov, et al., 2000): Ստացված ազդակների գրանցման համար զուգահեռաբար մշակվել է համակարգչային վերլուծող ծրագիր՝ MetaSystems’ isis FISH, որի օգնությամբ կատարվել է ստացվող ազդակների ինտենսիվության մակարդակի վերլուծություն: Նոր ստեղծված ծրագիրը թույլ էր տալիս տարբերակել ոչ միայն ֆլուորոֆորների առանձին համալիրներից ստացվող գումարային ազդակները, այլև գրանցել այդ ազդակների ինտենսիվության մակարդակները: Հետազոտվող քրոմոսոմի տարբեր շրջաններին կոմպլեմենտար զոնդերը նշադրվում են տարբեր ֆլուորոֆորներով կամ դրանց խմբերով: Յուրաքանչյուր նշադրված ԴՆԹ զոնդի ազդակի մակարդակը յուրահատուկ է, ինքնատիպ: Նշենք, որ ազդակների ամենաբարձր ինտենսիվությունը նշադրված հատվածի կենտրոնում է և մարում է ծայրերում, որտեղ երկու հարևան նշադրերի ազդակները միավորվում են: Զոնդերի ազդակների ինտենսիվության վերածածկումը առաջացնում է քրոմոսոմի երկարությամբ տարբեր ֆլուորոֆորների ֆլուորեսցենցիայի ինտենսիվության հարաբերակցությունների փոփոխություն: Ինտենսիվությունների հարաբերության մակարդակները թվայնացվում են, և յուրաքանչյուր մակարդակ նշվում է առանձին կեղծ գույնով: Այսպիսով՝ թվային վերլուծության արդյունքում քրոմոսոմի ամեն հատված ստանում է իրեն բնորոշ կեղծ գույն: Ներկայացվող վերլուծության ցայտուն օրինակ է մարդու 5-րդ քրոմոսոմի գունային բենդինգը: Քրոմոսոմի 7 շրջաններ նշադրված են 5 ֆլուորոֆորների միջոցով: Ստացված ազդակների հարաբերակցության ցուցանիշների համակարգչային վերլուծությունը բացահայտում է 20-ից ավելի տարբեր կեղծ գույներով նշված բենդեր (նկ. 5.14):

Նկ. 5.14. Մարդու 5-րդ քրոմոսոմի բազմագույն MCB-ի արդյունքները. 1 - նշադրված շրջանների գունային պատկերը, 2 - նշադրերի ազդակների ինտենսիվության գրաֆիկ պատկերը, 3 - 5-րդ քրոմոսոմի բազմագույն բենդինգը, 4 - քրոմոսոմի իդիոգրամ, 5 - օգտագործվող ֆլուորոքրոմների գունային պատկերները (https://textarchive.ru/c-1090512-p2.html):

Գունային նույն պատկերը ստացվում է ինչպես մետաֆազի միջին, այնպես էլ վերջին փուլում գտնվող, ավելի խիստ ոլորված քրոմոսոմներում: Այսպիսով՝ հետազոտման այս եղանակը կարող է օգտագործվել մետաֆազի ուշ փուլում գտնվող քրոմոսոմների հետազոտման համար: Այժմ արդեն միկրոդիսեկցիոն զոնդեր ստեղծվել են մարդու բոլոր քրոմոսոմների համար: Քրոմոսոմների բազմագույն բենդինգ ստանալու համար կարող են օգտագործվել նաև քրոմոսոմների համապատասխան շրջանների հատվածները կրող լոկուս յուրահատուկ YAC վեկտորների համախբերը (Heller, et al., 2000): Բայց մեկ քրոմոսոմի բենդինգ պատկերի ստացման համար անհրաժեշտ է առնվազն մի քանի հարյուր YAC վեկտորներից կազմված գրադարան, իսկ ստացված արդյունքների տեղեկատվական արժեքը կլինի ավելի նվազ, քան

6-7 միկրոդիսեկցիոն գրադարանի օգտագործման դեպքում: Նշենք նաև, որ քրոմոսոմները պահպանում են իրենց տարածական կազմությունը բջջային ցիկլի բոլոր փուլերում, ինչի շնորհիվ MCB մեթոդը կարող է կիրառվել դրանց վերակառուցումների հետազոտման համար նաև ինտերֆազ փուլում (Claussen, et al., 1994): Այս հանգամանքը ավելի արդյունավետ է դարձնում MCB մեթոդը ներքրոմոսոմային վերակառուցումների հետազոտություններում և քաղցկեղների ախտորոշման գործընթացում: Քրոմոսոմային միկրոպատկերների թվային գրանցման մեթոդը՝ բազմագույն FISH օղակակապ (Muli Color Banding - MCB), չնայած շատ արդյունավետ է առանձին քրոմոսոմների հետազոտման համար, սակայն դեռ չի կարող օգտագործվել ամբողջական քրոմոսոմային հավաքակազմի մանրակրկիտ հետազոտություններում, բայց հնարավորություն է տալիս կատարել առանձին քրոմոսոմի տարբեր հատվածների մանրամասն հետազոտություն: 5.4.3. Սպեկտրալ կարիոտիպավորում (Spectral Karyotyping SKY) SKY մանրադիտակային պատկերների հետազոտման հիմնական սկզբունքները չեն տարբերվում M-FISH-ի տեխնոլոգիայից: Տարբերվում է միայն պատկերի գրանցման եղանակը, որի համար օգտագործվում է սպեկտրալ տեսանելիության (Spectral Imaging) տեխնոլոգիան, որը և շատ արդյունավետ է օբյեկտի սպեկտրային բնութագրման համար, և կիրառվում է ինչպես հետազոտական աշխատանքներում, այնպես էլ արդյունաբերությունում և բժշկագիտական ախտորոշման բնագավառում: Այս տեխնոլոգիան թույլ է տալիս մեկ հետազոտման ընթացքում ստանալ մանրադիտակային պատկերի բոլոր կետերի սպեկտրային կորերը և սովորական, և ֆլուորեսցենտ ներկանյութերի դեպքում: Գրանցման այս եղանակը քիչ զգայուն է ազդակների ինտենսիվության նկատմամբ և ավելի լավ է տարբերակում «աղմուկը» իրական ազդակից: Մարդու բոլոր քրոմոսոմների սպեկտրալ կարիոտիպավորման համար օգտագործվում են քրոմոսոմների որոշակի հատվածը ճանաչող 5 ֆլուորոքրոմներ. մեկը կանաչ, երկուական

կարմիր և ինֆրակարմիր դիապազոններում: Տարբեր նշադիրներով նշված զոնդերի հավաքածուի օգտագործման դեպքում ամեն քրոմոսոմ ստանում է իրեն բնորոշ յուրահատուկ սպեկտրալ պատկեր: Բոլոր ֆլուորոքրոմների գրգռումը և ազդակի արձակումը կատարվում է ֆիլտրերի նույն խմբի օգտագործմամբ: Այս հանգամանքը թույլ է տալիս խուսափել ֆիլտրերի խմբերի փոխանակման գործընթացի հետ կապված շեղումներից և այլ դժվարություններից՝ ֆիլտրերի փոխարինումներ, պատկերի շեղումներ, ֆոկուսի ճշտումներ և այլն: Էքսպոզիցիայի մեկ գործողության ընթացքում CCD իմիջի ամեն պիկսելի (Charge-coupleddevice - լիցքային կապով սարք) համար միաժամանակ գրանցվում է արձակվող լույսի ամբողջական սպեկտրային բնութագիրը: Ինտերֆերոմետր սարքի ընթերցող մակերեսին հասնող լույսը կամ ազդակը փոխանցվում է մեկ հանգույցով և փոխակերպվում լարումների մակարդակների: Այսուհետև ազդակը ուժեղացվում է, բուֆերացվում և փոխանցվում համապատասխան սարքին, որը փոխարինում է լուսային ազդակը թվային ցուցանիշով: Թվային ցուցանիշներով կառուցվում են կորեր, որոնք բացահայտում են յուրաքանչյուր պիկսելում առկա ֆլուորոքրոմները: Հաջորդ քայլով համակարգչային հատուկ ծրագիրը որոշում է հետազոտվող նյութի քրոմոսոմային պատկանելությունը և յուրաքանչյուր քրոմոսոմային զույգին տալիս է որոշակի կեղծ գույն: Կարիոտիպի վերլուծությունն այս դեպքում դառնում է ավելի հեշտ, քանի որ հոմոլոգ քրոմոսոմները ունեն նույն գույնը, իսկ վերակառուցումները հեշտությամբ հայտնաբերվում են օտար գույնի առկայությամբ (նկ. 5.15): Այս եղանակով ճշտվում են բոլոր քրոմոսոմները և քրոմոսոմային վերակառուցումները, նույնիսկ քրոմոսոմներից անջատված հատվածների ծագումը:

1, .6

II

(}

11 ,,

.. *

1կ

••

J2

կ

•

I I

•• ••

X y

Նկ. 5.15. SKY եղանակով ստացված կարիոտիպի պատկերը: 1 - բացահայտվել են միակողմանի 7/11 և 9/22 տրանսլոկացիաներ, 2 - բացահայտվել են քրոմոսոմային հատվածներ, մեծ սլաքով՝ 2-րդ քրոմոսոմի, փոքր սլաքով՝ 10-րդ (http://www.spectral-imaging.com/attachments/236_):

SKY եղանակի առավելություններից մեկը այն է, որ նույն հետազոտության սահմաններում գրանցվում է նաև DAPI ներկումը: DAPI ներկման ազդակի համակարգչային բարելավված տեխնոլոգիան թույլ է տալիս ստանալ քրոմոսոմների կազմության ճշգրիտ պատկեր, որի շնորհիվ հաջողվում է բացահայտել ինչպես քրոմոսոմային վերակառուցումները, այնպես էլ քրոմոսոմային դերիվատները՝ փոփոխված տարբերակները (Macville, et al., 1999): Զուգահեռ կատարվող սպեկտրալ և քրոմոսոմների որակական տարատեսակված ներկումը հեշտացնում է ստացված արդյունքների վերլուծությունը և կտրվածքների լոկուսների ճշգրիտ որոշումը: Մեկ այլ առավելություն է նմանվող հատկանիշներով ֆլուորոքրոմների կիրառման հնարավորությունը, ինչի շնորհիվ SKY հետազոտություններում օգտագործվող ֆլուորոքրոմների ցանկը բավականին մեծ է: SKY մեթոդի թերություններից է մանրադիտակային պատկերների գրանցման երկարատևությունը: Spectral Imaging տեխնոլոգիաները կիրառվում են նաև ինտերֆազային կորիզների հետազոտությունների համար: Ինտերֆազային հետազոտություններում բացահայտվում են քրոմոսոմների և դրաց

հատվածների քանակական շեղումները: Մեթոդը կիրառվում է գենոմային և քրոմոսոմային մուտացիաների ու քաղցկեղների ախտորոշման համար: 5.4.4. Համեմատական գենոմային հիբրիդացում՝ ՀԳՀ (Comparative Genomic Hybridization, CGH) Համեմատական գենոմային հիբրիդացումը (ՀԳՀ) ժամանակակից մոլեկուլագենետիկական հետազոտման մեթոդ է, որը թույլ է տալիս հիբրիդացման մեկ փորձի ընթացքում կատարել ամբողջ գենոմի գնահատում (О.П. Каллиониеми, 1992, О.П. Каллиониеми, 1994): CGH մեթոդով երկու՝ փորձնական, և ռեֆերենս՝ նորմալ ԴՆԹ-ների հիբրիդացման միջոցով կատարվում է դելեցիաներ կամ դուպլիկացիաներ պարունակող քրոմոսոմային հատվածների բացահայտում: Փորձնական և ռեֆերենս՝ թեստային ԴՆԹ-ները նշադրվում են երկու ֆլուորոքրոմներով, օրինակ՝ կանաչ գույնով հետազոտվողը (FITC) և կարմիր գույնով՝ թեստայինը (Texas Red): Նշադրումը կարող է լինել ուղղակի կամ անուղղակի: Ուղղակի նշադրման դեպքում օգտագործվում են ֆլուորոքրոմի հետ կոնյուգացված դեզօքսինուկլեոտիդներ՝ ռոդոմին-dUTP, ֆլուորեսցին- dUTP, տեխասյան կարմիր- dUTP (V. Lestou, 1999): Անուղղակի նշադրման դեպքում օգտագործվում են բիոտին- dUTP կամ դիգոկսին dUTP նշադրված դեզօքսինուկլեոտիդներ: Մրցակցային հիբրիդացումը կատարվում է գենոմային Cot-1 ԴՆԹ-ի ներկայությամբ, որը չեզոքացնում է գենոմի ցրված կրկնվող հերթականությունների ակտիվությունը: Ստացված պատկերի վերլուծությունը կատարվում է թվային պատկերների համեմատություն կատարող համակարգչային ծրագրով: Այս ծրագիրը համեմատում է քրոմոսոմի սրինգի վրա ֆլուորեսցենտ ազդակների (կարմիր/կանաչ) ինտենսիվության գնահատում, որի արդյունքը գծապատկերի ձևով ներկայացվում է քրոմոսոմների ամեն զույգի համար որպես հիբրիդացման կտրվածքի՝ ՀԿ-ի պատկեր: Եթե հետազոտվող ԴՆԹ-ում քանակական փոփոխություններ չկան, երկու ֆլուորեսցենտ ազդակների ինտենսիվության հարաբերակցությունը հավասար է 1: Եթե հարա507

բերակցությունը փոքր է 0,5-ից, առկա է դելեցիա, եթե մեծ է 1,5-ից՝ դուպլիկացիա: Եթե հետազոտվող նմուշում դիտվում է բջջային խճանկար՝ մոնոսոմիա կամ տրիսոմիա ազդակների ինտենսիվության հարաբերակցությունը նույնպես փոխվում է՝ մոնոսոմիայի դեպքում՝ 0,75, իսկ տրիսոմիայի դեպքում՝ 1,25 (նկ. 5.16): 'lնրԸր-t, Lt,որ,eյնաl.jան ննո2

ULոոգt,i 'll.,րԸր

i րl i Շօt-1

կաUաՀ •

Հ:t,րր,t,րiացոն

/ #

'lնրթ կա[1

llLոոր,ենցենLոայt,ն հար,արեր,աl.jցո[ժյոն Llար,նt,ր, կաUա1

I

fl

րթi.tաit,ն UjաLոկեր,t, նշաl.jոն

ե

րiոն..Lոt,l.jացt,ա

I

llLոոր,ենցենLոայt,նյ նանր,արit,Lոար,l.jոն

L _ ._ _ ____, /

aI

րiեtեցt,ա

UեLոա~ագայt,ն նոր,LiաL նկակարiակներ,

0.5 0.75 1 1.25 1.5

Նկ. 5.16. Համեմատական գենոմային հիբրիդացման հիմնական փուլերը (М.Е. Миньженкова, 2014):

CGH մեթոդի լայն օգտագործումը քաղցկեղների ախտորոշման ժամանակ առաջացրեց կիրառվող համակարգչային ծրագրերի բարելավման անհրաժեշտություն: Այժմ արդեն ստեղծվել են հետազոտության արդյունքների վերլուծության նոր ծրագրեր, որոնցից ամենալայն օգտագործվողներն են՝ Applied Imaging, Meta Systems, LUCIA: CGH մեթոդը թույլ է տալիս բացահայտել 10-12 մլն.զ. նուկլեոտիդային հատվածների փոփոխությունները, ավելի փոքր չափսերի կորուստները կամ ավելացումները չեն գրանցվում: Մեթոդի զգայունության աստիճանի բարձրացման նպատակով կատարվող աշխատանքները ուղղված են այս սահմանափակումների հաղթահարմանը և ավելի փոքր փոփոխությունների բացահայտման մեթոդների մշակմանը:

Դանիացի գիտնականների մի խումբ (М. Kirchhoff, et al.) 1997 թ. մշակել են մեթոդ, որը թույլ է տալիս բարձրացնել CGH հետազոտության զգայունության և յուրահատկության մակարդակը: Հիբրիդացման կտրվածքի (ՀԿ) գնահատման համար հեղինակները օգտագործել են ոչ թե ծրագրով նախատեսված փոփոխականության վստահելիության լայնույթները, այլ մշակել են ամեն առանձին ստուգիչ նմուշի համար սեփական վստահելիության լայնույթներ: Այս լայնույթները կառուցվել են 16 տարբեր մարդկանց գենոմների հետազոտման արդյունքներով: Պարզվել է, որ առաջարկված ճշտումն անհրաժեշտ է, քանի որ հիբրիդացման արդյունքում ստացված նորմալ գենոմների և ստուգիչ նմուշների ազդակների ինտենսիվության հարաբերակցությունը հաճախ շեղված է 1 ցուցանիշից: Նշվում է, որ այդօրինակ շեղումները գրանցվում են նույն քրոմոսոմների որոշակի հատվածներում, և դրանց պատճառը կարող են լինել լաբորատոր կամ աշխատանքային բնույթի՝ հիբրիդացման պայմաններ, փորձի կատարման եղանակ, ձեռքի սխալ և այլն: Ուրեմն վստահելիության լայնույթները պետք է ճշտել ամեն առանձին լաբորատորիայի համար, դրա պայմաններին համապատասխան: Առաջարկվող եղանակով կառուցված վստահելիության լայնույթը համեմատվում է ստուգիչի հետ, և այն շրջանները, որտեղ դրանք չեն համընկնում, համարվում են վերակառուցված (նկ. 5.17): Ձևավորված եղանակը ստացավ Բարձր թույլատրության համեմատական գենոմային հիբրիդացում՝ High-Resolution Comparative Genomic Hybridization (HR - CGH) անվանումը: Կատարելով քրոմոսոմային վերակառուցումների մի շարք հետազոտություններ М. Kirchhoff-ը ցույց տվեց, որ հետազոտման այս եղանակը թույլ է տալիս բացահայտել 3-5 մլն զն. չափսի վերափոխումները: Այսպիսով՝ մեթոդի օգտագործման համար անհրաժեշտ պայման է ստուգիչ վստահելիության լայնույթի անհատական հաշվարկը:

0.5

1.0

ՀDորoնակա ljնոահl:i1tոգրյաU t,նոl:iրljա1

1.5

UոաUրյարո ljնոահl:iրtոtր,յան t,նոl:iրljա1

I

յ- 1~ l=_

_j~ -UL'

!

!~ ծ

~~

Hl?

:1

կ

~ Ց

~~

L i~ g 1կ

ցI~

ո):,

1ծ

K

Irt::

§f

~~

L

րո1

1Ց

X

y

L ն 1,

Նկ. 5.17. Քրոմոսոմային դիսբալանսի ախտորոշում գրաֆիկ պատկերների կիրառմամբ. 1 - քրոմոսոմային դիսբալանսի ախտորոշում բարձր թույլատրության համեմատական գենոմային հիբրիդացման միջոցով, 2 - համեմատական գենոմային հիբրիդացման արդյունքում ստացված մարդու գենոմի ամբողջական պատկերը: Դուպլիկացիաներ բացահայտված են 1, 8, 10, 12 քրոմոսոմներում, դելեցիաներ՝ 3, 4, 13 և 18 քրոմոսոմներում (М. Миньженкова, 2014, М. Кибанов, 2016):

CGH մեթոդի տարատեսակներից մեկը՝ GISH-ը (Genomicin in situ Hybridization) օգտագործվում է էվոլյուցիոն հետազոտություններում տարբեր տեսակների գենոմների համեմատական հետազոտման համար: Այս դեպքում որպես զոնդեր օգտագործվում են տեսակներից մեկի գենոմի ֆիքսված հատվածները, որոնք հիբրիդացվում են երկրորդ տեսակի գենոմի հետ: Հետազոտության արդյունքները բացահայտում են համեմատվող գենոմներում կատարված փոփոխությունները՝ դելեցիաները, տրանսլոկացիաները կամ դուպլիկացիաները: 5.4.5. Միկրոմատրիցային համեմատական գենոմային հիբրիդացում (array Comparative Genomic Hybridization, aCGH) Գենոմային համեմատական հիբրիդացման մեթոդները շարունակաբար բարելավվում են և 1997 թ. Solinas-Toldo համահեղինակների հետ (Solinas-Toldo, 1997) առաջին անգամ օգտագործեցին հիբրիդացման համար առարկայական ապակին, որի վրա գտնվում էին նշադրված ԴՆԹ զոնդերը: Նմուշում in situ գտնվող քրոմոսոմների փոխարինումը ապակու հետ կապված նշադրված ԴՆԹ զոնդերով զգալիորեն բարձրացրեց հետազոտության արդյունավետությունը: Այս մեթոդը, ինչպես և մետաֆազային CGH-ը թույլ է տալիս կատարել ամբողջ գենոմի իդենտիֆիկացումը շրջանցելով բջիջների կուլտիվացման և պատրաստուկների պատրաստման փուլերը: Միկրոմատրիցային մեթոդի արդյունավետությունը պայմանավորված է ինչպես զոնդային կլոնների չափսերով և քանակով, այնպես էլ դրանց դասավորության խտությամբ: Բացի ամբողջական գենոմի հերթականություններով կազմված միկրոմատրիցաներից (Whole Genome Array) ստեղծվում են նաև տարգետային միկրոմատրիցաներ (Targeted Array), որոնցում օգտագործվում են միայն քրոմոսոմների հաճախ վերակառուցվող հատվածներին կոմպլեմենտար զոնդեր (R. Redon, 2006, Л.Г. Шаффер, 2006): Առաջին միկրոմատրիցաներում օգտագործվում էին կոսմիդների և պլազմիդների կազմում կլոնավորված 30-40 հ.զ.ն. պարունակող և ապակու վրա ամրացված ԴՆԹ-ի ֆրագմենտները: Ավելի ուշ ԴՆԹ-ի

հատվածները կլոնավորվել են (BAC)- բակտերիաների արհեստական քրոմոսոմներում և ունեցել են 75-200 հ.զ.ն. ծավալ (Д. Пинкель и др., Л.Г. Шаффер, 2006): Միկրոչիպերում զոնդերի խտության բարձրացումը թույլ տվեց բացահայտել ավելի փոքր՝ 25-100 հազ.զ.ն. չափսի քրոմոսոմային վերակառուցումները: Այժմ CGH մեթոդը և դրա տարատեսակները օգտագործվում են ինչպես քաղցկեղների ախտորոշման այնպես էլ ուռուցքների գենետիկական պատկերի ուսումնասիրման համար: Մեթոդը կիրառվում է նաև այլ գենետիկական բնագավառներում՝ գենոմների հետազոտման, հարուցիչների ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի բացահայտման, ժառանգական գենային անոմալիաների բացահայտման և այլ: Պետք է նշել, որ մեթոդի լայն հնարավորությունները առաջացնում են արդյունքների գնահատման հետ կապված անորոշություններ: Այսպես՝ քրոմոսոմներում առկա են գենոմային պոլիմորֆիզմ առաջացնող խոշոր՝ 500 հազ.զ.ն-ից մինչև 2 մլն.զ.ն-ից կազմված կրկնվող հերթականություններ (Copy Number Variations, CNVs) (W. Chen, et al., 2011): Վերջին հետազոտություններում բացահայտվել է, որ դրանց քանակը գենոմում հասնում է 38.000-ի, որը հավասար է գենոմի ծավալի 29 %: Բայց CNVs-ների լոկուսը, չափսերը, ֆունկցիաները և տարածվածությունը պոպուլյացիայում դեռ լիովին պարզաբանված չեն: Ուստի խնդիր է դրվում որոշել՝ պոլիմորֆ տարրերի որ տարբերակները պաթոլոգիաների հետ կապ չունեն, իսկ որ տարբերակները կարող են լինել պաթոլոգիայի պատճառ (J. Sebat, 2004, J.L. Freeman, et al., 2007): 5.4.6. Սինտենիա Synteny անվանումը նշանակում է՝ մեկ ժապավենի վրա և ծագում է հունական Syn՝ միասին և tainia՝ ժապավեն բառերից: Այստեղից՝ սինտենիան տարբեր քրոմոսոմների վրա որոշակի գեների նույն հաջորդականությունների առկայությունն է: Սկսած 2000-ական թվականներից սինտենիա անվանում են գեների անփոփոխ

հերթականությունների պահպանումը ընդհանուր նախնուց ստացված քրոմոսոմների կազմում: FISH մեթոդով կատարված տարբեր տեսակների գենոմների համեմատական հետազոտությունները բացահայտեցին սինտենիայի երևույթը՝ գեների նույն հաջորդականությունները տարբեր տեսակների քրոմոսոմների կազմում: Նույն հերթականությունները բացահայտվել են ինչպես մոտ տեսակների, այնպես էլ շատ հեռու տեսակների քրոմոսոմներում: Օրինակ՝ պտղաճանճի տարբեր տեսակների կարիոտիպերի համեմատությունը բացահայտեց քրոմոսոմային վերակառուցումների զգալի ազդեցությունը տեսակագոյացման պրոցեսում: Նույն գենային հաջորդականությունները բացահայտվում են տարբեր տեսակների տարբեր քրոմոսոմների տարբեր լոկուսներում (նկ. 5.18):

-a ~ : ~e~::;5teր Ծ. eրeԸta

/

/

Ծ aոaոa55a~ Ծ. ր5euմooե5Ըuրa Ծ. րeր5iոili5 D. աillistօոi Ծ. ոojaոeո5i5 --------

Նկ. 5.18. Քրոմոսոմային վերակառուցումների պատկերը պտղաճանճերի տարբեր տարատեսակների մոտ (http://fen.nsu.ru/posob/cyt/7.pdf):

Տեսակների գենոմների էվոլյուցիայի և սինտենիայի հետազոտման մեկ այլ օրինակ է ՖԻՇ մեթոդով նշադրված մարդու և մկների գենոմների համեմատական վերլուծությունը: Նույն գույնով նշված են հոմոլոգ հատվածները: Որպես հիմք վերցվել են բազմագույն SKY մեթոդով ներկված մկան քրոմոսոմները: Ապա դրանց հիման վրա ստեղծված զոնդերը հիբրիդացվել են մարդու քրոմոսոմների հետ (նկ. 5.19): Օրինակ՝ մկան 1-ին քրոմոսոմի կազմի գենային հաջորդականությունները հիմնականում բաշխված են մարդու 1-ին և 2-րդ քրոմոսոմների միջև, բայց բացահայտվում են նաև 6, 8 և 18 քրոմոսոմներում: X քրոմոսոմը երկու տեսակների մոտ ունի գրեթե նույն գենային հերթականությունները: Մարդու Y քրոմոսոմի գեները մկների մոտ չեն բացահայտվում:

կ

l!~i~II

11 12

1~ 1~ 1111

կ

i~iiii;;ա;lո 11111111111 13 1կ 15 16 17 18 19 20 21 22 X

Մա1111

Y

11 12

13 1կ 15 16 17 18 19

Մոu

X

Y

Նկ. 5.19. Մկան և մարդու գենային հերթականությունների սինտենիա: (R. Ali, et. al., 2013):

Տեսակների գենոմների համեմատական հետազոտության աշխատանքները ունեն մեծ գիտական նշանակություն և ուղղված են գենոմների էվոլյուցիայի մեխանիզմների հետազոտմանը և պարզաբանմանը: Նույն եղանակով հետազոտվում են նաև տեսակների գենոմներում նոր գեների և կարգավորիչ տարրերի առաջացման և ձևավորման ուղիներն ու աղբյուրները:

5.5. FISH ՄԵԹՈԴԻ ԲԱՐԵԼԱՎՄԱՆ ԵՎ ԶԱՐԳԱՑՄԱՆ ՈՒՂԻՆԵՐԸ

Հետազոտական FISH մեթոդը վերջին տասնամյակներում կատարելագործվել է մի քանի ուղղություններով. ստեղծվել են միկրոչիպային և ավտոմատացված տեխնոլոգիաներ, մշակվել են ազդակների գրանցման և վերլուծության նոր համակարգչային ծրագրեր, կատարելագործվել են մանրադիտակային հետազոտման մեթոդները, մշակվել են զոնդերի նոր տարատեսակներ և նշադրման նոր միջոցներ: Այսպես՝ ավտոմատացված տեխնոլոգիաների շնորհիվ կարիոտիպավորման ճշգրտության մակարդակը զգալիորեն բարձրացել է, դարձել գրեթե անթերի և հեշտ իրականացվող: FISH հետազոտությունը կատարվում է երեք հիմնական փուլերով՝ պատրաստուկների ձևավորում և մշակում, ազդակների բացահայտում և արձանագրում, ստացված արդյունքների վերլուծություն: Բոլոր նշված փուլերը կարող են ավտոմատացվել, և այժմ տարբեր ձեռնարկություններ արդեն մշակում են հետազոտության պրոցեսը ամբողջովին կամ գրեթե ամբողջովին ավտոմատացնող սարքավորումներ և ծրագրեր (նկ. 5.20): Առաջին փուլը երկարատև է՝ փորձի ամբողջ ընթացքի մոտ 90 %-ը, և կատարվում է հաջորդ փուլերից լիովին անկախ: Այս փուլը բաժանվում է մի շարք ենթափուլերի՝ նմուշի ստացում և մշակում, նշադրում, հիբրիդացում, ներկում: Այս կամ այն հաջողությամբ ներկայացվող ենթափուլերը ավտոմատացվում են: Ամբողջովին ավտոմատացումը հնարավոր է հիբրիդացման փուլի համար և կատարվում է, օրինակ, ThermoBrite կամ Leica CytoVision տիպի հիբրիդիզատորներում (նկ. 5.20): Հիբրիդիզատորի օգտագործումը արագացնում է աշխատանքի կատարման ընթացքը, միավորում բնափոխման և հիբրիդացման պրոցեսները, միաժամանակ իրականացնում որոշակի քանակի նմուշների մշակում: Սարքի օգտագործման հարմարության համար դրա աշխատանքային համակարգում նախատեսված է 5 լեզուների օգտագործման հնարավորություն, տարբեր ծրագրերի օգտագործում: Ջերմաստիճանի բարձրացման և իջեցման ֆունկցիան կատարվում է ծրագրված ռեժիմով՝ հստակ և ճշգրիտ, պահպանելով անհրա515

ժեշտ ժամանակային ռեժիմը՝ 95º և 37 ºC, 2 րոպե տևողությամբ: Սարքը կարգավորում է նաև խոնավության անհրաժեշտ մակարդակը: FISH հետազոտություններում պատրաստուկների ձևավորման ամբողջական ավտամատացման համար Abbott Molecular կազմակերպությունը մշակեց VP 2000 համակարգը, որը կատարում է հիբրիդացումը և նմուշների ապապարաֆինացումը ու ներկումը: Մեթոդը հուսալի է, ապահովում է հետազոտության ճշգրտության բարձր մակարդակը և կիրառվում է ՖԻՇԻ տարբեր տեսակների կատարման համար: Սարքը միաժամանակ կատարում է 50 պատրաստուկների մշակում: FISH մեթոդի երկրորդ և երրորդ՝ պատրաստուկների հետազոտման և ստացված արդյունքների վերլուծության փուլերը փոխկապված են՝ լրացնում են մեկը մյուսին: Այս ընթացքում կատարվում է ստացված ազդակների մանրադիտակային հետազոտում, համակարգչային գրանցում և վերլուծություն: Ստացված արդյունքները ներկայացվում են համակարգչի մոնիտորի վրա: FISH մեթոդի զարգացման և բարելավման գործում մեծ է ինչպես մանրադիտակի հնարավորությունների ընդլայնումն, այնպես էլ արդեն առկա հնարավորությունների բարելավումը: Որոշիչ նշանակություն ունեն նաև համակարգչի ծրագրերի կատարելագործումը և ստացված ազդակների մշակման նոր ծրագրերի ստեղծումը: Նշենք, որ FISH-ի օգտագործումը միկրոչիպային տեխնոլոգիաներում է բացում հնարավորություններ մեթոդի հետագա զարգացման և ախտորոշիչ բժշկական հետազոտություններում լայն կիրառման համար: Հետազոտության արդյունքների ճշգրտության մակարդակի բարձրացման հարցում մեծ նշանակություն ունեն մանրադիտակային դետեկցիայի եղանակների կատարելագործմանը ուղղված աշխատանքները: Օրինակ՝ կոնֆոկալ լազերային սկանավորող մանրադիտարկավորման՝ Confocall Aser Scanning Microscopy մեթոդի շնորհիվ ֆոնային ազդակների չեզոքացման արդյունքում նպատակային ֆլուորեսցենտ ազդակների բացահայտման մակարդակը զգալիորեն բարձրացավ:

Նկ. 5.20. FISH հետազոտությունների համար օգտագործվող սարքեր: 1 - ThermoBrite® Elite համակարգ, կատարում է պատրաստուկների ձևավորում և հիբրիդացում, 2 - Leica CytoVision ազդակների դետեկցիայի, գրանցման և վերլուծության համակարգ, 3 - կոնֆոկալ մանրադիտակ, 4 - Leica Cyto Vision ֆիրմայի սկանավորող սարք և համակարգիչ, 5 - զոնդերի հավաքածու՝ Vysis ALK Break Apart FISH Probe06N38-02320, 6 - հիբրիդիզատոր VP 2000 (https://www.rumex.ru/information/konfokalnaya-mikroskopiya-principdeystviya-primery-issledovaniya-351 , https://bioline.ru/catalog/citogenetika-ifishdiagnostika/oborudovanie-dlya-citogenetiki-i-fish-diagnostiki/priborthermobrite-elite-dlya-avtomatizacii-fish, www.vision-karyo.com):

Այսպիսով՝ բազմաթիվ ձեռնարկություններ արտադրում են FISH հետազոտությունների տարբեր փուլերի ավտոմատացված կատարման սարքավորումներ, մշակում մեթոդի հնարավորություններն ընդլայնող և ճշգրտության մակարդակը բարձրացնող բարեփոխումներ: Աշխատանքներ են տարվում մանրադիտակ-համակարգիչ համալիրների

հնարավորությունների

բարելավման

ուղղությամբ,

մշակվում

նոր

համակարգչային ծրագրեր: Դեղագործական ընկերությունների կողմից մշակվում և արտադրվում են հետազոտության կատարման համար պատրաստի ռեակտիվների և զոնդերի լրակազմեր:

5.6. FISH ՄԵԹՈԴԻ ԱՌԱՎԵԼՈՒԹՅՈՒՆՆԵՐԸ ԵՎ ԿԻՐԱՌՄԱՆ

ԲՆԱԳԱՎԱՌՆԵՐԸ

Ի տարբերություն բջջագենետիկական հետազոտությունների այլ մեթոդների՝ FISH մեթոդի կիրառումը թույլ է տալիս հետազոտել կորիզային նյութը իր տեղում, ինչպես մետաֆազի, այնպես էլ ինտերֆազի փուլերում, շրջանցելով բջիջների կուլտիվացման փուլը: Դրա շնորհիվ նվազեցվում է հետազոտության արդյունքները շեղող քրոմոսոմների կազմակառուցվածքային փոփոխությունը: Կարևոր է նաև այն հանգամանքը, որ FISH մեթոդի կիրառումը հնարավորություն է տալիս կատարել հետազոտությունը մեկ առանձին բջջի վրա, ինչի շնորհիվ կարող են բացահայտվել քրոմոսոմային անոմալիաները նույնիսկ չբազմացող ուռուցքային բջիջներում և հյուսվածքներում: Քանի որ FISH թեստում հետազոտվում է կայուն, ինտերֆազային ԴՆԹ, հետազոտությունը կարող է կատարվել տարբեր ծագում ունեցող նմուշների վրա՝ բիոպսիայի, հյուսվածքային համալիրների, քսուքների և այլն: FISH մեթոդը կիրառվում է նաև սառեցված նյութի հետազոտման համար, ինչը հնարավորություն է տալիս հետազոտել երկար ժամանակ պահված նմուշները: Դրա շնորհիվ այլ եղանակով հստակ չախտորոշվող ուռուցքների նյութը արդյունքների ճշգրտման համար հետազոտվում է նաև FISH եղանակով: FISH եղանակով բացահայտվում են ՊՇՌ-ի կամ դասական կարիոտիպավորման եղանակներով չբացահայտվող միկրոդելեցիաներն, ինչը շատ կարևոր մի շարք ժառանգական անոմալիաների ախտորոշման համար: FISH մեթոդը լայնորեն կիրառվում է ինչպես զուտ գիտական հետազոտություններում, այնպես էլ բժշկագիտությունում՝ որպես հետազոտման և ախտորոշման եղանակ: Մեթոդի տարատեսակները

կիրառվում են գենոմային հետազոտություններում, քրոմոսոմների կառուցվածքի և դրանց հատվածների կազմության և գենետիկական ֆունկցիաների ուսումնասիրություններում, օնտոգենեզի և էվոլյուցիոն պրոցեսների հետազոտման աշխատանքներում: FISH մեթոդի շնորհիվ զարգացան գենետիկայի նոր բնագավառներ՝ կորիզային արխիտեկտոնիկա, ընդհանուր և համեմատական գենոմիկա, պրոտեոմիկա: FISH ուսումնասիրության սահմաններում կարող է միաժամանակ հետազոտվել մի քանի տասնյակ գեների էքսպրեսիայի մակարդակը: Բժշկագիտությունում FISH մեթոդը կիառվում է քրոմոսոմային և գենային շեղումներով պայմանավորված ժառանգական և ուռուցքային հիվանդությունների բացահայտման ու ախտորոշման նոր մեթոդների մշակման համար: Ստեղծվում են միկրոչիպային հետազոտման էքսպրես մեթոդներ, որոնք ապահովում են հիվանդությունների արագ և ճշգրիտ ախտորոշման հնարավորություն: Մշակվում են անպտղության ախտորոշման և հաղթահարման եղանակներ: Այս մեթոդով ախտորոշվում են հարուցիչների ՆԹ-ները բջջային կորիզներում և որոնվում են վարակիչ հիվանդությունների նկատմամբ կայունության և հակվածության նշադիրներ: Այսօր արդեն FISH մեթոդը կիրառվում է նախապատվաստային, պրենատալ և հետպրենատալ շրջաններում գենետիկական շեղումների ախտորոշման համար: FISH մեթոդի տարբեր տարատեսակները ավելի լավ մասնագիտացված են որոշակի խնդիրների լուծման համար: Այսպես, օրինակ, LSI՝ լոկուս յուրահատուկ զոնդերի օգտագործումը թույլ է տալիս բացահայտել անեուպլոիդիաներ, դելեցիաներ, դուպլիկացիաներ, ինվերսիաներ և տրանսլոկացիաներ: Նույն մեթոդի օգնությամբ ճշտվում են քրոմոսոմային կտրվածքների կետերը: CEP՝ ցենտրոմեր յուրահատուկ զոնդերը օգտագործվում են անեուպլոիդիաների, տրանսլոկացիաների բացահայտման և ցենտրոմերի բնույթի՝ կազմության հետազոտման համար:

WCP՝ ամբողջական քրոմոսոմ ճանաչող զոնդերը օգտագործվում են կարիոտիպավորման արդյունքների ճշտման, տրանսլոկացիաների և ինվերսիաների բացահայտման, հետազոտվող քրոմոսոմների տեսակի որոշման և առաջացած հավելյալ ժառանգական նյութի ախտորոշման համար: Հետազոտությունը կարճատև է՝ 1-ից 3 օր, հեշտ իրականացվող և կրկնվող, բնութագրվում է ճշգրտության բարձր մակարդակով և քրոմոսոմների փոքր հատվածների հետազոտման հնարավորությամբ: Լաբորատորիաներում օգտագործվող ավտոմատացված սարքավորումները կառավարման հասկանալի և հասարակ տեխնոլոգիաների շնորհիվ հեշտությամբ են օգտագործվում: Ստացված արդյունքների վերլուծությունը համակարգչային է և չի պահանջում հետազոտողի բարձր մասնագիտական պատրաստվածություն:

ԳԼՈՒԽ 6. ՍԵԿՎԵՆԱՑՈՒՄ

Սեկվենացում անվանումը ծագել է լատինական sequentum հերթականություն բառից և նշանակում է մակրոմոլեկուլների մոնոմերային կազմի որոշում: 20-րդ դարի վերջին տասնամյակներում գենետիկական կոդի բացահայտումից հետո գիտական հետազոտությունների կարևորագույն խնդիր դարձավ մակրոմոլեկուլների՝ սպիտակուցների և ՆԹների մոնոմերային կազմի որոշումը: Արդեն 1970-ական թվականներին առաջարկվեցին ԴՆԹ-ի նուկլեոտիդային հերթականությունների որոշման երկու եղանակներ: Դրանց հեղինակներն էին ՄակսամՀիլբերտը և Սենգերը: Սեկվենացիայի մեթոդների զարգացման այս փուլն ընդունված է անվանել առաջին սերունդ: 1990-ական թվականներին մշակվեցին սեկվենացիայի տեխնոլոգիական եղանակներ, որոնք, հիմնվելով տարբեր մեթոդների վրա, պահանջում էին հետազոտության համար բազմաթիվ միանման մոլեկուլներից ստացված ազդակների վերլուծություն: Սեկվենացիայի մեթոդների զարգացման այս փուլը կոչվեց երկրորդ սերունդ: Այժմ մշակվել և օգտագործման համար արտադրվել են տեխնոլոգիաներ, որոնք ապահովում են սեկվենացիայի կատարում ընդամենը ՆԹ-ի մեկ մոլեկուլից ստացված ազդակներով: Տեխնոլոգիաների այս համալիրը՝ next-generation sequencing (NGS), որը թարգմանվում է որպես բարձր արտադրողական սեկվենացում և որոշ հեղինակների կողմից դասվում է որպես սեկվենացման մեթոդների զարգացման երրորդ սերունդ: Նոր մեթոդների ստեղծումը կապված է համակարգչային տեխնոլոգիաների զարգացման և ստացված արդյունքների վերլուծության հնարավորությունների ընդլայնման հետ: Նշենք, որ առաջարկվող մեթոդները կիրառվում են ԴՆԹ-ի մոլեկուլների հետ աշխատանքի համար, իսկ ՌՆԹ-ների հետազոտման համար առաջարկվող տեխնոլոգիաները դեռևս թերի են: Սակայն ՌՆԹ-ներից հակառակ տրանսկրիպտազի օգնությամբ ստացվող կԴՆԹ-ների հետազոտումը լիովին լուծում է այս խնդիրը:

6.1. ՄԱԿՍԱՄ-ՀԻԼԲԵՐՏԻ ՔԻՄԻԱԿԱՆ ՔԱՅՔԱՅՄԱՆ ՄԵԹՈԴ

Անցյալ դարի 70-ական թվականներին Հարվարդի համալսարանի աշխատակիցներ Ա. Մակսամը և ՈՒ. Հիլբերտը առաջարկեցին ԴՆԹ-ի կազմի ազոտային հիմքերի քայքայման սկզբունքի վրա հիմնված նուկլեոտիդների հերթականության որոշման մեթոդ: Ազոտային հիմքերը տարբեր նուկլեոտիդներում տարբեր են և քայքայվում են տարբեր նյութերով: Հետազոտության համար օգտագործվող ԴՆԹ-ի հատվածները կազմված են 100-ից մինչև 1000 նուկլեոտիդներից և ստացվում են ԴՆԹ-ների կտրտված հատվածների ֆորեգրամի թորամասերից անջատման եղանակով: Հետազոտվող հատվածի ծայրը նշադրվում է որևէ նիշով, օրինակ՝ 32P: Հեղինակները օգտագործում էին նշադրման համար այդ պահին կիրառվող ռադիոակտիվ նշադիրները: Ստացված նմուշը բաժանում էին 4 փորձանոթների և յուրաքանչյուրի պարունակությունը մշակում ազոտային հիմքերը կամ դրանց զույգերը քայքայող նյութերով: Արդյունքում ամեն մի անոթում հիդրոլիզացվում էր միայն որոշակի նուկլեոտիդ: Նյութերի խտությունները և ռեակցիայի պայմանները ընտրվում են այնպես, որ ԴՆԹ-ի ամեն շղթայի կազմում հիդրոլիզացվի միջինում մեկական նուկլեոտիդ: Արդյունքում ռեակցիոն լուծույթներում ձևավորվում էր ԴՆԹ-ի շղթաների հավաքածու, որոնցից ամեն մեկի երկարությունը պայմանավորված է տվյալ նուկլեոտիդի տեղերից մեկին ԴՆԹ նմուշում (նկ. 6.1): Օրինակ՝ ադենինի և գուանինի տեղերի որոշումը շղթայում կատարվում է դիմեթիլսուլֆատի օգնությամբ: Մշակված շղթայում գուանինը մեթիլավորվում է մոլեկուլի 3-րդ դրությունում, իսկ ադենինը՝ 7րդ: Հետագա մշակումը աղաթթվով 0 ºC պայմաններում հանգեցնում է ադենինի ապուրինիզացման, երբ շղթայի կազմից հեռացվում է մեթիլադենինը: Այդպիսի շղթան, որի որոշակի կետում նախկին ադենոնուկլեոտիդի դեզօքսիռիբոզը զրկվել է ադենինից, տաքացման արդյունքում հիդրոլիզացվում է որևէ հիմքային նյութով: Գուանինի տեղի որոշման համար մեթիլգուանինը հիդրոլիզացվում է պիպերեդինով: Թիմին և ցիտոզին նուկլեոտիդների մոդիֆի522

կացիան կատարում են հիդրազինով: Եթե ռեակցիան կատարվում է NaCl ներկայությամբ, մոդիֆիկացվում է միայն ցիտոզինը: Հիդրազինով մոդիֆիկացված շղթաների հիդրոլիզը կատարում են պիպերեդինով: 'luԹ-ti հաննj_ած 5· ~

/

lՏt.րրոոնl :A + Շ

t

ծ

կ

ՇCTACՇTA3'

/ \ ~

Շ

C

C+T

t

t

t

- -- -- --

a

aԸ

aԸTA

aԸTACՇ

Ճ

T ..Ը..g Ը:.

Շ:

C"

~

Շ:

.:::r

Շ եց ii: ..Ը:.§ Շ 5 3 Ճ ~3

.:::r~ ~

T

,5

Ը:.

~

Շ

Նկ. 6.1. ԴՆԹ-ի նուկլեոտիդային շղթայի հետազոտում Մակսամ-Հիլբերտի մեթոդով: ԴՆԹ-ի ստացված հատվածների բաժանում թորամասերի դոնդողային էլեկտրաֆորեզի եղանակով: Նուկլեոտիդների հերթականության ընթերցում ամենաթեթև թորամասից դեպի ամենածանրը (https://infopedia.su/22x948b.html):

Ռեակցիաների ավարտից հետո ստացված 4 խառնուրդները դոնդողային էլեկտրաֆորեզի միջոցով բաժանում են թորամասերի: էլեկտրաֆորեզի կատարման պայմանները ընտրվում են այնպես, որ մեկ նուկլեոտիդով տարբերվող շղթաները բաժանվեն առանձին թորա523

մասերի: Շղթաները նշադրված են ռադիոակտիվ 32P, որի շնորհիվ բացահայտվում են ռենտգենային ժապավենի վրա: Ստացված ռադիոֆորեգրամի ընթերցումը սկսվում է մեկնարկի գծից ամենահեռու կետում գտնվող ամենաթեթև թորամասից, որի կազմում առկա է կրկնապատկման պրոցեսում միացված 1-ին նուկլեոտիդը: Ընթերցումը կատարվում է մեկնարկից ամենահեռու կետից մինչև ամենամոտը՝ ճշգրիտ հերթականությամբ: Այս եղանակով մեկ ընթերցման ընթացքում հաջողվում է որոշել մինչև 200 նուկլեոտիդ: Մակսամ-Հիլբերտի մեթոդը աչքի է ընկնում նմուշների պատրաստման բարդ տեխնոլոգիայով և թունավոր նյութերի օգտագործման անհրաժեշտությամբ: Չնայած 1990-ական թվականներին նմուշների ստացման փուլը ավտոմատացվել է, մեթոդը, մնալով բարդ, հետագայում կիրառվել է սեկվենացիայի համար միայն այն դեպքերում, երբ Սենգերի մեթոդի կիրառությունը քրոմատինի յուրօրինակ կազմության պատճառով չի ապահովել ճշգրիտ ընթերցման հնարավորությունը:

6.2. ՍԵՆԳԵՐԻ ԴԻԴԵԶՕՔՍԻՆՈՒԿԼԵՈՏԻԴԱՅԻՆ ՄԵԹՈԴ

ԴՆԹ-ի նուկլեոտիդային հերթականության որոշման մեկ այլ եղանակ առաջարկել են Քեմբրիջի մոլեկուլային կենսաբանության լաբորատորիայի աշխատակիցներ Ֆ. Սենգերը և Ա. Կուլզոնը 1977 թ.: Առաջարկված մեթոդը հիմնվում էր ԴՆԹ-պոլիմերազ ֆերմենտի և ռադիոակտիվ ֆոսֆորով նշադրված նուկլեոտիդների օգտագործման վրա և կոչվում պլյուս-մինուս սեկվենացում: Երկու տարի անց Սենգերը կատարելագործեց տեխնոլոգիան և առաջարկեց դիդեզօքսինուկլեոտիդային եղանակը: Ավելի ուշ այս եղանակը ստացավ Սենգերի մեթոդ անվանումը: Հաճախ օգտագործվում են նաև ֆերմենտային կամ շղթայի ընդհատման մեթոդ անվանումները: 1980 թվականին Սենգերը և Հիլբերտը կատարված աշխատանքի համար ստացան Նոբելյան մրցանակ: Սենգերի սեկվենացման մեթոդը հիմնվում էր շղթայի պոլիմերիզացման սկզբունքի վրա: Փորձում օգտագործվում էր ԴՆԹ պոլիմե524

րազ 1 ֆերմենտը, և սկզբնական շրջանում այս մեթոդը կոչվում էր ֆերմենտային: Փորձի համար օգտագործվում են սովորական ԴՆԹեռաֆոսֆատնուկլեոտիդները (dNTP), կարճ պրայմեր և որպես մատրիցա՝ հետազոտվող միաշղթա ԴՆԹ-ն: Բացի դրանից՝ օգտագործվում են 4 նուկլեոտիդների հատուկ մոդիֆիկացիաներ, որոնց կազմից հեռացվել էր դեզօքսիռիբոզի 3՝ ծայրի-ОН: Մոդիֆիկացված նուկլեոտիդները 3՛ ծայրի –ОН խմբի բացակայության պատճառով ունակ չեն կապել հաջորդող եռանուկլեոտիդի ֆոսֆորային խումբը: Այսպիսով՝ ԴՆԹ-ի էլոնգացիան ընդհատվում է այն կետում, որտեղ շղթայի կազմ է ներգրավվում մոդիֆիկացված ապա- կամ դիդեզօքսինուկլեոտիդը (ddNTP) և կատարվում է տերմինացիա: Մոդիֆիկացված ddNTP մոնոմերները կոչվում են էլոնգացիայի տերմինատորներ (նկ. 6.2):

II

II

Uզոոա1tiu . . հt'tllQ e~ -.

I

5'

~ - P - ն - P - 0 - P - 0 - C~

I

o-

I

I

"lեզo11uյ1Qոilutոզtu1- H,,. եoա:j)ոն:j)աlil

II

I

_

o

կHH

,.

.,

HO

H

Uզոl!lայtiCI հt't6Q

II

5'

-o- P - ն- P - ն - P - ն - CH2

I o 0կ H H "Iյ11)tQ01lUյ1(յոllUեոզյ11)- H 3 , :ր I

I

եoա:j)ոն:j)աUl

-

H

ր

H

Նկ. 6.2. Նորմալ և հատուկ մոդիֆիկացված եռանուկլեոտիդների մոլեկուլային կազմությունը: Վերևում՝ նորմալ մոլեկուլ, ներքևում՝ մոդիֆիկացված: Մոդիֆիկացվող կետերը նշված են սլաքով (https://slideplayer.biz.tr/slide/13512691/):

Ռեակցիոն խառնուրդում առկա նորմալ և մոդիֆիկացված նուկլեոտիդները ԴՆԹ պոլիմերազ ֆերմենտի ազդեցությամբ հավասար հավանականությամբ ներգրավվում են սինթեզվող ԴՆԹ-ի շղթայի կազմ:

1-ին փուլ: Փորձնական խառնուրդը կազմվում է մատրիցից՝ հետազոտվող ԴՆԹ-ի միաշղթա հատվածից, ԴՆԹ-ի ծայրին գտնվող կարճ կոմպլեմենտար պրայմերից, 4 նորմալ dNTP-ից, որոնցից որևէ մեկը կրում է ռադիոակտիվ նշադիր: Միջավայրը պարունակում է Mg2+ իոններ: Պատրաստի ռեակցիոն խառնուրդը բաժանվում է 4 փորձանոթների, որոնցից յուրաքանչյուրին ավելացվում է ddNTP-ներից մեկը: Նորմալ և համապատասխան մոդիֆիկացված եռանուկլեոտիդների խտությունները ընտրվում են այնպես, որ ապհովվի մրցակցությունը ռեակցիայում: 2-րդ փուլ: Կատարվում է պոլիմերիզացում (40-50 անգամ կրկնվող ցիկլերով): Ռեակցիայի ավարտից հետո փորձանոթներում կուտակվում են ԴՆԹ-ի՝ տարբեր երկարությամբ բազմաթիվ հատվածներ: Հատվածների երկարությունը պայմանավորված է նրանով, թե սինթեզվող շղթայի որ կետում է միացել սինթեզը արգելակող մոդիֆիկացված (ddNTP) նուկլեոտիդը: Հիշեցնենք, որ նույն փորձանոթում զուգահեռաբար կատարվում են կոմպլեմենտար սինթեզի բազմահազար պրոցեսներ, և յուրաքանչյուր պրոցեսում համապատասխան լոկուսում կարող է պատահականության սկզբունքով միանալ կամ մոդիֆիկացված՝ ddNTP, կամ դրա հետ մրցակցող նորմալը: Մոդիֆիկացված նուկլոտիդը կարող է միանալ 1-ին, 2-րդ, 3-րդ և մնացած բոլոր դեպքերում, երբ կոմպլեմենտարության սկզբունքին համաձայն մատրիցայի շղթային պետք է կապվեր տվյալ նուկլեոտիդը: ddNTP-ն, միանալով շղթային, արգելակում է հետագա սինթեզը: Ուստի, փորձանոթում առաջանում են տարբեր երկարությամբ հատվածներ՝ ddNTP-ն բոլոր համապատասխան լոկուսներում բարձր հավանականությամբ ներմուծվում է մի քանի շղթաների կազմ: Սինթեզվող շղթաների 5՛ ծայրերը միանման են, քանի որ սկսվում են պրայմերից, իսկ 3՛ ծայրում գտնվում է տվյալ դեպքում միացած մոդիֆիկացված նուկլեոտիդը:

3-րդ փուլ: ՊՇՌ-ի արդյունքում առաջացած հատվածները դենատուրացվում են և ամեն փորձանոթի պարունակությունը որպես առանձին նմուշ ենթարկվում է դոնդողային էլեկտրաֆորեզի: Պոլիակրիլամիդային՝ ՊԱԱԳ դոնդողում միաշղթա ֆրագմենտները էլեկտրաֆորեզի միջոցով, իրենց երկարություններին համապատասխան, բաժանվում են թորամասերի. թեթև կարճ շղթաները արագ են շարժվում և հեռանում մեկնարկի գծից, ծանր շղթաները, հակառակը, դանդաղ են շարժվում և անցնում են կարճ ճանապարհ (նկ. 6.3): 5'

C T Շ

•

e

C T T C Շ A C A 3'

•

Հt:.L11ագոոlորi. 'H.1րթ-ti ilրiա2րi.րթա հաL11կած + 'H.1րթ Lկոtրiilեր,ագ • մATP, մCTP, մTTP, aոմ մՇTP

.ii ր

ոարitiոա~l11րiկ Uյորթոi.t ն2արiր,կած Lկրlայilեր,

կ [ոLծոtյրUերlրl Lկաl11[1աUL11ոLU

~

ԻddՃTՔ ԻddՇTՔ ԻddTTՔ Իdd6TՔ

e

~ ~~ I

t 1t~որ,ո:)lոր,tl.. , նարitոգր,ա:)ltiա

Է)

Շ u~~րեզՀյա6~ ,(եlllազոlllՀյո,i; 21'\Բայ~ T 1Պ\?այ~ Ճ ~ազoo ~ ~ազoո ~

A

T

Շ

Շ

·

Նկ. 6.3. Սենգերի մեթոդով սեկվենացման պրոցեսի սխեման. ddNTP - մոդիֆիկացված 2՛ դեզօքսինուկլեոտիդ 5՛ եռաֆոսֆատ, dNTP - նորմալ 2՛ դեզօքսինուկլեոտիդ 5՛ եռաֆոսֆատ, ddATP - ադենինիեռաֆոսֆատ, ddTTP - թիմինիեռաֆոսֆատ, ddGTP - գուանինիեռաֆոսֆատ, ddCTP - ցիտոզինիեռաֆոսֆատ: (https://slideplayer.com/slide/13216852/, փոփոխված):

Էլեկտրաֆորեզի ավարտից հետո դոնդողը նկարում են ռադիոակտիվ ժապավենի վրա և 1-2 օր անց արդեն հնարավոր է ընթերցել հետազոտվող հատվածների նուկլեոտիդային հերթականությունը: 4-րդ փուլ: Ընթերցումը սկսվում է Ֆորեգրամի ծայրում գտնվող ամենակարճ հատվածի ծայրային նուկլեոտիդից և շարունակվում դեպի հակառակ ծայրի ամենաերկարը: Հիշեցնենք, որ նոր սինթեզված ընթերցվող շղթան կոմլպեմենտար է հետազոտվող շղթային, և սահմանափակող մոդիֆիկացված նուկլեոտիդը կոմպլեմենտար է քննվող շղթայի համապատասխան նուկլեոտիդին, ուրեմն ընթերցման ժամանակ ddATP-ի առկայությունը համապատասխանում է հետազոտվող շղթայի թիմինին, իսկ ddGTP-ը՝ ցիտոզինին, և հակառակը: Նուկլեոտիդները նշված են կոմպլեմենտար շղթայի 5՛-ից 3՛ ուղղությամբ: Այս եղանակով արդեն որոշվել է մի շարք պրո- և էուկարիոտների գենոմների նուկլեոտիդային կազմը՝ խմորասնկերի (1996), արաբիդոպսիսի (1998), մարդու (2000) և այլն: Տարբեր տեսակների գենոմների հետազոտությունները շարունակվում են: Սենգերի մեթոդով կատարված հետազոտություններում հայտնաբերվել են գենային մուտացիաները և բացահայտվել են ժառանգական հիվանդություններ առաջացնող դրդապատճառները: Այս մեթոդը ապահովում է տանդեմային կարճ կրկնողությունների հայտնաբերումը և առանձին գեների նուկլեոտիդային կազմի ուսումնասիրությունը: Միակ, կարևոր թերությունը հետազոտության երկարատևությունն է, որը պայմանավորված է ամեն մի հետազոտության ընթացքում ընդամենը մոտ 1000 նուկլեոտիդներից կազմված շղթայի ընթերցմամբ: 6.2.1. Ավտոմատացված ԴՆԹ-սեկվենացում՝ Automated DNA Sequencing 1986 թ. Հուդը աշխատակիցների հետ միասին առաջարկեցին նշադրման համար օգտագործել ֆլուորեսցենտ ներկանյութեր և կատարելագործեցին Սենգերի մեթոդը: Առաջարկված բարելավման արդյունքում օգտագործվող պրայմերները բաժանվում էին 4 մասերի,

և ամեն մեկը նշվում էր յուրահատուկ ներկանյութով: Ապա մոդիֆիկացված ddNTP-ները բաժանվում էին 4 փորձանոթներում այնպես, որ ամեն մեկին համապատասխանի սպեցիֆիկ նշադրված պրայմեր: Սկսած 1990-ական թվականներից ֆլուորեսցենտ նիշերը արդեն կապում էին մոդիֆիկացված նուկլեոտիդների հետ՝ յուրաքանչյուրին որոշակի գույնի, և պոլիմերիզացման ռեակցիայի համար չէին պահանջվում առանձին փորձանոթներ: Բազմագույն ֆլուորոֆորների օգտագործման շնորհիվ հետազոտության կատարման կարգը դարձել է ավելի հասարակ և պրոցեսի ավտոմատացման հնարավորությունները ընդլայնվել են: 1993 թ. Բ.Լ. Կարգերը առաջարկեց դոնդողային էլեկտրաֆորեզը փոխարինել կաթիլայինով, և մշակվեցին նոր դոնդողատիպ նյութեր, որոնց օգտագործումը ապահովեց հետազոտության ավելի արագ և ճշգրիտ կատարում: Դիքլորռոդամինի հիման վրա ստեղծվել են լույս արձակող 4 գույնի ներկանյութեր: Դրանց ճառագայթման մակարդակներն են՝ 544, 569, 597 և 622 տց: Սպեկտրոֆոտոմետրը հեշտությամբ տարբերակում է համապատասխան ազդակները: Ֆլուորոֆորները օգտագործվում են որպես նշադիր՝ առանձին ddNTP-ների համար (նկ. 6.4): ՒՃM

~աUյոLյIIl

ROX ~ա 11oti11

յOE ~աՇiաi

~

Ը,

Նկ. 6.4. Մոդիֆիկացված նուկլեոտիդների նշադրման համար օգտագործվող ֆլուորոֆորները (https://ppt-online.org/304231):

Ամեն մի ddNTP կապվում է որոշակի գույնի ֆլուորոֆորի հետ, և, որպես արդյունք, էլեկտրաֆորեզի պրոցեսում դոնդողի վրա առաջացող բծերը ստանում են համապատասխան գունավորում: Բիծը կազմված է ԴՆԹ-ի հատվածների համախմբից, և դրան համաձայն նուկլեոտիդների խտությունները դրա կազմում բաշխվում են նորմալ բաշխման ձևով՝

միջին մասում հատվածների խտությունը բարձր է, իսկ սահմանային մասերում՝ ցածր, ուստի գրաֆիկը պարաբոլիկ է: Գրաֆիկի վրա հարևան պարաբոլների հիմքերը համընկնում են, և դրանց գույները խառնվում, բայց գագաթի հատվածում դրանք լիովին առանձին են՝ ցայտուն: Նուկլեոտիդային հերթականության համարները որոշվում են գրաֆիկի գագաթների համարներով, իսկ նուկլեոտիդի ինչ լինելը՝ գունային նիշով (նկ. 6.5): Պրայմերի հատվածի դետեկցիայից խուսափելու նպատակով հետազոտվող շղթայի 1-ին նուկլեոտիդին միացվում է կարճ երկշղթա հատված: Զույգ շղթայի ազատ ծայրը օգտագործվում է որպես պրայմեր: Այս դեպքում կրկնապատկումը սկսվում է հետազոտվող շղթայի սկզբնակետից և կրկնապատկվում է միայն նպատակային շղթան: 1'ff:!.~ր.e ր ~'l!Cl.'կt.'C~ lն H

~ ո . ; a : : ~ ~~ • • •

~ ~ , o Ը : ~ ր շ , յ C ' C ' ր '~ ~ յ e~ 6I 'յl թ, • U I

յ.a

Նկ. 6.5. Ավտոմատ սեկվենացման արդյունքում ստացված գունավոր պատկերով որոշվում է ինչպես նուկլեոտիդի համարը ԴՆԹ-ի շղթայում, այնպես էլ դրա տեսակը. A - ադենին (կանաչ), T - թիմին (կարմիր), G - գուանին (կապույտ), C - ցիտոզին (սև) (https://present5.com/seminar-medicinskaya-genetika-farmaciya-kurs-3ciop-medicina/):

Ժամանակակից ավտոմատ սեկվենատորները ռեակցիայում ստացված հատվածների ամբողջ ծավալը անցկացնում են դոնդող պա530

րունակող շատ բարակ (ներքին տրամագիծը՝ 50 մկմ) մազանոթներով այնպես, որ հատվածները դասավորվում են մեկը մյուսից հետո հերթականությամբ՝ ամենակարճից մինչև ամենաերկարը: Ամեն հաջորդ խումբ տարբերվում է նախորդից միայն մեկ նուկլեոտիդով: Մազանոթից դուրս եկող ամեն մի նուկլեոտիդ լուսավորվում է լազերով և իր հերթին լույս արձակում: Համակարգիչը դետեկտորի միջոցով ստացված ազդակը գրանցում է ըստ արձակված լույսի տեսակի և շղթայում գրաված տեղի: Այսպիսով՝ գրանցվում է նուկլեոտիդների հերթականությունը, այլ կերպ ասած՝ նուկլեոտիդներից կազմված տեքստի տառաշարը: Ներկայացվող մեթոդը ստացել է «կաթիլային» անվանումը: Ամբողջ պրոցեսը իրականացվում է հատուկ ավտոմատացված սեկվենատորներում (նկ. 6.6): ոtաlրոtրո ն tնարiնորit1 '1l[1այUG[l

.......""'"'"""" /

'l\..յրթ-ր 2'llՀյաUերlր րաԸtանոil ilագանոiթայրO ttt.Ltորա:jրորեգր t.րiանաLtո.[

Uաորրցա

ddTTP . .

- - - - - 1 :ե:~: :

ddՇTP ...

, '1ո ն11ո11ո.[ ilագանոiթ

'1lրայilերր t.րiLtարiացոil LրllՀյայԲ [1Ut1հաոոil ! iiiiilili Ք '

lագt:եր

Շ\եո

ոորi

! i i i l i i l i i i l 3'

5 ;;1111111 11 13 5 ;;:;;111 11 11 1 3"

տ 1,,111111 1111 , r

~

3'

~: I I I I I I I I I I I I I I I ' l'

,...................,.,.'l"I"...."' ' ,._..,.....,.....,.,.'l"I"..........,

կ

:եtոորո:jրորնt:երր 11t.ոt.Ltցրա, ագ11աLtներր հաilաLtարlQ/.այԲLI L[երitոծոiթiոն

!1րոilաոոգրաil

Նկ. 6.6. Ավտոմատացված սեկվենատորներում ԴՆԹ-ի ընթերցման պրոցեսը, որն ընթանում է նկարի վրա թվերով նշված 4 փուլերով: 3-րդ փուլում ստացված ֆլուորեսցենտ ազդակների գրանցումը և դրանց վերլուծությունը կատարվում է հատուկ համակարգչային ծրագրերով (https://pptonline.org/300813):

Հատուկ համակարգչային ծրագիրը գրանցում է դետեկտորով ֆիքսված լուսային ազդակները քրոմատոգրամի ձևով: Ստացված գրաֆիկների գագաթները համապատասխանում են հերթական նուկլեոտիդին և ընթերցվում են համակարգչով: Ժամանակակից սեկվենատորները կարող են մեկ ընթերցման (ռիդ) ընթացքում կարդալ 8001000 նուկլոտիդից կազմված շղթայի կազմը: Սենգերի մեթոդով սեկվենացման փորձի արդյունքների գրանցման և վերլուծության համար մշակվել են մի շարք համակարգչային ծրագրեր. 1. ABIPrizm® SequencingAnalysisSoftware 2. Sequence Scanner. ազատ օգտագործվող Applied Biosystems (www.appliedbiosystems.com) 3. Chromas v. 2.01. ազատ օգտագործվող (www.technelysium.com.au) 4. Chromas - հին ծրագիր, ազատ օգտագործվող 5. SeqScape - Applied Biosystems-ի կոմերցիոն ծրագիր Ավտոմատ սեկվենատորների միջոցով ԴՆԹ-ի հերթականությունների ճշգրիտ որոշման հնարավորությունը օգտագործվեց գիտական մեծ նշանակություն ունեցող մարդու գենոմի ընթերցմանն ուղղված Human Genome Project (HGP) կատարման համար: Ծրագրին մասնակցում էին ողջ աշխարհի բազմաթիվ լաբորատորիաներ: Նախագիծը նախաձեռնվեց 1990-ականների սկզբին, և 2001 թ. Nature ամսագրում հրապարակվեց դրա ավարտի մասին: Բայց ստացված արդյունքների վերջնական ամփոփումը պահանջեց ևս մի քանի տարի (Nature, 2001):

Նկ. 6.7. Ավտոմատ սեկվենատոր՝ ABI 3130xl, Applied Biosystems (https://ppt-online.org/300813):

Մարդու գենոմի նուկլեոտիդային կազմի ընթերցման համար մշակվեց հատուկ հետազոտական ծրագիր: Սկզբում ամբողջ գենոմը բաժանել են 150 000 զ.ն-ից կազմված հատվածների և տեղադրել (BAC) տիպի արհեստական քրոմոսոմների կազմ: Ընդ որում՝ տեղադրվող ամեն մի հատվածի տեղը մայր քրոմոսոմում որոշվել է նախապես: Ստացված ռեկոմբինանտ BAC քրոմոսոմները գրանցվել են որպես որոշակի քրոմոսոմի հատուկ հատված: Ապա այդ հատվածները սեկվենացվել են (shotgunsequencing) կտրտման եղանակով՝ ամեն BAC քրոմոսոմում գտնվող հատվածը բաժանելով ավելի կարճ՝ 3000ից մինչև 2000 զ.ն. կազմված մասերի: Ստացված հատվածները ներմուծվել են բակտերիալ վեկտորի կազմ, և Սենգերի մեթոդով որոշվել է դրա նուկլեոտիդային հերթականությունը: Քանի որ բաժանումը հատվածների կատարվել է պատահական եղանակով, դրանց ծայրերը միշտ չէ, որ համընկնում էին, և հաճախ առաջանում էին վերածածկվող հատվածներ, որի շնորհիվ հաջողվում էր առանձին հատվածներից հավաքել BAC քրոմոսոմում ինտեգրված հատվածի ամբողջական հերթականությունը: Հաջորդ փուլում բոլոր BAC քրոմոսոմներում առկա հատվածներից նույն եղանակով վերականգնվում է ամբողջ քրոմոսոմի նուկլեոտիդային հերթականությունը: 6.3. ԲԱՐՁՐԱՐՏԱԴՐՈՂԱԿԱՆ ՍԵԿՎԵՆԱՑՈՒՄ (New Generation Sequencing, NGS) NGS սեկվենացումը մեթոդների խումբ է, որը հիմնվում է միաժամանակ բազմաթիվ՝ մինչև մի քանի միլիարդ շղթաների սեկվենացման սկզբունքի վրա: Մեթոդների կատարման փուլերը մի փոքր տարբերվում են ամեն տեխնոլոգիայի համար, բայց սկզբունքորեն կարող են միավորվել հետևյալ սխեմայով. 1. Գրադարանների՝ մատրիցների նախապատրաստում. ա) ԴՆԹ-ների կամ ՌՆԹ-ների անջատում, բ) շղթաների բաժանում բազմաթիվ հատվածների ՈՒՄ ճառագայթներով կամ ֆերմենտներով,

գ) շղթաների վերակառուցում փորձի պայմաններին համապատասխան, դ) մոլեկուլային կլաստերների ձևավորում: 2. Սեկվենացում. ա) սեկվենացում սինթեզի եղանակով: Միաժամանակ կատարվող միլիարդավոր սինթեզի պրոցեսների կատարում և կարճ շղթաների ռիդերի ստացում: Պրոցեսում կիրառվում են ԴՆԹ-պոլիմերազ ֆերմենտը, պրայմերներ նոր շղթայի սինթեզի համար և նշադրված նուկլեոտիդները: Պրոցեսը կրկնվում է ցիկլերով և դետեկտավորվում: բ) Սեկվենացում լիգավորման՝ լիգազ ֆերմենտի օգտագործման եղանակով: Լիգավորման միջոցով կոմպլեմենտար շղթայի կառուցում և դետեկցիա: գ) Սեկվենացում նանոծակոտիների օգտագործմամբ: Դետեկցիայի հիմքում ընկած է նանոծակոտիով անցնող իոնային հոսանքի չափումը մեմբրանի վրա լարման հաղորդման պահին: 3. Տվյալների վերլուծություն՝ կենսաինֆորմատիկա. ա) ռիդերի ֆիլտրում, բ) ռիդերի հավաքագրում, համադրում իմաստային հերթականության ձևավորում, գ) խտացված արդյունքների կենսաբանական նշանակության բացահայտում: Այժմ ներկայացնենք անդրադառնանք NGS տեխնոլոգիաների ներկայացմանը:

6.4. ՀԻԲՐԻԴԱՑՈՒՄ ՊԻՆԴ ՄԱԿԵՐԵՍԻ ՎՐԱ՝ ԴՆԹ-Ի ՇՂԹԱՆԵՐԻ

ԿՈՄՊԼԵՄԵՆՏԱՐՈՒԹՅԱՆ ՍԿԶԲՈՒՆՔԸ

1980-ական թվականների վերջում առաջարկվեց ԴՆԹ-ի նուկլեոտիդային հերթականության որոշման նոր մեթոդ, որը ստացավ սեկվենացում հիբրիդացման միջոցով անվանումը՝ (sequencing by hybridization, SBH) կամ հիբրիդացում չիպի վրա (R.M. Idury, M. S. Waterman 1995, П.А. Певзнер, М.Ю. Бородовский и А.А. Миронов, 1989): Այս մեթոդի համաձայն՝ ԴՆԹ շղթաների նուկլեոտիդային կազմը որոշվում է դրա կարճ հատվածների հիբրիդացման միջոցով: Որպես հիբրիդացման թիրախ օգտագործվում են պինդ մակերեսի վրա կետային եղանակով որոշակի հերթականությամբ ամրացված, հայտնի կազմ և երկարություն ունեցող արհեստական օլիգոնուկլեոտիդները: Ընդ որում՝ պինդ մակերեսի վրա առկա են տվյալ երկարություն ունեցող արհեստական օլիգոնուկլեոտիդների բոլոր հնարավոր տարբերակները: Օրինակ՝ 8 նուկլեոտիդներից կարող են կազմվել 48 տարբերակներ՝ 65 536: Ռեակցիայի պայմաններն ընտրվում են այնպես, որ հիբրիդացվեն միայն լրիվ կոմպլեմենտար շղթաները: Այսպիսով՝ ռեակցիայի ավարտից հետո չփոխազդած հատվածները հեռացնելուց հետո փոխազդած հատվածներից, համադրելով վերածածկվող ծայրերը, կարող է վերականգնվել ԴՆԹ-ի հետազոտվող հատվածի նուկլեոտիդային կազմը (նկ. 6.8):

I

'1նԹ-t, հան,'-lածt, հեր,13ականոiթiան tորiոշոնo կոՇIյոգացկած 0կն,աilեր,ներ,ոկ 3'- G ՇՇՇ ՃՇ G Շ - 5' 3'- ՇՇՇ ՃՇ G ՇT - 5' 3'- ՇՇ ՃՇ G ՇT Ճ - 5' 3 '- ՇՃ ՇG ՇT ՃՇ - 5' 3'- Ճ Շ G Շ TՃՇ Ճ - 5' 3 '- Շ G ՇT ՃՇ ՃG - 5'

I

t

0կն,աilեր, 0կն,աilեր, 0կն,աilեր, 0կն,աilեր, 0կն,աilեր, 0կն,աilեր,

կ ծ

Oկն,աilեր,ներ,t, հաilարiր,ոil L. կոնն,t,գներ,t, Հ'.IL.ա'-lորiոil

3'· ... GՇՇՇՃՇGՇTՃՇՃG ... · 5'

Նկ. 6.8. Պինդ մակերեսի վրա հիբրիդացման եղանակի սխեման (https://propionix.ru/f/ngs_vysokoproizvoditelnoe_sekvenirovanie.pdf, փոփոխված):

Առանձին հատվածներից հավաքված հերթականությունները կոչվում են կոնտիգներ: Դրանց ձևավորումը, ինչպես երևում է նկարից, կատարվում է մեկական նուկլեոտիդով տարբերվող հատվածների համադրման և հետազոտվող ԴՆԹ-ի շղթայի նուկլեոտիդային հերթականության վերականգնման եղանակով: Ներկայացվող մեթոդի կարևորագույն թերությունն այն է, որ գործնականում անհնար է ստեղծել պայմաններ միայն լիովին համընկնող հերթականությունների հիբրիդացման համար: Շղթայի կազմում միշտ հանդիպում են GC կրկնվող և ամուր կապվող հատվածներ, որոնց առկայությունը առաջացնում է մասամբ կոմպլեմենտար շղթաների կոնյուգացում: Սակայն վերածածկվող հատվածների համադրման և դրանց օգտագործմամբ հատվածների հերթականության վերականգնման մեթոդը հուսալի է և լայնորեն օգտագործվում է գենոմային NGS հետազոտություններում: Այժմ այս մեթոդը կիրառվում է Affymetrix և Perlegen կազմակերպություններում արտադրվող սարքավորումների աշխատանքում:

6.5. ՍԵԿՎԵՆԱՑՈՒՄ ԼԻԳԱՎՈՐՄԱՆ ԵՂԱՆԱԿՈՎ

1990-ական թվականների սկզբում ԱՄՆ-ի Lynx Therapeutics ֆիրման առաջարկեց յուրահատուկ նշադրված հատվածների մասսայական զուգահեռ սեկվենացման մեթոդ (massively parallel signature sequencing – MPSS): Մեթոդը իրականացվում էր նշադրված զոնդերի լիգավորման եղանակով միացման և, ապա, նշադրող մասի հեռացման և դետեկցիայի եղանակով: Այսինքն՝ սկզբում կոմպլեմենտար զոնդը կապվում էր պրայմերի ծայրին և միացվում լիգազ ֆերմենտի ազդեցությամբ, ապա զոնդի նշադրող հատվածը անջատվում էր էնդոնուկլեազային ռեստրիկտազով: Բայց այս տեխնոլոգիայով հաջողվում էր ընթերցել ընդամենը 20-25 նուկլեոտիդ, և մեթոդը լայն կիրառություն չգտավ: SOLiD (sequencing by oligonucleotide ligation and detection - սեկվենացում օլիգոնուկլեոտիդների լիգավորման և դետեկցիայի եղանա536

կով) տեխնոլոգիան առաջարկել են ԱՄՆ-ի Հարվարդի Համալսարանի գիտնականները, և այժմ այդ տեխնոլոգիան Thermo Fisher Scientific ֆիրմայի սեփականությունն է: Ներկայացվող տեխնոլոգիան առաջարկում է սեկվենացումը կատարել լիգավորման եղանակով՝ առանց ԴՆԹ-պոլիմերազ ֆերմենտի օգտագործման: Լիգազ ֆերմենտի օգտագործման շնորհիվ հետազոտվող շղթան կարող է ընթերցվել երկու ուղղություններով, ինչը ընդլայնում է հետազոտության հնարավորությունները: Ինչպես հայտարարել են տեխնոլոգիայի հեղինակները, մեթոդի կիրառությունը ապահովում է սեկվենավորման ճշգրտության 99.94 % մակարդակ: ABI/SOLiD տեխնոլոգիայով կատարվող ամեն ընթերցման՝ ռիդի ծավալը հավասար է 25-35 նուկլեոտիդ և ամեն մի ԴՆԹ-ի սեկվենացման համար կատարվում են մինչև մի քանի միլիոն ընթերցումներ: Այս տեխնոլոգիայով աշխատող ավտոմատ սեկվենատորները ստեղծվել են 2007 թ., իսկ դրանց արտադրությունը սկսվել է 2016-ից: Հետազոտության համար նախապատրաստվում են շղթաների կլոնային գրադարաններ: Հետազոտվող հատվածի կամ գենոմի գրադարանի ստեղծման համար հետազոտվող ԴՆԹ հատվածը կտրտման եղանակով բաժանվում է բազմաթիվ, տարբեր երկարությամբ և կազմով հատվածների: Ապա հատվածները ֆիքսվում են յուրահատուկ եղանակով՝ կապվում որոշակի գնդի կամ պինդ մակերեսի որոշակի կետում ամրացված պրայմերների հետ: Հետազոտության կատարման համար անհրաժեշտ է ստանալ նույն հատվածի բազմաքանակ՝ միլիոնավոր պատճեններ: Քանի որ մեկ մոլեկուլի ընթերցման արդյունքում արձակվող ազդակը թույլ է և չի գրանցվում դետեկցիայի սարքերով, ազդակների ինտենսիվությունը բարձրացնելու համար անհրաժեշտ են մեծ թվով նույն ազդակը արձակող մոլեկուլներ: Նշված խնդիրը լուծվում է երկու հիմնական տեխնոլոգիաներով՝ կամրջակային ՊՇՌ և էմուլսիոն ՊՇՌ (բաժին 6.4.1, 6.5): Հետազոտության սկզբում պատրաստվում են հատուկ նշադրված զոնդեր: Չնայած այս դեպքում զոնդերի նշադրման համար օգտագործվում են 4 ֆլուորոֆորներ, 8 նուկլեոտիդներից կազմված

զոնդի միայն առաջին երկուսն են նշադրվում նիշով, մնացած 6-ը այս փուլում մնում են անտարբեր և չեն ընթերցվում: Չորս նուկլեոտիդներից կարող են ստեղծվել զույգ խմբերի 16 տարբերակներ, բայց նշադրման համար օգտագործվում են միայն 4 ֆլուորոֆորներ, և այս դեպքում նշադրման համար կատարվում է նուկլեոտիդային զույգերի խմբավորում: Նուկլեոտիդների խմբավորումը զույգերով պատահական չէ և կատարվում է գունային տարածքների սկզբունքով: Խմբում միավորվում են, օրինակ, AG, և հակառակ դասավորված՝ GA նուկլեոտիդները կամ ալտերնատիվ՝ CT և TC զույգերը (նկ. 6.9Ա): Հեlllազոո.լորi լոlոշ Ulllաgl(աo A

A Շ

T

Շ

T

••• ••• ••• •••

.

'l-'

5'ՃՇ6ՃՃ3'

Ulllաgl(աo ազ~ա uեflլl

~ա. t;i

.ե:,

""

ՃՇ ՇՃ GT

i:i::,

TG

E-

ՃT ՇG GՇ TՃ

Ճ6 ՃՃ ՇT GՃ GG TՇ TT

ԸԸ

~

Հuարiաlլորi .;:, ll1աf1րl;f1ակUեf1 ր

5'ՃՇ6ՃՃ3'

Տ'ՇՃTՇՇ3'

H ill

ՃT Ճ6 ՇG ՇT GՇ 6Ճ TՃ TՇ

ՃՃ ՇՇ GG TT

ՃՃ ՇՇ GG TT

!tit Հuարiաlլորi

2-M

!tit

lllաf1րեf1ակut; Q

5'ՃՇ6ՃՃ3

5'ՀITAՇՇ3'

ՏՊTGՇTT3'

Նկ. 6.9. Դետեկցիայի արդյունքում ստացված գունային ազդակները առաջին փուլում կարող են ընթերցվել տարբեր եղանակներով: Երկրորդ փուլում, երբ դետեկցիան կատարվում է մեկ նուկլեոտիդով շեղված լոկուսում, արդեն հնարավոր է բացահայտել հետազոտվող զույգի ճշգրիտ կազմը (J.A. Garrido-Cardenas, F. Garcia-Maroto, J.A. Alvarez-Bermejo, F. Manzano-Agugliaro, 2017, փոփոխված):

Փորձենք ընթերցել երկու ցիկլերում ստացված դետեկցիայի արդյունքները: Առաջին հետազոտության արդյունքում ստացված գունային ազդակներով կարող են ընթերցվել 4 հնարավոր տարբերակներ: Երկրորդ ցիկլում ստացված ազդակների համադրումը առաջինի հետ հնարավորություն է տալիս ընտրել միակ ճշգրիտ հերթականությունը: Սովորաբար բազմաթիվ ցիկլերում ստացված արդյունքների համադրումը կատարում է համակարգիչը:

Հետազոտությունը կատարվում է բազմաթիվ կրկնվող ցիկլերով, որոնցից ամեն մեկը կազմված է 4 փուլերից: Նախօրոք, պինդ հիմքի վրա որևէ եղանակով, օրինակ՝ էմուլսիոն ՊՇՌ-ի, ստեղծվում է ԴՆԹ-ի միաշղթա հատվածների կլոնային գրադարան: Ապա շղթաների ծայրում գտնվող և հիմքի հետ կապող ադապտերին միացվում է ո-նշվող պրայմեր: Առաջին փուլում ռեակցիոն խառնուրդին ավելացվում են 4 ֆլուորեսցենտ նիշերով նշադրված 16 մոդիֆիկացված և առնվազն 8 նուկլեոտիդներից կազմված զոնդեր: Զոնդի նուկլեոտիդների առաջին զույգը նշադրված է: Հետազոտվող շղթայի առաջին 5 նուկլեոտիդներին լիովին կոմպլեմենտար նշադրված զոնդի առաջին երկու նուկլեոտիդը կապվում են դրան ո և ո+1 լոկուսներում: 8 օլիգոնուկլեոտիդներից կազմված զոնդի կազմը նշվում է հետևյալ եղանակով՝ XYNNNZZZ-F-5', որոնցից XY՝ թիրախ, հետազոտվող նուկլեոտիդներից կազմված զույգն է, NNN՝ փոփոխվող անտարբեր նուկլեոտիդները, ZZZ՝ ունիվերսալ հիմքեր են և F-ը՝ նուկլեոտիդների զույգը նշող ֆլուորոֆորը: ԴՆԹ-ի շղթայի առաջին չզուգավորված նուկլեոտիդների զույքը կապվում է համապատասխան զոնդի նուկլեոտիդների առաջին զույքի հետ, մնացած նուկլեոտիդները կարող են լինել ոչ կոմպլեմենտար և չառաջացնեն կապ մատրիցի հետ: Ապա լիգազը կարում է առաջին, կոմպլեմենտար կապված նուկլեոտիդը պրայմերի ազատ ծայրի նուկլեոտիդին (նկ. 6.10Ա): Կապված զոնդի նշադիրը արձակում է դետեկտավորվող ազդակ, և, ապա զոնդի վերջին 3՝ NNN՝ նուկլեոտիդների հետ միասին հեռացվում (նկ. 6.10Բ): Լիգավորվող հատվածի առաջին երկու նուկլեոտիդները համապատասխանում են արձակվող ազդակին, բայց մնում չընթերցված (H. Li, N. Homer, 2010): Հաջորդ փուլում (նկ. 6.10Գ) կատարվում է մեկ այլ զոնդի 2 նուկլեոտիդների կոմպլեմենտար միացում մատրիցային շղթայի վրա առաջին 5 նուկլեոտիդներից հետո գտնվող 6-րդ և 7-րդ նուկլեոտիդների հետ: Լիգազը կարում է նոր զոնդի առաջին՝ 1-ին նուկլեոտիդը նախորդ զոնդից մնացած 5-րդ նուկլեոտիդի ծայրին: Կատարվում է ֆլուո539

րոֆորի դետեկցիա, ապա զոնդի երեք վերջին NNN ունիվերսալ նուկլեոտիդների և ֆլուորոֆորի անջատում: Նույն եղանակով հետագա ենթափուլերի ընթացքում կատարվում է ամեն 5-րդ նուկլեոտիդի որոշումը (նկ. 6.10Դ): Այսինքն՝ առաջին փուլում որոշվում են 1 և 2, հաջորդում 6 և 7, ապա 11 և 12, հետո 16 և 17, և այսպես մինչև ԴՆԹ-ի հատվածի ծայրը:

.A

G T

=Ը:,

Շ

Ը:,

G E-

T

Ըր

= .ե::, t~ո1u~ոu ~աfo~l

!

u

l~զազ t,

,, O

~

•·~; .~~tl•եt • ~••••••• All I 111111111 I 111111 I I II II 1111111111 ,. TA P1 աf\աLկU1եր Uաlilր~gա .(աlյlQIU

+

ր

"lրայtlեր ո ս ~ , .I ii I I ii I ii I I I I I Ii ii I • Բ ,. II 111 I 111111 If I 11111 I 111111 I 11111 I I I ,. P 1 աf\աLկU1եր ս Uաlilր~gա

.,

l.lտ)as.

Q

,օ

•. "lրայtlեր ո AT TT '" I iii I iii ii Ii I 11 11 11 I I ii i ii iii .I 11111111 I II II 111 II I 11111111111111 I ,. TՃ ՃՃ P 1 աf\աLկU1եր Uաlilր~gա "lրայtlեր ո

AT

ո

OT

TT

c•

օc

, .I ii հ ii ii I ii I I ii ii I I I ii ii I վ II I ii I I ii I ii I I I I ii ii I I I

P 1 աf\աLկU1եր •·

ե

I I

'fl'' '11" 111111~!111!1' "յ!'"յA' I, ,.

"lրայtlեր ո- 1 ••

Uաlilր~gա

cT.... ,.,

iiiiiiiiiiiiiii iiil ll liililll ; ill I !~II 111111 I I 11111111111 II I 11111

P1 աf\աLկU1եր

t t

3,

Uաlilր~gա

9-ո 011~ ե17~17ո1711 11եոե~g~ա

Նկ. 6.10. Սեկվենացում լիգավորման եղանակով: Փուլերը ներկայացվում են SOLiD տեխնոլոգիայի օրինակով (J.A. Garrido-Cardenas, F. Garcia-Maroto, J.A. Alvarez-Bermejo, F. Manzano-Agugliaro, 2017):

Փորձի կատարման 2-րդ ցիկլում հին պրայմերը սինթեզված շղթայի հետ միասին հեռացվում են, և ռեակցիոն խառնուրդ են ներմուծվում նոր, մեկ նուկլեոտիդով շեղված ո+1 պրայմերի պատճեններ: Այդ պատճառով երկրորդ փուլի ենթափուլերում որոշվում են հետազոտվող շղթայի 2 և 3, 7 և 8, 12 և 13, 17 և 18-րդ և այս շարքի այլ նուկլեոտիդները: Ամեն փուլում, ի հաշիվ պրայմերի երկարացման, ո+2, ո+3 և այլն, 5 ենթափուլերի ընթացքում սեկվենավորվում են թիրախ, սովորաբար 75 նուկլեոտիդներից կազմված ԴՆԹ-ի բոլոր նուկլեոտիդները (նկ. 6.11): Սեկվենացման լիգազային եղանակի ճշգրտության աստիճանը շատ բարձր է՝ 99,99 %: Բարձր է նաև սեկվենացման արագությունը: [!Uրերiցնան նl.iգրնաl.iեն, ոtնtկt11ն, U1ր1այOt11 ո ոtնեL[t[lU. U1րlայUերl ո+1 ոtնtL[ե[1U, U1րlայUերl ո+2 ոtնtL[tրiն, U1ր1այUերl ո+3

I

ո

Ւ

I ո+l

ո+2

I ո+3 I ո+կ I ո+Տ I ո+ծ I

Ւ

ոF

ոF

ոF

Ւ

Ւ

ոF

Ւ

Ւ

ոF ոF F

Ւ

ոF ոF ոF

ոF ոF

ո+7

ոF

Նկ. 6.11. Զոնդի կազմի նուկլեոտիդների որոշումը 5 հաջորդական ցիկլերում (J.A. Garrido-Cardenas, F. Garcia-Maroto, J.A. Alvarez-Bermejo, F.Manzano-Agugliaro, 2017):

Շղթայի նուկլեոտիդային կազմի ընթերցման համար անհրաժեշտ է կատարել հերթականությամբ իրականացվող ցիկլերում ստացված բոլոր ազդակների համադրում: Առնվազն 5 ցիկլերում ստացված ազդակների դետեկցիայի արդյունքների համադրմամբ՝ ընթերցվում է շղթայի նուկլեոտիդային կազմը: Համադրումը կատարվում է համակարգչային ծրագրերով: Օգտագործվող գունային տարածքների մեթոդը յուրահատուկ է և կիրառվում է չինական BGI-Shenzhen ֆիրմայի սեկվենատորներում: Նման տեխնոլոգիաներով աշխատող ավտոմատ սարքեր արտադրում են Polonator (Dover/Harvard) և SOLiD (Life Technologies Thermo Fisher Scientific) կազմակերպությունները: Այսօր արդեն ավտոմատացված սեկվենացման արժեքը սկզբնական տարբերակի համեմատ նվազել է 13 անգամ, իսկ նմուշների բազ541

մաթիվ հատվածների բաժանման («shotgun-sequencing») մեթոդը հիմք է դարձել զուգահեռ կատարվող մասսայական սեկվենացման մեթոդի ձևավորման և հաջորդ սերնդի սեկվենատորների (NGS) ստեղծման համար:

6.6. ՍԵԿՎԵՆԱՑՈՒՄ ՄՈԼԵԿՈՒԼԱՅԻՆ ԿԼԱՍՏԵՐՆԵՐԻ ՎՐԱ

ՖԼՈՒՈՐԵՍՑԵՆՏ ՆՇՎԱԾ ՆՈՒԿԼԵՈՏԻԴԱՅԻՆ ՆԱԽՈՐԴՆԵՐԻ

ԿԻՐԱՌՄԱՄԲ. Illumina/Solexa ՄԵԹՈԴ Մեթոդը առաջարկվել է 2005 թ. «Illumina» կազմակերպության կողմից: Աշխատանքային պլատֆորման կոչվում է «Solexa», ժամանակակից անվանումը՝ Illumina: Այս մեթոդով հետազոտություն կատարելու համար, ինչպես և այլ տեխնոլոգիաների դեպքում, անհրաժեշտ է ձևավորել ԴՆԹ-ի գրադարան: «Solexa» մեթոդով գրադարանի ձևավորումը նախատեսում է պինդ՝ առարկայական ապակու տիպի մակերեսի վրա ՊՇՌ-ի եղանակով՝ ԴՆԹ-ի հատվածների բազմաթիվ պատճեններից կլաստերների աճեցում: Այսպիսով՝ հետազոտության առաջին փուլում ԴՆԹ-ի հետազոտվող շղթան որևէ եղանակով, օրինակ` ռեստրիկտազ ֆերմենտներով կամ ուլտրաձայնով բաժանվում է տարբեր երկարություն և կազմ ունեցող հատվածների: Ապա հատվածները բաժանվում են ըստ տեսակների, և բոլոր հատվածները կապվում են երկու ծայրերում յուրահատուկ ադապտերների հետ: Ադապտերների կազմը հայտնի է, և դրանք նշադրում են հատվածը, դարձնում ճանաչելի հետազոտության ընթացքում (նկ. 6.12Ա): Հաջորդ փուլում ադապտերների հետ կապված միաշղթաները տեղափոխվում են պինդ հիմքեր պարունակող հատուկ խցիկների մեջ: Հիմքի մակերեսի վրա վանդակային եղանակով ամրացված են տարբեր հատվածների ադապտերներին կոմպլեմենտար, մակերեսի հետ կապված պրայմերներ: Ամեն հատվածին համապատասխանում են երկու ծայրերի ադապտերներին կոմպլեմենտար 2 պրայմերներ: ԴՆԹ-ի հատվածների ադապտերները կապվում են կոմպլեմենտար պրայմերներին և ԴՆԹ-պոլիմերազ ֆերմենտի ու 4 սահմանող նշա542

դրված նուկլեոտիդների ներկայությամբ կատարվում է հատվածների կրկնապատկում և երկշղթա հատվածների ձևավորում: Նոր սինթեզված շղթաները կապված են կովալենտ կապով ֆիքսված պրայմերին, այսինքն` ֆիքսված են պինդ մակերեսին: Բնափոխումից հետո սինթեզված շղթաների ազատ ծայրերը կոմպլեմենտար կապվում են մոտակայքում առկա հիմքին ամրացված պրայմերների հետ՝ առաջացնելով կամրջակներ և կատարվում է կրկնապատկման նոր փուլ: Այս պատճառով մեթոդը ստացավ կամրջակային ՊՇՌ անվանումը:

ն

== .... .... U11աLL1ն •L11Ըt.11

Նկ. 6.12. Մոլեկուլային կլաստերների ձևավորման սխեման. Ա - ԴՆԹ-ի հետազոտվող շղթայի մասնատում և երկու ծայրերի նշադրում ադապտերներով: Ստացված հատվածների միացում հիմքին կապված կոմպլեմենտար պրայմերին: Բ - Պոլիմերազային ռեակցիայի արդյունքում ձևավորված կլաստերներ (http://propionix.ru/sekvenirovaniye-i-pts):

ՊՇՌ ռեակցիան շարունակվում է, և հիմքի ամեն հատվածում կոմպլեմենտար պրայմերների հետ կապվող հատվածները կրկնապատկվելով առաջացնում են տվյալ հատվածի միլիոնավոր պատճենների կլաստերներ: Վերջին փուլում շղթաները մնում են կապված միայն մեկ ծայրով, քանի որ հարևանությամբ չեն գտնում ազատ պրայմերներ: Այսպիսով՝ նախապատրաստվում է ԴՆԹ հատվածների գրադարանը: Հաջորդ փուլում առաջացած միաշղթա հատվածներից հեռացվում է ադապտերներից մեկը: Մնացած ադապտերը օգտագործվում է յուրահատուկ պրայմերի հետ կապվելու համար: Ռեակցիայի կատարման համար միջավայր են ներմուծվում ազատ լողող, ադապտերների

նկատմամբ յուրահատուկ պրայմերներ, ԴՆԹ պոլիմերազ ֆերմենտ և ֆլուորեսցենտ նշադիր կրող, սահմանող նուկլեոտիդներ (սահմանող նուկլեոտիդները՝ ddNTP, ունակ են միանալ չզուգավորված նուկլեոտիդին, բայց խոչընդոտում են ռեակցիայի հաջորդ փուլին): Ամեն տեսակի ddNTP նուկլեոտիդը կապվում է հատուկ նշադիրի հետ: ԴՆԹ-ի ամեն մի շղթային միանում է միայն մեկ պրայմեր և դրա ծայրը երկարացվում է մեկ նուկլեոտիդով, որը կոմպլեմենտար է մատրիցայի շղթայի առաջին չզուգավորված նուկլեոտիդին: Ամեն մի կլաստերում լազերային համակարգը ճանաչում է միացած նուկլեոտիդը ֆլուորեսցենտ նշադիրի ազդակով և գրանցում ինֆորմացիան՝ որ կլաստերում ինչ նուկլեոտիդ է միացել: Ապա միացած ծայրային նուկլեոտիդները մշակվում են ֆոսֆատազով և ակտիվանում՝ կապում ևս մեկ նուկլեոտիդ: Լուծույթը փոխվում է՝ հինը հեռացվում է, և ներմուծվում է նշադրված նուկլեոտիդներ պարունակող նոր լուծույթ: Նոր ներմուծվող նուկլեոտիդները նույնպես սահմանող են: Այս փուլի ավարտից հետո նոր միացված նուկլեոտիդի ազդակը նույնպես գրանցվում է համապատասխան կլաստերի ԴՆԹ-ի շղթայի վրա (նկ. 6.13): Նկ. 6.13. Սեկվենավորում մոլեկուլային կլաստերների վրա. 1 - պրայմերի միացում, 2 - 1-ին նուկլեոտիդի միացում, 3 - նշադրի անջատում, 4 - հաջորդ նուկլեոտիդների միացումներ, 5 - գրանցված ազդակների ընթերցում (https://studfiles.net/preview/):

Լազերային համակարգը միաժամանակ ըմբռնում և գրանցում է բազմաքանակ կլաստերներում կատարվող ռեակցիաները: Այս եղանակով, փուլ առ փուլ, նշադրված սահմանող նուկլեոտիդների միացման եղանակով սեկվենացվում են կլաստերների միլիարդավոր հատվածները, և որոշվում է դրանց նուկլեոտիդային հերթականությունը: Սեկվենավորում մոլեկուլային կլաստերների վրա ֆլուորեսցենտ նշված նուկլեոտիդային նախորդների կիրառմամբ մեթոդը կազմված է

Նկար 6.14-ի ներքևի հատվածում ներկայացված են 4 կլաստերներից ստացված և գրանցված 5 հաջորդական պատկերներ: Կլաստերները համարակալված են: 1-ին կլաստերից ստացված 5 պատկերներով կառուցված է դրա կազմի շղթաների առաջին 5 նուկլեոտիդի հերթականությունը: 300 նուկլեոտիդներից կազմված հատվածների սեկվենացումը կատարվում է 99 % ճշգրտությամբ: Վերջերս ստեղծված «HiSeqX» համակարգը մեկ ցիկլի ընթացքում 99,999 % ճշգրտությամբ ընթերցում է 16 մարդու գենոմ: Նկ. 6.14. Սեկվենացման արդյունքների գրանցման և ստացված արդյունքների ընթերցման սխեման (http://propionix.ru/sekvenirovaniye-i-ptsr) 1 ~1U)1tlզմ □~bm~ կfոeյ\յZկtlզuոոl~ 1]կoոaո : □~ րո8tlզeյl)Ծ կtlզ1յոeյ\յZ կ~եո~ կtlզ1յtlզuոոl~ 1 ~1uf1tlոոո~ f1utlզ1]1յկոuզl~1u1յ 9ոf1հlո~ ~1ulfոa 1յtluoոy l]զ~ո uոզy 6կհuկ1 կ1յոa 4n ՏI '

"'"lf!)յ.)!) -

: □tlfm,;> .£

\յul)ո~yոո '1 □tJ41JmZ1J 1~1uf16ոaզy 6կ1յ -կոuզl~lUIյ 9ոflհlո~ oոaո 6կհuկ1 1յtluoո::,

'.) . ..1• •

•

կtlզl)~ո1յեո զոf16ոոո 6կtlզl)tlզոոոl~ tlզմuո5

,t : •ր •• •..1t,·Ո•ն· '

~

: □1J4muql~1U1J 1)կ· , կfոeյ\յZ t.lգեո1 1~1uf1Zutlu flutlu ~ո1յեո 1յոոjոոոոհ1 -ո~ոy 1~1ufl~ոgtlո '1 ն\յկոuզl~1U1յ 9ոfltl1յոZ1յ 1)կ·, 1~1U1յոկ~ 1]կtlզ1յոeյ\յZ

..

I

I

կtlզոոոl~ Iյզո :հuկ11յո~ոկ~tj1! 1)կ· ,

_,

: □tlq~mmhl

!)

•

~/

l' L·, I

. ,al{',

.-:~2 I

L• •

'

I'

Ii

,........_

:ոl)զ~tյզԸt եոtlզ~կluո•eյ'lu '1 tlզl]tlզ~fոtlհl '1յկոuզl~lUI) t, l.lul)ո~yոո 9ոfltl1յոZ1յ l]զ ~1Uf191u~tlզ1յ eյf1u91ul 1յUկ6~ոզu :~1u6ոկ~ կ1յկոuզl~lUIյ 9ոfltյ1յոZ1յ 1)կ· , ,l1uկ11)կ· ,

բուն քիմիական հետազոտության փուլից և ստացված ազդակների դետեկցիայից (նկ. 6.14):

6.7. ՊԻՐՈՍԵԿՎԵՆԱՑՈՒՄ

Պիրոսեկվենացումը կամ պիրոֆոսֆատային սեկվենացումը ՆԹ-ների հետազոտման ժամանակակից և արդյունավետ մեթոդ է, չնայած առաջին անգամ այն առաջարկվել է 20-րդ դարի 90-ական թվականներին: Բայց 454 LifeSciences կազմակերպության կողմից մշակված նորագույն տեխնոլոգիաները կատարելագործել են դասական մեթոդը, ընդլայնել դրա կիրառման բնագավառները և ապահովել լայն օգտագործման հնարավորությունը: Ըստ էության պիրոսեկվենացումը ԴՆԹ-ի շղթայում նուկլեոտիդների հերթականության որոշումն է ռեալ ժամանակում՝ սեկվենացում սինթեզի միջոցով եղանակով: Ռեակցիաների ընթացքում, մատրիցային շղթայի վրա կոմպլեմենտար շղթայի սինթեզի պրոցեսում ԴՆԹ պոլիմերազ ֆերմենտով կատարվող նուկլեոտիդի միացումից հետո անջատվում է պիրոֆոսֆատ, որը, անցնելով մի շարք ֆերմենտային վերափոխումներ, անջատում է լույսի քվանտ (M. Ronaghi, et al., 1996): Նուկլեոտիդի միացումը բացահայտվում է լուսային ազդակի դետեկցիայի միջոցով: Կրկնվող փուլերում ստացվող ազդակների դետեկցիայի տվյալներով կազմվում է մատրիցային ԴՆԹ-ների նուկլեոտիդների հերթականությունը: Մեթոդի լրիվ անվանումը կարող է ստացվել ռեակցիայում կիրառվող մեթոդների հիշատակման եղանակով՝ «Պիկոլիտրային էմուլսիոն ռեակտորներում ԴՆԹ-ի պիրոֆոսֆատային սեկվենացում»: 6.7.1. Պիրոսեկվենացում էմուլսիոն ՊՇՌ-ի օգտագործման եղանակով Փորձի սկզբում գենոմի ԴՆԹ-ի բոլոր մոլեկուլները բաժանվում են փոքր՝ 300-500 նուկլեոտիդներից կազմված հատվածների (նկ. 6.15Ա): Ապա շղթաները բնափոխվում են և ստացված միաշղթա հատվածները կապվում են որոշակի օլիգոնուկլեոտիդային երկշղթա ադապտորների հետ՝ նուկլեոտիդային հերթականությունների, որոնց միջոցով ԴՆԹ-ի հատվածները միացվում են լուծույթում առկա պլաստիկ ուլունքներին (ադապտորի նուկլեոտիդային կազմը թույլ է տալիս սեկվենացման պրոցեսում ճանաչել հետազոտվող ԴՆԹ հատվածը):

ԴՆԹ-ի հատվածների խառնուրդը նոսրացվում է այնքան, որ ամեն ուլունք կապվում է միայն մեկ շղթայի հետ (նկ.6.15Բ): Նուկլեոտիդային հերթականության հետ կապված ամեն ուլունք շրջաապատվում է ՊՇՌ-ի կատարման համար անհրաժեշտ բոլոր նյութերը պարունակող էմուլսիոն շերտով, և առաջանում են առանձին էմուլսիոն կաթիլներ: Կաթիլներն ըստ էության առանձին ՊՇՌ ռեակտորներ են որոնցում կատարվում է ամպլիֆիկացիա, և ձևավորվում են մոլեկուլային կլոններ: ՊՇՌ-ի այս տարբերակը անվանում են էմուլսիոն ՊՇՌ՝ էՊՇՌ: Արդյունքում՝ ուլունքների մակերեսին կապվում են երկշղթա ԴՆԹ մոլեկուլի միլիոնավոր (մինչև 10 000 000) պատճեններ: Ամպլիֆիկացիայի ավարտից հետո էմուլսիոն շերտը քայքայվում է, ԴՆԹ-ի մոլեկուլները բնափոխվում են, և ԴՆԹ-ի միաշղթա պատճեններ կրող ամեն առանձին ուլունք տեղափոխվում է սլայդի մակերեսին գտնվող առանձին, 6-անկյունային խորշի մեջ (նկ.6.15Գ): Խորշեր պարունակող սլայդը օգտագործվում է որպես բազմաքանակ մեկուսացված ռեակցիաների կատարման հիմք: Ամեն այսպիսի խորշը մեկուսացված պիկոռեակտոր է, որում կատարվում է ԴՆԹ-ի սեկվենացման ռեակցիա: 6-անկյուն խորշերով սլայդը պատրաստվում է բարդ մշակման պրոցեսում օպտիկական թելիկներից: Հեռավորությունը փոսիկների կենտրոնների միջև հավասար է 50 մկմ, ամեն խորշի խորությունը հավասար է 55 մկմ, իսկ ծավալը՝ 75 պլ: Ամեն մմ2-ի վրա դրանց քանակը հասնում է 480-ի: Ամեն սլայդի վրա տեղավորվում է 1,6 մլմ խորշ: Սլայդերը այնպես են տեղադրում բաց ծայրերով խցի մեջ, որ դրանց մակերեսի վրա առաջանա ազատ՝ 300 մկմ բարձրությամբ շերտ, որով փոսիկների մեջ ներբեռնվում են ռեակտիվներ: Ներմուծվող ռեակտիվները հոսում են խորշերի մակերեսով և հասցնում դրանց ամպլիֆիկացիայի համար անհրաժեշտ ԴՆԹ-պոլիմերազ, ԱԵՖ սուլֆիրիլազ, լյուցիֆերազ, ապիրազ ֆերմենտները, ադենոզին 5՛ ֆոսֆոսուլֆատ սուբստրատն ու լյուցիֆերին նյութը (նկ. 6.15Դ):

Նկ. 6.15. Ա - հետազոտվող ԴՆԹ-ն մասնատվում է փոքր հատվածների, Բ - ուլունքները կապվում են ԴՆԹ-ի մեկ շղթայի հետ, Գ - ԴՆԹ-ի հատված կրող ամեն մի ուլունք տեղափոխվում է առանձին խորշի մեջ, Դ - խորշերի մեջ ավելացվում են ՊՇՌ-ի համար անհրաժեշտ նյութեր կրող փոքր ուլունքներ, Ե - մեծ սլաքը նշում է լուծույթում առկա 100 մկմ էմուլսիոն կաթիլները, փոքր սլաքը՝ կաթիլի կազմի 28 մկմ ուլունքը, Զ - խորշերի ձևը և դասավորությունը սլայդի վրա (https://biomolecula.ru/articles/454sekvenirovanie-vysokoproizvoditelnoe-pirosekvenirovanie-dnk):

Ռեակցիոն նյութերի ավելացումը և օտարումը կատարվում է կոնվեկցիոն փոխադրման և դիֆուզիայի եղանակներով: Նուկլեոտիդները, ինչպես և այլ նյութերը, ներմուծվում են խորշերի մեջ քայլ առ քայլ՝ փուլերով: Ամեն փուլում տեղափոխվում է մեկ տեսակի նուկլեոտիդ: Ներմուծվող նյութերի դիֆուզիան խորշերի մեջ տևում է մոտավորապես 10 վայրկյան, և դրա արագությունը պայմանավորված է խորշերի խորությամբ ու ազատ շերտի բարձրությամբ: Նշենք, որ խորշերի խորությունը կարևոր գործոն է. այն պետք է լինի բավարար գնդերի հուսալի տեղավորման և հարևան խորշերի ռեակցիոն նյութի մեկուսացման համար, բայց նույն ժամանակ ոչ այնքան խորը, որ երկարաձգի դիֆուզիայի ընթացքը և ամբողջ ռեակցիայի պրոցեսը: Ամեն խորշի մեջ ավելացվում են ավելի փոքր գնդիկներ, որոնց մակերեսին կապված են պիրոսեկվենացման համար անհրաժեշտ ֆերմենտները (նկ. 6.15Դ):

Ռեակցիային մասնակցող մյուս նյութերը և որոշակի նուկլեոտիդ ամեն փուլում ներմուծվում են հոսանքային միջոցով ազատ մնացած տարածքով: Ամեն քայլում, երբ խորշ ներմուծված նուկլեոտիդը, լինելով կոմպլեմենտար մատրիցայի շղթայի կենսասինթեզի կետում գտնվող չզուգավորված նուկլեոտիդին, կապվում է զույգ շղթայի ծայրին, անջատվում է պիրոֆոսֆատի (ՊՖ) մոլեկուլ: ր liոկtեոոt,[lներt, հերiրթակա նոգ,յոնQ 6Շ

Ճ66ՇՇ

G

Շ

T

Ut,ացlոորi նոկtեոոt,[lLiենlQ

Նկ. 6.16. Պիրոսեկվենացման մեթոդի մոլեկուլային պատկերը: Ա - ռեակցիաների կատարման հերթականությունը և ստացվող նյութերը, Բ - մեկ խորշում կատարվող ռեակցիայի արդյունքների գրաֆիկը (http://propionix.ru/sekvenirovaniye-i-ptsr):

Անջատված ՊՖ մոլեկուլը ներգրավվում է ֆերմենտային ռեակցիաների շարք (նկ. 6.16): Առաջացած պիրոֆոսֆատը ԱԵՖ-սուլֆուրիլազ ֆերմենտի ազդեցությամբ դառնում է ԱԵՖ: ԱԵՖ-ի առկայությամբ լյուցիֆերազ ֆերմենտը օքսիդացնում է լյուցիֆերինը՝ առաջացնելով օքսիլյուցեֆերին և լույսի ֆոտոն, կատարվում է քեմալյումինիսցենցիա, որը ըմբռնվում և գրանցվում է հատուկ սարքերով: Այսպիսով՝ որոշակի նուկլեոտիդի միացումը համապատասխան խորշում առաջացնում է ռեակցիաների շղթա, որոնց արդյունքում անջատվում է ֆոտոն և արձակվում է ըմբռնվող և գրանցվող լույսի փայլատակում: Քանի որ ամեն խորշում գտնվում են նույն շղթայի միլիոնավոր պատճեններ, որոնք հավասար հավանականությամբ անցնում են ռեակցիայի բոլոր փուլերը, ապա ամեն մի խորշում, որտեղ կատարվել են նուկլեոտիդների միացումներ, անջատվում են միլիոնավոր ֆոտոններ: Սլայ549

դի հատակը կապված է օպտիկոմանրաթելային լուսատարի հետ, որը հաղորդվում է լիցքային կապի սարքի CCD-սենսորի (charge coupled device) հետ: Լույսի փայլատակումը ըմբռնող և գրանցող այս համակարգը ճանաչում է խորշում գտնվող շղթաները ադապտերի միջոցով, և համադրում այս փաստը ներմուծվող նուկլեոտիդի տեսակի հետ: Այսպես պարզվում է, թե որ շղթային է միացել տվյալ նուկլեոտիդը: Լիցքային կապի սարքը միաժամանակ վերլուծում է հազարավոր խորշերից ստացված ազդակը և գրանցում այն համապատասխան պիկոգրամում: Ամեն առանձին նուկլեոտիդի միացման ռեակցիան տևում է 0,02-ից մինչև 1,5 վայրկյան: Ռեակցիայի ավարտից հետո բոլոր խորշերը լվացվում են ապիրազ ֆերմենտ պարունակող հոսող լուծույթով և չկապված նուկլեոտիդները հեռացվում են: Սկսվում է պիրոսեկվենացման ռեակցիայի հաջորդ փուլը: Այս անգամ ռեակցիայի համար անհրաժեշտ նյութերի հետ լուծույթում ներմուծվում է մեկ այլ նուկլեոտիդ: Բոլոր վերևում ներկայացված ռեակցիաները կրկնվում են, բայց այս անգամ կամ նույն կամ այլ խորշերում, որտեղ կենսասինթեզի կետում մատրիցային շղթայի վրա առկա է չզուգավորված և ներմուծվող նուկլեոտիդին կոմպլեմենտար նուկլեոտիդ: Ռեակցիայի արդյունքները գրանցող համակարգը ֆիքսում է ամեն առանձին խորշում միացվող նուկլեոտիդների հերթականությունը և ներկայացնում այն գրաֆիկի ձևով: Այն դեպքերում, երբ հետազոտվող շղթայի վրա նույն նուկլեոտիդը կրկնվում է երկու անգամ, գրաֆիկի վրա ֆլուորեսցենտ ազդակի կրկնակի ուժին համապատասխան գրանցվում է բարձր գագաթ: Ռեակցիայի կատարման կենսաքիմիական ընթացքը և ստացված արդյունքների գրանցման եղանակը ներկայացվում են նկար 6.11-ում: Պիրոսեկվենացման կենսաքիմիական պրոցեսները իրականացվում են հետևյալ փուլերով. 1. Հետազոտվող ԴՆԹ-ն բաժանվում է հատվածների, որոնք միացվում են ադապտերների հետ և կապվում գնդերին: Հաջորդ փուլում էմուլսիոն ՊՇՌ-ի միջոցով հատվածները ամպլիֆիկացվում են և բնափոխվում: Առաջանում են գնդերի հետ կապված բազմաթիվ

միաշղթա հատվածներ, որոնք հիբրիդացվում են սեկվենացման համար օգտագործվող պրայմերների հետ (նկ. 6.10): 2. Միաշղթա հատվածները և պրայմերը ինկուբացվում են ԴՆԹ պոլիմերազ, ԱԵՖ սուլֆիրիլազ, լյուցիֆերազ և ապիրազ ֆերմենտների, ադենոզին 5՛ ֆոսֆոսուլֆատ ու լյուցիֆերին սուբստրատների հետ: 3. Ստացված խառնուրդին ավելացվում է որևէ եռաֆոսֆատ (dNTP): ԴՆԹ պոլիմերազը ակտիվացնում է եռաֆոսֆատի միացումը պրայմերի ծայրին, եթե այն կոմպլեմենտար է ԴՆԹ-ի հատվածի համապատասխան չզուգավորված նուկլեոտիդին: Ամեն միացման արդյունքում անջատվում է պիրոֆոսֆատ (PPi), որի քանակը հավասար է կապված եռաֆոսֆատների քանակին: 4. Ադենոզին 5՛ ֆոսֆոսուլֆատի առկայությամբ ԱԵՖ սուլֆիրիլազը փոխում է պիրոֆոսֆատը ԱԵՖ-ի: ԱԵՖ-ը ակտիվացնում է լյուցիֆերինի օքսիդացման ռեակցիան, որի արդյունքում արձակվում են ԱԵՖ-ի քանակին համապատասխանող լույսի քվանտեր: Լույսի ազդակը և դրա ինտենսիվությունը դետեկտավորում է CCD սարքը և գրանցում պիկոգրամի վրա առանձին գագաթների ձևով: Գագաթների բարձրությունը համապատասխանում է պրայմերին կապվող նուկլեոտիդների քանակին: 5. Ռեակցիայի բոլոր փուլերի վերջում ապիրազ ֆերմենտը քայքայում է չմիացած նուկլեոտիդները և ԱԵՖ-ի մոլեկուլները: Նոր փուլի սկզբում լուծույթին ավելացվում են նոր նուկլեոտիդներ: 6. Նուկլեոտիդների ավելացումը ռեակցիային կատարվում է որոշակի հերթականությամբ: Նշենք, որ դեզօքսիադենոզին ալֆատիոֆոսֆատը օգտագործվում է ռեակցիայում դեզօքսիադենոզին եռաֆոսֆատի- փոխարեն, քանի որ այս նուկլեոտիդը հեշտությամբ ճանաչում է ԴՆԹ պոլիմերազը, բայց չի ճանաչում լյուցիֆերազ ֆերմենտը: Պիրոսեկվենացման պրոցեսում կատարվում է կոմպլեմենտար շղթայի սինթեզ, և նուկլեոտիդների հերթականությունը ներկայացվում է պիկոգրամի գագաթների ձևով: Պիրոսեկվենացիայի մեթոդը ճշգրիտ է և շատ արդյունավետ տարբեր տեսակների գենոմների նուկլեոտիդային հերթականություն551

ների բացահայտման համար, բայց «454 LifeSciences» սարքով այս մեթոդի կատարման համար օգտագործվող ԴՆԹ-ի հատվածների հարմար չափը հավասար է միայն 300-ից 500 նուկլեոտիդի, որը երկարաձգում է հետազոտման ընթացքը: Վերջին տարիներին արտադրվող «GSFLXTitaniumXL+» նոր տիպի սարքն ապահովում է 99,997 % ճշգրտության մակարդակով 1000 նուկլեոտիդներից կազմված հատվածների նուկլեոտիդային հերթականության որոշման հնարավորություն: Այս սարքի օգտագործմամբ մեկ աշխատանքային օրում 15 անգամ ստուգելով որոշվում է մինչև 1 մլրդ նուկլեոտիդների հերթականություն: Նոր տեխնոլոգիան հաջողությամբ օգտագործվում է գենոմային հետազոտություններում:

6.8. ԿԻՍԱՀԱՂՈՐԴՉԱՅԻՆ ՍԵԿՎԵՆԱՑՈՒՄ

(Semiconductor Sequencing) Կիսահաղորդչային սեկվենացման մեթոդը 2010 թվականին առաջարկել է «IonTorrent» կազմակերպությունը: Առաջարկված մեթոդի դետեկցիայի սկզբունքը տարբերվում է բոլոր մինչ այժմ ներկայացածներից նրանով, որ չի նախատեսում ոչ նուկլեոտիդների վերափոխում և ոչ էլ լուսային կամ ֆլուորեսցենտ նշադիրների օգտագործում: Պոլիմերազային ռեակցիայի պրոցեսում, երբ կոմպլեմենտարության սկզբունքի համաձայն մատրիցային շղթայի նուկլեոտիդին կոմպլեմենտար նուկլեոտիդը կապվում է պրայմերի ազատ ծայրին, անջատվում է միջավայրի pH-ի փոփոխություն առաջացնող ջրածնի իոն: pH-ի այս փոփոխությունը բացահայտվում է համապատասխան սարքերով և օգտագործվում է կիսահաղորդչային սեկվենացման ընթացքում հետազոտվող հերթականության նուկլեոտիդների բացահայտման համար: pH-ի փոփոխությունը նշադրում է ռեակցիայի կատարումը և բացահայտում նուկլեոտիդ կապելու փաստը: Նմուշների պատրաստումը կիսահաղորդչային սեկվենացման համար գրեթե չի տարբերվում վերևում ներկայացված մեթոդներից: Հաճախ օգտագործվող էմուլսիոն ՊՇՌ-ն անհրաժեշտ է փորձի ինտենսիվության բարձրացման համար՝ նույն տարածքում միաժամա552

նակ կատարվող միլիոնավոր ռեակցիաներում մեծ քանակով անջատվում են H իոնները, և ավելի ուժեղ է փոփոխվում pH-ը, ավելի ճշգրիտ է դետեկտավորման արդյունքը: Այդ պատճառով էմուլսիոն ՊՇՌ-ի արդյունքում ստացված բնափոխված ԴՆԹ-ի հատվածներով պատված միկրոգնդերը տեղափոխվում են միկրոչիպի իոնազգայուն մակերես ունեցող միլիոնավոր միկրոխցիկների մեջ մեկ խցիկ/մեկ գունդ եղանակով: Խցիկների իոնազգայուն մակերեսը կապված է pH-ի մակարդակը չափող սարքի հետ: Ապա փուլային եղանակով ավելացվում են ՊՇՌ ռեակցիայի համար անհրաժեշտ նուկլեոտիդներից մեկը պարունակող ռեակցիոն լուծույթներ: Այն միկրոխցիկներում, որոնցում ներմուծված նուկլեոտիդը կոմպլեմենտար է պրայմերից հետո գտնվող ԴՆԹ-ի պատճենների առաջին չզուգավորված նուկլեոտիդին, ամեն մի շղթայի վրա կատարվում են սինթեզի ռեակցիաներ, և անջատվում են միլիոնավոր H իոններ: pH-ի փոփոխությունը գրանցվում է հատուկ սարքերով: Հաջորդ փուլում ռեակցիոն խառնուրդը փոխվում է և ավելացվում է մեկ այլ նուկլեոտիդ պարունակող լուծույթ: Կատարվում է ռեակցիայի 2-րդ փուլը: Այս տեխնոլոգիաներով աշխատող ժամանակակից «Personal Genome Machine» (PGM) սեկվենատորը մեկ փուլում ճշգրտության բարձր մակարդակով՝ 99,5 %, բացահայտում է մինչև 2 000 000 նուկլեոտիդ: Հետազոտվող շղթաների միջին չափը կազմում է 400 զ.ն.: Ներկայացվող տեխնոլոգիան շատ արագ բարելավվում է, և դրա արդյունավետությունը վերջին տարիների ընթացքում աճել է 100 անգամ: Վերջերս ստեղծված «IonProton» սարքի արդյունավետությունը հավասար է 60 մլրդ զույգ նուկլեոտիդ մեկ ցիկլի ընթացքում և հաջողությամբ օգտագործվում է տարբեր գենոմների հետազոտման համար: Վերջին տարիներին PyroMark կազմակերպությունը մշակել է և արտադրել ավելի հզոր, արագ և ճշգրիտ աշխատող PyroMark

(QIAGEN)

տիպի սեկվենատորներ (http://www.interlabservice.ru /consulting/articles/piro.php):

I I I OրlUQllայր\ՇI ա1.11աtոit1ոն Py,օMallc Օ24 5oft...,.

Պlր\րոնհljljtեՇlանiոl' PyրoM•րtQ2կ

~ ո2ա1.կաU1րաննitlաՇI ~աlրոոtlաjր\ՇI ljայաU fvr<ոM•rltԳ2կ Մiրuuոաoրui.uoo

Uաu,ր~gli;ր~ րաՀtանոull)

lltկ~tր.աgոo flոfAյյjlն

j\յոր1tրոtj

t~աա.tjո~ Q

'I\յa

~

'l0-ll ~աdաUոս) lllu.f\PնP ~ t.ա,~աllOt:ր~ 'lա-jl t.ա,~աllOtր~ t'IԳա~որոtl.1

~

oաu,ոtրotր~ն~

'l

Նկ. 6.17. Ա - PyroMarkQ24 համակարգի կազմի սարքավորումը և ծրագրային ապահովման տիպը (https://www.ramld.ru/userfiles/file/./mironovkazan.pdf): Բ - կիսահաղորդչային սեկվենացման սխեման (D. Golan, P. Medvedev, 2013, փոփոխված):

Միավորելով ԴՆԹ-ի հատվածների սեկվենացման և քանակական վերլուծության եղանակները, այս սարքերն ավելի արդյունավետ են փոքր հատվածների հետազոտման համար: Սարքավորումը և ռեակցիայի սպասարկումը ավելի մատչելի են, հարմար լայնածավալ օգտագործման համար:

PyroMarkQ24 համակարգը կազմված է պիրոսեկվենատորից, նմուշապատրաստման վակուումային սարքից և PyroMarkQ24 Software տիպի ծրագրային ապահովումից (նկ. 6.17): PyroMarkQ24 տիպի պիրոսեկվենատորի տեխնոլոգիական փուլերը կազմված են սովորական պիրոսեկվենացման եղանակով, բայց այս դեպքում թիրախ շղթայի ամպլֆիկացիայի համար օգտագործվող պրայմերի 5՛ ծայրին միացվում է բիոտին: Ապա կատարվում է ամպլիֆիկացիան: ԴՆԹ-ի սեկվենացման համար ընտրված պատճենները բիոտինային ծայրով կապվում են ստրեպտավիդինով մշակված սեֆարոզային մասնիկներին: Հաջորդ փուլում կատարվում է ԴՆԹ-ի հատվածների բնափոխում և լվացում, ի վերջո միջավայրում մնում են սեֆարոզային մասնիկների հետ կապված ԴՆԹ-ի միաշղթա հատվածներ: Այսուհետև, սեֆարոզային մասնիկները ԴՆԹ-ի շղթաների հետ միասին ամրացվում են պինդ հարթակին: Հաջորդ քայլով սեկվենացիայի համար պատրաստված պրայմերը կապվում է ԴՆԹ շղթաներին: Կատարվում է պիրոսեկվենացման ռեակցիաների մի քանի ցիկլ: Ստացված արդյունքները դետեկտավորում են և վերլուծում համապատասխան համակարգչային ծրագրերով: Պիրոսեկվենավորման այս եղանակը թույլ է տալիս 15 րոպեում հետազոտել 24 նմուշ: Մեթոդի կիրառմամբ բացահայտվում են միանուկլեոտիդային փոխարինումները, փոքր դելեցիաները և ինսերցիաները, որոշվում է ԴՆԹ-ի մեթիլավորման ստատուսը և ալելների հանդիպման հաճախականությունը: Մեթոդի կիրառությունը կարող է նպաստել անհատականացված բժշկագիտության զարգացմանը և կիրառվել կլինիկական հետազոտություններում: Վերջին տարիներին մշակված և ներկայացված նոր սերնդի պիրոսեկվենացման և սեկվենավորման մեթոդները արդյունավետությամբ, ճշգրտության մակարդակով, արժեքով և աշխատանքի արագությամբ գերազանցում են դասականները: Հաշվի առնելով դրվող խնդիրների առանձնահատկությունները, անհատական բժշկագիտական հետազոտությունների համար ավելի հարմար են «HiSeqX», «NextSeq 500» և «IonProton» համակարգերը, իսկ բակտերիաների և

այլ հարուցիչների գենոմների հետազոտման համար՝ «MiSeq» կամ «PGM» համակարգերը:

6.9. ՍԵԿՎԵՆԱՑՄԱՆ ԵՐՐՈՐԴ ՍԵՐՆԴԻ ՀԱՄԱԿԱՐԳԵՐ (NNGS)

Սեկվենացման նորագույն մեթոդները մշակվում են հաշվի առնելով արդեն գոյություն ունեցող մեթոդների կազմակերպման թերությունները, երկարատևությունը և թանկարժեքությունը: Այսպես, կարևոր է, որ նոր մեթոդների կատարումը չպահանջի նմուշների պատրաստման բարդ բազմափուլ աշխատանք՝ մասնատում, նշադրում, կրկնապատկում և հետազոտման անհատական պայմաններ: Շատ կարևոր են նաև հետազոտման ինքնարժեքի և ծախսվող ժամանակի կրճատումը, մեթոդների զգայունության մակարդակի բարձրացումը: Հետազոտությունների ճշգրտության մակարդակի բարձրացումը և հետազոտվող հատվածների երկարության ավելացումը թույլ կտան չկատարել բազմաքանակ ստուգիչ կրկնողություններ, և ավելի հստակ որոշել ամեն մի հատվածի տեղը ԴՆԹ-ի մեծ մոլեկուլի կազմում: Արդեն աշխատող նոր տեխնոլոգիաների որոշ տեսակները ներկայացնում ենք ստորև (S.E. Levy, B.E. Boone, 2019, E.L. van Dijk et al., 2018, E.A. Manrao, et al., 2012): 6.9.1. Մեկ մոլեկուլի սեկվենացման մեթոդ 2008 թվականին «Helicos Bio Sciences» կազմակերպությունը մշակեց՝ մեկ չկրկնապատկված մոլեկուլի սեկվենացման մեթոդ: Դրա առանձնահատկության հիմքում ընկած էր նորատիպ՝ ֆոնային արձագանք չառաջացնող ռեակցիոն հարթակի ստեղծումը: Ներկայացված «tSMS» (true Single Molecule Sequencing) տեխնոլոգիան աչքի է ընկնում ճշգրտության բարձր մակարդակով, սեկվենացման համար օգտագործվող ռեագենտների կազմով և ստացված արդյունքների դետեկցիայի եղանակի ինքնատիպությամբ: Ներկայացվող տեխնոլոգիայի համաձայն՝ ԴՆԹ-ի մոլեկուլը բաժանվում է առանձին հատվածների և ամեն մի հատվածի ծայրին միացվում է լուսային ազդակով նշադրված ադենիլային պոչ: Ռեակ556

ցիոն հարթակի մակերեսին՝ մեկը մյուսից բավարարաչափ հեռու, ամրացվում են թիմիդինային մնացորդներից կազմված շղթաներ: Ապա հարթակի վրա տեղափոխվում են ադենիլային պոչերով նշված ԴՆԹ-ի հատվածները: Ադենիլային և թիմիդինային շղթաները կոմպլեմենտար միավորվում են և ԴՆԹ-ի ամեն հատված միանում է հարթակի որոշակի կետի: Երբեմն հատվածների միացումը կատարվում է միկրոփոսիկներում: ԴՆԹ-ի ամրացված հատվածներ կրող հարթակը սկանավորվում է, և լուսային նշադրի շնորհիվ որոշվում են հատվածների սայտերը հարթակի վրա: Ապա լուսային նշադիրը հեռացվում է, և ավելացվում է ՊՇՌ-ի ռեակցիոն խառնուրդ, որի կազմում առկա է միայն մեկ տիպի նշադրված նուկլեոտիդ: Ամեն մասնակից շղթայի կոմպլեմենտար կետերում կատարված ռեակցիան գրանցվում է: Հաջորդ փուլում ռեակտիվները և ֆլուորեսցենտ նշադիրը հեռացվում են, և ավելացվում է նոր ռեակցիոն խառնուրդ մեկ այլ նուկլեոտիդով: Կատարվում է սեկվենացման երկրորդ փուլը: Այսպես, ամեն փուլում ավելացնելով մեկական նուկլեոտիդ, որոշվում է մինչև 55 նուկլեոտիդ պարունակող հատվածի նուկլեոտիդային հերթականությունը: Համակարգիչը գրանցում է բոլոր ֆլուորեսցենտ ազդակները հարթակի ամեն մի կետում և կառուցում համապատասխան շղթաների նուկլեոտիդային հերթականությունը: Այս եղանակով մեկ օրում բացահայտվում են ԴՆԹ-ի նուկլեոտիդային միլիարդանոց հերթականություններ ճշգրտության բարձրագույն մակարդակով՝ 99,999 %: Նշենք, որ վերածածկող հետազոտությունների քանակը հասնում է 20-ի: Այս եղանակով աշխատող «HeliScope» սարքը, լինելով շատ թանկարժեք, կիրառություն չգտավ:

6.9.2. Մեկական ԴՆԹ մոլեկուլների սեկվենացում ռեալ թայմ մեթոդով (Singlemoleculerealtimesequencing, SMRT) 2009 թվականին ներկայացվեցին ԴՆԹ-ի մեկական մոլեկուլների սեկվենացման մի շարք նոր տեխնոլոգիաներ: Այս խմբի մեթոդները միավորվեցին և ստացան third generation sequencing (TGS) անվանումը, այսինքն՝ սեկվենացիայի երրորդ սերնդի մեթոդներ: Ռեալ թայմ «Single Molecule Real Time» (SMRT) մեթոդ: 1-ին մեթոդի կիրառմամբ կատարվում է 10 000 ն. կազմված միաշղթա ԴՆԹ-հատվածների ռեալ թայմ սեկվենացում՝ ԴՆԹ պոլիմերազ ֆերմենտի միջոցով: Թափանցիկ ապակու վրա առկա խորշերի հատակին ամրացվում է ԴՆԹ պոլիմերազի մեկ մոլեկուլ: Ամեն մի խորշի մեջ ներբեռնվում է ԴՆԹ-ի մասնատումից ստացված մեկ հատված: Խորշերի մեջ ավելացնում են հատուկ նշադրված 4 տիպի նուկլեոտիդներ: Հատակի այդ հատվածները լուսավորվում են լազերով: Հանգիստ վիճակում լազերի ճառագայթը չի գրգռում նշադիրների արձագանք: Բայց եթե պոլիմերազ ֆերմենտի ազդեցությամբ կատարվում է ԴՆԹ-ի շղթայի կրկնապատկում, և համապատասխան կոմպլեմենտար նուկլեոտիդը միանում է շղթային, դրա նիշը արձակում է յուրահատուկ տիպի լուսային արձագանք, որը և գրանցվում է (նկ. 6.18): Ապա նուկլեոտիդի նիշը անջատվում է և հեռացվում: Հաջորդ փուլում կատարվում է հաջորդ նուկլեոտիդի միացում և հաջորդ լուսային ազդակի արձակում: Այս եղանակով սեկվենացումը կատարող «PacBioRS» սարքի ինքնարժեքը բարձր է, բայց ԴՆԹ-ի նմուշների պատրաստման և փորձի համար օգտագործվող ռեակտիվների ինքնարժեքները հասանելի են: 2-րդ մեթոդ: Մոդիֆիկացման միջոցով հնարավորություն է ստեղծվում կատարել ԴՆԹ-ի շղթայի բազմակի ընթերցում՝ սեկվենացում: Այս նպատակով ԴՆԹ-ի մասնատումից ստացված հատվածներին լիգազ ֆերմենտի օգնությամբ միացվում են հատուկ ադապտերներ, և մոլեկուլը ձեռք է բերում օղակաձև կառուցվածք:

ն

U~tO 2tրU1Q հ ա~աlljաUlաU·

iuաoո~ t ~tկ iuոր2ti

ր

•

■,

r,c, 2'1/ոա

f?~pfl 2'1յMյ.I

Նկ. 6.18. Մեկ մոլեկուլի ռեալ թայմ սեկվենացման մեթոդի սխեման. Ա - սարքի ընդհանուր կառուցվածքը և ազդակի գրանցման եղանակը (https://www.photonics.com/Articles/Personalized_Medicine_No_Longer_Ahead _of_Its/a44349), Բ - ռեակցիայի կատարման և արդյունքների դետեկցիայի մոլեկուլային պատկերը (https://twitter.com/hanniepower/status/ 1095659913303474176):

Տերմինացիայի սայտի բացակայության պայմաններում և օղակաձև կառուցվածքի շնորհիվ շղթան կարող է կրկնակի ընթերցվել մի քանի անգամ (նկ. 6.19): 2012 թ. PacBio կազմակերպությունը սկսեց արտադրել PacBio RS տիպի սեկվենատորներ: Այնուհետև բարելավմանն ուղղված աշխատանքները շարունակվեցին, և ընթերցվող շղթայի երկարությունը ավելացավ 10 անգամ, իսկ սեկվենացիայի արտադրողականութ559

յունը՝ 100 անգամ: Սխալների քանակը մեկ ընթերցման համար կազմում է 13 %, բայց շղթայի օղակաձև կառուցվածքի շնորհիվ ընթերցումը կրկնվում է մի քանի անգամ, և սխալները շտկվում են:

Նկ 6.19. Լիգազի օգնությամբ ձևավորվող օղակաձև ԴՆԹ-ի բազմակի սեկվենացումների սխեման (http://alamed.ru/wp-content/ uploads/2016/09/Brochure):

2013 թ. արտադրվեց նոր«PacBio RS II» տիպի սեկվենատոր, որի կարևոր բարելավումները ապահովում են աշխատանքի ինտենսիվության բարձրացում և ընթերցվող շղթայի ավելի մեծ երկարություն: Սեկվենատորի աշխատանքը հիմնվում է միամոլեկուլային հետազոտության սկզբունքի վրա և կատարվում է ռեալ թայմ ռեժիմով: Հետազոտության համար օգտագործվում է միաշղթա օղակաձև ԴՆԹ՝ SMRTbell, որը ձևավորվում է երկշղթա մոլեկուլի երկու ծայրին ադապտորների լիգավորման եղանակով: Ապա ադապտերին են միացվում պրայմերը և ԴՆԹ-պոլիմերազ ֆերմենտը: Պատրաստ համալիրը տեղափոխում են հատուկ հոսանքի տակ գտնվող 150000 խորշ պարունակող խցի (ZMW) մեջ: Ավելի նոր Sequel 1 տեխնոլոգիաների համար պատրաստված խցերը պարունակում են մինչև 1000 000 խորշ: ԴՆԹ-ի մեկ մոլեկուլը տեղադրվում է մեկ խորշի մեջ: Սեկվենացումը կատարվում է ռեպլիկացիայի եղանակով: Ռեպլիկացիայի պրոցեսում ամեն միացող նուկլեոտիդ արձակում է իրեն բնորոշ ազդակ, իսկ տեսախցիկները նկարահանում են ազդակի գույնը և տևողությու560

նը ռեալ ժամանակում: Խորշերի չափսերը ավելի փոքր են, քան լույսի ալիքի երկարությունը, և ազդակը կուտակում են խորշի հատակի մասում: Ժամանակը երկու նուկլեոտիդների միացումների միջև կոչվում է միջիմպուլսային միջակայք՝ IPD, և պայմանավորված է ԴՆԹ-ի շղթայի մոնոմերների կազմում առկա մոդիֆիկացիաներով: Քանի որ թիրախ մոլեկուլը՝ SMRTbell, օղակաձև է առաջին շրջանակի կրկնապատկման ավարտից հետո, որպես մատրից կարող է օգտագործվել ադապտերը, և ապա կրկնապատկումը կարող է շարունակվել երկրորդ շղթայից: Պրոցեսի տևողությունը պայմանավորված է ֆերմենտի երկարակեցությամբ: Արդյունքում երկու շղթաները մի քանի անգամ կրկնապատկվում են և առաջանում է շատ երկար մոլեկուլ: Կրկնապատկման ավարտից հետո ադապտորների հեռացման միջոցով երկար շղթան բաժանվում է թիրախ հատվածների: Աշխատանքի ընթացքը կարող է բաժանվել մի շարք փուլերի: Ա. Մոլեկուլի նախապատրաստման պրոցեսում երկշղթա հատվածի ծայրերին ամրացվում են ծամկալատիպ ադապտերներ, որոնցից մեկը կապվում է ԴՆԹ-պոլիմերազ ֆերմենտի և պրայմերի հետ: Ձևավորվում են օղակաձև, SMRTbells կոչվոող մոլեկուլներ: Բ. SMRTbells համալիրները բիոտինի և ստրեպտովիդինի օգնությամբ կապվում են ալիքատար խորշի հատակին: Նշենք, որ համալիրները ներմուծվում են խորշերի մեջ դիֆուզիայի եղանակով, և ոչ բոլոր խորշերն են պարունակում SMRTbells համալիրը: Ապա պոլիմերազը սկսում է կապել ֆլուորեսցենտ նշադրված նուկլեոտիդները, և ներքևից լուսավորված խորշերում նուկլեոտիդի կապվելուց հետո արձակվում է լուսային ազդակ: Լուսային ազդակները նկարահանվում են տեսախցիկով՝ ռեալ ժամանակում: Գ. Նկարահանման ժամանակ ֆիքսվում են ոչ միայն լուսային ազդակները, այլև դրանց արձակման ժամանակը և երկու ազդակի միջև առաջացող ընդհատումները՝ միջիմպուլսային ինտերվալները՝ IPD (գրաֆիկի վրա դրանք նշված են սև գույնով): IPD-ները պայմանավորված են ԴՆԹ-ի նուկլեոտիդների էպիգենետիկական մոդիֆիկացիաներով, օրիակ՝ 6-մեթիլադենոզինի առկայությամբ:

Դ. Կրկնապատկումների մի քանի շրջանակները կարող են բաժանվել առանձին իմաստային հատվածների (CCS), եթե կտրել դրանք ադապտերների սայտում: Հետազոտության ճշգրտության մակարդակը բարձրանում է կոնսենսուային շղթաների քանակին զուգահեռ: Ճշգրտությունը արտահայտվում է որակի ցուցանիշներով՝ QV-ներով: Օրինակ՝ 25 կրկնակի ռեպլիկացիաներում ստացված արդյունքների որակի QV40 ցուցանիշը համապատասխանում է ճշգրտության 99,999 % մակարդակին, իսկ QV50 ցուցանիշը՝ 99,9999 %:

Նկ. 6.20. Ա - օղակաձև մոլեկուլի ձևավորում, Բ - օղակաձև մոլեկուլը ամրացվում է ԴՆԹ պոլիմերազին և պրայմերին, ապա ամրացվում է խորշի հատակին, Գ - կատարվում է կրկնապատկում և նշադրված նուկլեոտիդների միացում. ֆոտոխցիկը նկարահանում է պրոցեսը, Դ - ստացված տվյալները վերլուծում են համակարգչային ծրագրերով (https://medach.pro/post/2158):

Նկար 6.20-ում ներկայացվող տվյալները համապատասխանում են բակտերիաների գենոմներին և ստացվել են Sequel համակարգով կատարված սեկվենացման արդյունքում: Վերլուծության համար օգտագործվել են 2.1 և 5.1 հատուկ համակարգչային ծրագրերը: SMRT մեթոդը թույլ է տալիս ստանալ շատ երկար՝ 20 00060 000 նուկլեոտիդ պարունակող ռիդեր, ինչի շնորհիվ ԴՆԹ-ի ամբողջական մոլեկուլի հերթականության վերականգնումը զգալիորեն հեշտանում է: Ռեակցիայի տևողությունը պայմանավորված է միայն պոլիմերազ ֆերմենտի հնարավորություններով: Հետազոտությունը չի

պահանջում նախապես կատարել ամպլիֆիկացիա՝ թիրախը ԴՆԹ-ի մեկ մոլեկուլն է: Մեթոդի կարևոր թերությունը սխալների բարձր՝ 13 % խտությունն է ամեն ռիդի կազմում, բայց մի շարք ընթերցումների հաջորդական կատարումը հեշտությամբ շտկում է այս սխալները: 3-րդ մեթոդ՝ սեկվենացում նանոծակոտիների միջոցով (Nanoporesequencing): Այս մեթոդը մշակվում է արդեն մոտ 15 տարի: Սկզբունքորեն դա նորագույն սերնդի մեթոդներից մեկն է և հնարավորություն է տալիս կատարել ԴՆԹ-ի ամբողջական մոլեկուլի նուկլեոտիդային կազմի որոշում անմիջական հետազոտման եղանակով: Այսինքն՝ նանոծակոտիների տեխնոլոգիան բացահայտում է հետազոտվող շղթայի կազմի նուկլեոտիդը, այլ ոչ թե դրա կոմպլեմենտար զույգը, ինչպես բոլոր այլ օգտագործվող տեխնոլոգիաների դեպքում: Նանոծակոտիների ձևավորման համար օգտագործվում են ինչպես կենսաբանական նյութերը՝ բջջային մեմբրանի լիպիդային երկշերտը և դրա կազմի սպիտակուցային մոլեկուլները (նկ. 6.21), այնպես էլ ոչ օրգանական պինդ նյութեր՝ սիլիցիումի նիտրիտը կամ գրաֆենը: Նշենք, որ մեմբրանի էլեկտրական հաղորդակցությունը հավասար է 0-ի, իսկ միկրոծակոտիներինը բավականին բարձր է: Նանոծակոտային տեխնոլոգիան հիմնվում է նանոծակոտիներով անցնող իոնային հոսանքի վերահսկման մեթոդի վրա: Տարբեր նուկլեոտիդներ ունեն տարբեր չափսեր, մոլեկուլային զանգված և այլն: Եթե մի քանի հազար նուկլեոտիդներից կազմված միաշղթա ԴՆԹ-ն քաշվում է 2-5 նմ տրամագծով նանոծակոտիով, դրա էլեկտրական հաղորդակցությունը փոփոխվում է առանձին նուկլեոտիդի չափսին համապատասխան: Մեծ նուկլեոտիդները, գրավելով մեծ ծավալ ծակոտիի մեջ, ավելի շատ են փոփոխում հոսանքի լարումը: Էլեկտրական հոսանքի ուժի փոփոխությունը գրանցվում է և օգտագործվում նուկլեոտիդների դետեկցիայի համար:

Ut~ա-հեuոլt,զt,u 5. aԱreԱՏ

M5րA Ujոflt,U M. ՏոeցոatՈՏ

կաlljրոյ. fuրոi.ոo.յ.աlj

BacterՈՕքհaցe քհՈ29

Նկ. 6.21. Սեկվենատորներում օգտագործվող բնական տրանսմեմբրանային նանոծակոտիներ: Վերևի շարքում պատկերված են նանոծակոտիների տեսքը և չափսերը կողքից, ներքևի շարքում՝ տեսքը և չափսերը վերևից (http://propionix.ru/sekvenirovaniye-i-ptsr):

OxfordNanoporeTechnologies կազմակերպությունը 2013 թ. հայտնեց նանոծակոտիների տեխնոլոգիայով սեկվենատորի արտադրման մասին: Հայտնի է, որ դրանց օգտագործմամբ կարճ ժամանակում կարող են ընթերցվել տասնյակ հազարավոր նուկլեոտիդներից կազմված ԴՆԹ-ի շղթաներ: Տեխնոլոգիան հիմնվում է ոչ թափանցիկ մեմբրանի նանոծակոտիով անցնող իոնների հոսքի չափման սկզբունքի վրա: Նանոծակոտիով նուկլեոտիդի անցման պահին իոնային հոսքը թուլանում է. անցման ժամանակը և հոսանքի թուլացման չափը պայմանավորված են անցնող նուկլեոտիդի չափսերով և կառուցվածքով: Նանոծակոտինային համակարգերը երկու մասի բաժանված և էլեկտրոլիտ պարունակող ռեակցիոն խցիկներ են: Խցիկները բաժանվում են երկու մասի կամ լիպիդային երկշերտով կամ որևէ այլ իոնային հոսանքի համար անթափանցելի մակերեսով, որի մեջ ներմուծված է նանոծակոտին: Խցիկի երկու մասերին միացվում է էլեկտրական

լարում և նանոծակոտիով անցնում է իոնային հոսանք: Երբ նանոծակոտիով անցնում են նուկլեոտիդները, նանոծակոտիի ազատ տրամագիծը փոքրանում է, հոսանքի ուժը՝ պակասում: Հոսանքի ուժի փոփոխության տվյալներով կարող են որոշվել նանոծակոտիով անցնող մոլեկուլի առանձնահատկությունները (նկ. 6.22): ԴՆԹ-ի կամ ՌՆԹ-ի միաշղթաները ունեն զգալի բացասական լիցք և էլեկտրական լիցքի ազդեցությամբ հրվում կամ քաշվում են նանոծակոտիով և փոփոխում դրա տրամագիծը: Նուկլեինաթթուների հետազոտման համար օգտագործվող նանոծակոտիի տրամագիծը կազմում է միայն մի քանի նմ, և դրանով կարող են անցնել միայն ԴՆԹ-ի կամ ՌՆԹ-ի միաշղթաները: Նանոծակոտիով անցնելու ժամանակ նուկլեոտիդների շարժը որոշ սայտերում դանդաղում է, և արդյունքում իոնային հոսանքի ուժը նանոծակոտիում զգալիորեն թուլանում է: Նանոծակոտիի տրամագծի փոփոխությունը պայմանավորված է այդ պահին անցնող նուկլեոտիդի տրամագծով ու շարժի արագությամբ և գրանցվում է նանոծակոտինային սեկվենատորի համապատասխան սարքով: Ֆիքսվում է նաև ամեն նուկլեոտիդի անցման ժամանակը (նկ. 6.22): Ը..

երt.աu~ա 'Yuրa-ti

.u "::l Ը..

գULl.jաUաLj

ր

"::l

::::i Ը..

ԸԸ:i:

լ

')l,fa

աLl.jաl[ո1.որո

:րt.րut.uո

"::l

Ը..

~

Նկ. 6.22. Նանոծակոտինային սեկվենացման պրոցեսի սխեման (http://propionix.ru/sekvenirovaniye-i-ptsr):

Նանոծակոտինային սեկվենացիայի տեխնոլոգիան ապահովում է գենոմների ընթերցման հնարավորություն նույնիսկ դաշտային, լաբորատոր սարքավորումների օգտագործման սուղ պայմաններում: Հետազոտությունը կատարվում է հեռավար (on-line) պայմաններում, և հետազոտվող հատվածի չափսերը համապատասխանում են հետազոտվող մոլեկուլի չափսերին: Այժմ արդեն մշակվել և արտադրվում են նանոծակոտիների օգտագործմամբ գործող մի շարք սեկվենատորներ (նկ. 6.23): Նանոծակոտինային սեկվենացման մեթոդը բնութագրվում է մի շարք առավելություններով. - բնական ԴՆԹ կամ ՌՆԹ մոլեկուլների կամ ամպլիֆիկացված հատվածների հետազոտում, - անմիջական արդյունք ռեալ ժամանակում, - բոլոր չափսերի ԴՆԹ-ների ընթերցման հնարավորություն, - սարքավորումների փոքր ծավալ, - գենոմային գրադարանների հեշտ ավտոմատացված պատրաստում: Floոgle

5ոiմgIնN

ՇրiմIնN,..

ii

PրoոetհIնN

Նկ. 6.23. Oxford Nanopore Technologies տեխնոլոգիայով աշխատող ժամանակակից սեկվենատորներ (https://biomolecula.ru/articles/nanoporovoe-sekvenirovanie):

Մեթոդի թերություններից ամենակարևորներն են. - սարքավորումների թանկարժեքությունը, - սխալների բարձր հաճախականությունը, - երկրորդ ԴՆԹ-պոլիմերազ ֆերմենտի պատահական միացումը: Oxford Nanopore Technologies կազմարկեպության նանոծակոտինային մոլեկուլային հետազոտման ON-rep-seq մեթոդով 2019 թ. կազմակերպվեց բակտերիաների գեների լայնածավալ հետազոտություն, որը հնարավորություն տվեց կատարել բակտերիաների դասակարգումը շտամերի մակարդակով: Սեկվենացման նոր տեխնոլոգիաների կիրառման ոլորտները շատ տարբեր են և կարող են օգտագործվել ի լրացում արդեն հայտնի և օգտագործվող մեթոդների՝ ինչպես գիտական հետազոտություններում, այնպես էլ ժամանակակից բժշկագիտությունում:

6.10. ԳԵՆՈՄԻ ՆՈՒԿԼԵՈՏԻԴԱՅԻՆ ՀԵՐԹԱԿԱՆՈՒԹՅԱՆ

ԸՆԹԵՐՑՄԱՆ ՄԵԹՈԴՆԵՐԸ

Գենոմների նուկլեոտիդային կազմի ընթերցման հարցը անցյալ դարի 90-ական թվականներին դարձավ գենետիկայի ամենակարևոր խնդիրը և առաջացրեց հետազոտական մեթոդների և տեխնոլոգիաների զարգացման մեծագույն ալիք: Մեծ ազդեցություն ունեցան այս հետազոտությունները գենոմների կառուցվածքի, կազմակերպման և կարգավորման մեխանիզմների ուսումնասիրման գործում: Այսուհետև գենետիկան դարձավ մոլեկուլային կենսաբանության հիմք, և սկսվեց նոր խնդիրների և հետազոտական մակարդակների նոր փուլ: Ամբողջական գենոմների նուկլեոտիդային հերթականությունների ախտորոշման գործընթացը ուղղվեց նաև քրոմոսոմային գեների կազմակերպման և դասավորման կարգի հետազոտությանը, որի շնորհիվ ավելի բարձրացավ դրված նպատակների կարևորությունը և ձեռք բերեց մեծ կիրառական նշանակություն:

Հետազոտության տեխնոլոգիան ընտրվում է հետազոտվող գենոմների կազմակառուցվածքային առանձնահատկություններին համապատասխան: Պետք է նշել, որ նույնիսկ ֆագերի և վիրուսների ամբողջական գենոմների նուկլեոտիդային հերթականությունները շատ մեծ են անմիջական սեկվենացման համար: Ըստ այդմ առաջարկվեց և մշակվեց հետազոտման Shot gun sequencing՝ կտրտման մեթոդը, որի համաձայն ընտրված թիրախ շղթան բաժանվում է փոքր հատվածների: Մեթոդի հիմքում ընկած է հետազոտվող քրոմոսոմի կամ ամբողջական գենոմի պատահական եղանակով կտրտված բազմաթիվ հատվածների նուկլեոտիդային հերթականության ընթերցումը և համադրումը, որը թույլ է տալիս վերականգնել հետազոտվող գենոմի նուկլեոտիդային հերթականությունը: Կտրտման մեթոդի ստեղծման անհրաժեշտությյունը պայմանավորված էր առաջին սեկվենատորների կարճ՝ առավելագույնը 1000 նուկլեոտիդներից կազմված հերթականությունների ընթերցման հնարավորությամբ: Ուստի ավելի մեծ ծավալների ընթերցման համար առաջարկվեց կիրառել առանձին, կարճ հերթականությունների ընթերցման և համակարգչային ծրագրերի միջոցով ամբողջական հերթականության վերականգնման մեթոդը: Առանձին ընթերցված հատվածները կոչվեցին ռիդ: Համադրման եղանակով նախնական հերթականության վերականգնման մեթոդի պարզագույն օրինակը ներկայացվում է նկար 6.24ում: Ներկայացված օրինակում ընթերցված շղթաներից ոչ մեկը չի բացահայտում հետազոտվող հերթականության ամբողջ կազմը: Բայց նույն շղթայի կրկնակի ընթերցման արդյունքների համադրումը բացահայտում է 1-ին և 2-րդ ընդհատման կետերի անթերի կազմը մյուս շղթայի վրա և թույլ է տալիս վերականգնել նուկլեոտիդների ճշգրիտ հերթականությունն ամբողջ հետազոտվող շղթայում:

( Շ!1faակա(յոtլajոtCյ

AՇCA'I'ՇCTՇCAՇ:CA'I'ՇC~TAՇՇCTA

AՇCATՇCTՇCAՇ:C~ՇC:------: Uրո12t1Cյ հաlոկա6 ------------------- TAՇՇC:A AՇ~Շ-------------------: ե րtկ11ոl11'l հաU1lկան

------CTՇCAՇ:C~ՇC:TAՇՇC:A

AՇCA~ՇC:ՇCAՇ:C~ՇC::AՇՇC:A

'-tt;11ակաCյզԾlկա6 հՇflfaակաCյ ոLլa. Շրuaա u կզրCյակաCյ

Նկ. 6.24. Նույն շղթայի երկու պատահական եղանակով կտրտված հատվածների համադրման սխեման (R. Staden, 1979):

Գենոմի կամ դրա որևէ հատվածի նուկլեոտիդային հերթականության ընթերցման աշխատանքը կատարվում է փուլերով: Սկզբում հետազոտվող հերթականությունը ամպլիֆիկացվում է ՊՇՌ-ի եղանակով: Ապա ստացված շղթաները կտրտվում են ոչ յուրահատուկ ռեստրիկտազներով, ինչի շնորհիվ ստացվում են տարբեր երկարությամբ վերածածկվող հատվածներ: Հատվածների չափսերը տարբեր են՝ մի քանի տասնյակ հազարավորից մինչև մի քանի հարյուր հազարավոր զ.ն. սահմաններում: Ստացված հատվածները բաժանվում են ըստ չափսերի և ներմուծվում վեկտորների կազմ: Մեծ գենոմների դեպքում որպես վեկտոր օգտագործվում են բակտերիաների կամ խմորասնկերի արհեստական քրոմոսոմները: Այսպես ձևավորվում են գենոմների գրադարանները (նկ. 6.25): 8ՃՇ liերթրy

Oաol.յորi ոLfl~li -

8ՃՇ Qflաflալlաli

Նկ. 6.25. BAC-գրադարանների կազմում գտնվող ԴՆԹ-ի կտրտումից առաջացող հատվածների հավաքածու (http://propionix.ru/sekvenirovaniye-i-ptsr):

Հետագա աշխատանքները կարող են կատարվել կամ ամբողջ գենոմի հերթականության անմիջական հետազոտման եղանակով, կամ օգտագործելով հիերարխիկ հետազոտման եղանակը: 6.10.1. Գենոմների ամբողջական հերթականության կառուցման գործընթացի փուլերը Ինչպես նշվել է, գենոմի կտրտումը մեծ հատվածների առաջացնում է մեծ քանակությամբ տարբեր երկարությամբ հատվածներ: Այս հատվածները ներմուծվում են վեկտորների կազմ և կազմում գենոմային գրադարան: Հետազոտվող գենոմի կամ մեծ շղթայի վրա դժվար է բացահայտել փոքր հատվածների տեղը: Այդ պատճառով հետազոտվող ԴՆԹ-ի վրա նախ որոշվում է գենոմային գրադարանների մեծ հատվածների տեղը՝ կամ դրանց համադրման եղանակով, կամ մոլեկուլային հիբրիդացման և նշադիրների բացահայտման միջոցով: Այս պատճառով հետազոտվող շղթայի առաջին կտրտման համար օգտագործվում են երկար կտրող՝ 7 և ավելի նուկլեոտիդներից կազմված պոլինդրոմներ ունեցող ռեստրիկտազները, օրինակ՝ Not I-ը, որի պոլինդրոմն է՝ 5՛-GCGGCGC-3՛: Նշենք, որ հատվածների երկարության վրա ազդում են նաև GC կրկնողությունների չափսերն ու հաճախականությունը շղթաներում և կրկնվող հատվածների բաշխումը գենոմում: Գենոմների ընթերցման համար օգտագործվող վեկտորները ընտրվում են հետազոտվող գենոմի տեսակին համապատասխան՝ փոքր գենոմների դեպքում փոքր, իսկ կաթնասունների մեծ գենոմների դեպքում օգտագործվում են YAC/BAC (yeast/bacterial artificial chromosomes) խմորասնկերի կամ բակտերիաների արհեստական քրոմոսոմները, որոնց տարողությունը բարձր է և հասնում է մինչև 2 մլն զույգ նուկլեոտիդից կազմված շղթաների: Ինչպես նշվել է, վեկտորների հավաքածուն կոչվում է գենոմային գրադարան, օրինակ՝ BAC-գրադարան, եթե օգտագործվում են BAC արհեստական քրոմոսոմները: Վեկտորները ներառվում են համապատասխան բջիջների կազմ և

այնտեղ կլոնավորվում: Սակայն այս շղթաների անմիջական սեկվենացումը նույնպես անհնարին է, այդ պատճառով կատարվում է վեկտորների կազմում գտնվող հետազոտվող շղթաների կտրտում ավելի կարճ կտրող ռեստրիկտազներով: Հատվածների կտրտումը փոքր մասերի ընդունված է անվանել «shotgun-sequencing»՝ բաժանում կամ մասնատում: Վերածածկվող մասնատված հատվածների՝ ռիդերի խմբերը կոչվում են BAC- կոնտիգներ: 35-40 000 զ.ն. կազմված հատվածները բազմացման համար բաժանվում են թորամասերի և ներմուծվում λ բակտերիոֆագային վեկտորների կազմ: Ապա վեկտորները տեղափոխվում են բջիջների մեջ, որտեղ կատարվում է կլոնավորում և նույն հատվածների բազմաթիվ պատճենների ձևավորում: Վեկտորների կազմից անջատված թիրախ շղթաները սեկվենացվում են: Շղթաների վերածածկվող հատվածների կամ ծայրերի փոխազդեցությամբ ձևավորվում են կոնտիգներ՝ վերածածկվող հատվածներ, որոնք առաջացնում են կտրտված կտորների կարգավորված հերթականություններ: Շղթաների ծայրերի վերածածկումները վերլուծվում են հատուկ համակարգչային ծրագրերի միջոցով ու կատարվում է ԴՆԹ-ի հերթականության վերականգնում (նկ. 6.26., 6.27Ա): Վերլուծության այս եղանակը կոչվում է ԴՆԹ-ի վերականգնում ամբողջ գենոմի կտրտման եղանակով: Սովորաբար նույն հետազոտությունը մի քանի անգամ կրկնվում է վերջնական ճշգրտված հերթականության բացահայտման համար: Հաճախ կետային մուտացիաների ազդեցության բացառման համար հետազոտվում են ԴՆԹ-ի երկու շղթաները: Նկարագրված մեթոդը կիրառվում է փոքր գենոմների կամ առանձին քրոմոսոմային հատվածների ընթերցման համար: Մեծ գենոմների հետազոտություններում առաջանում են ԴՆԹ շղթաների միլիոնավոր հատվածներ, և դրանց կարգավորման համար մշակվում են նոր մեթոդներ և տեխնոլոգիաներ:

ՄՇiհայiո հl:iriրակաՇiորյոՇI կlորllllոlll 121:iUlորlt'lկUlագՇյl:iրlոL[ կ[ոՇյաL[որ1ոնl

--. --.....~ --""ՊՊ ..- -,-,-----------, -

-

;,_

■ UtկL[tՇյացոնl

•

ՀաlոL[աoՇյtրlti կագllաL[որ1ոնl

կ.երlաOածկLlաՇյ Uայlո. Ըթոtiոց

-------------GՃTՃTTՇՃGTՇՇ ...

... TՇGՇTՃTTՇՇ

Նկ. 6.26. Համադրվող շղթաների վերածածկվող ծայրերի շնորհիվ ձևավորվում են հատվածների փոխկապված համախմբեր՝ կոնտինգներ (http://propionix.ru/sekvenirovaniye-i-ptsr):

Օրինակ՝ կիրառվում է ԴՆԹ-ի շղթայի կազմի վերականգնում հիերարխիկ մեթոդի միջոցով: Սկզբում կատարվում է ԴՆԹ-ի ամպլիֆիկացիա, և առաջանում են բազմաթիվ պատճեններ: Երկրորդ փուլում դրանք բաժանվում են ոչ յուրահատուկ երկար կտրող ռեստրիկտազներով երկար հատվածների, և չափսերի համաձայն բաժանված հատվածները ներդրվում են համապատասխան վեկտորների կազմ: Վեկտորները ներմուծվում են բջիջների մեջ և կլոնավորվում: Առաջանում են որոշակի հատվածներ կրող բջջային կլոններ: Վեկտորների կազմի երկար հատվածները համադրվում են, բացահայտվում է դրանց հաջորդականությունը քրոմոսոմի կազմում:

- e-:jr ==- _•__. • - ~ =-

-=--==.-1! ~

ՇԾ

._.. յ

- - 't

■ ---=

y

:- - - ■

-

A,TՇTTՇՇՇiATTA-~

-

- --~

-

'.lկա11գաl[ո17L[աo նt.կL[t.նացl[աo հաUllոաOUG[l

~ Հանակա17գ~աiրն աL[U1ոնաU1ացL[աo

y

"' Ml

-

Ot.նոնր կUl[lUlոLU Ulա[lրG[l ~ա[DUG[l հաU1L[աoնt.17ր

-

-

TTTՇATTՇAՇT ւ U ~AATATM

կա11գաl[ո17ոն Llt.ր,աoաoկL[որiկոնU1րգնt.11ր հանաjնոtնր :երնր2աl[որ,ոն րացակայորi հաllll[աoնt.րiր նt.կL[t.նացոն

Նկ. 6.27.Ա. Սեկվենացում և ԴՆԹ-ի շղթայի վերականգնում ամբողջ գենոմի կտրտման եղանակով (J. Commins, et al., 2009):

Հաջորդ փուլում առանձին կլոնների կազմում առկա հատվածները առանձին բաժանվում են ավելի փոքր հատվածների կտրտման եղանակով և սեկվենացվում (նկ. 6.27Բ): Առանձին հատվածների փոխազդող կտորները առաջացնում են ինքնուրույն համախմբեր՝ սկաֆոլդներ, որոնք հաջորդ փուլում միավորվում են՝ վերականգնելով ԴՆԹ-ի ամբողջական շղթան: ր

---■ --

■ -

■ --

AlՇT'lՇՇՇATTAi

Նկ. 6.27.Բ. Հիերարխիկ կտրտման մեթոդի կատարման սխեման (J. Commins, et al., 2009):

Ըստ էության, սկաֆոլդները մի շարք կոնտիգների միասնական հերթականություններ են, որոնք, ի դեպ, չեն կազմում անընդհատ հերթականություններ և պարունակում են ընդհատումներ (նկ. 6.28): ~ոնոtգo L[tրաoաol.յL[որi հաոL[աoնtրll հաL[արաoո t -~ո ննtննոաjlն հաոL[աoo l.յոնոjl[յգնtրll tնո նր t Ul.յա:Բ:Բոtրi ր~-,---l.յո- ն:--ո ~,---գ------:l - -,,..._- - ~ ~ո -~~Ul ~ րiգ - 2- - '

..... ... r

.

aaԸԸgg ԸԸggtt

' . . aaԸԸ

accց

ri

~

ccցց

cggt

g gtt.

~

.... հաննjած հաննjած~ հայոO~ ~անo որո2ակ~ tiր1կարlոLրilյա0 հաոtjած աOհայո ~անo

Նկ. 6.28. ԴՆԹ-ի շղթայի կազմի վերականգնում հիերարխիկ մեթոդի միջոցով (J.R. Miller, S. Koren, G. Sutton, 2010):

Այսպիսի ընդհատումները առաջանում են գենոմի կազմի կրկնվող հերթականությունների առկայության կամ մարդու կողմից հետազոտության ընթացքում կատարված բացթողումների պատճառով: Հնարավոր է նաև առանձին հատվածների ընթերցման հետ կապված դժվարությունների ազդեցությունը: Գենոմների նուկլեոտիդային հերթականությունների վերականգնման համար կիրառվում են երկու տեխնոլոգիաներ՝ ա) ընթերցում և վերականգնում՝ ամբողջ գենոմի կտրտման և բ) հիերարխիկ կտրտման եղանակներով: Առաջին դեպքում (ա) գենոմը միանգամից բաժանվում է մանրագույն հատվածների և սեկվենավորվում, ապա կենսաինֆորմատիկայի մեթոդներով վերականգնվում է թիրախ շղթայի նուկլեոտիդային հերթականությունը (նկ. 6.27Ա): Երկրորդ հիերարխիկ կտրտման (բ) դեպքում սկզբում գենոմային շղթան բաժանվում է մեծ հատվածների և որոշվում է դրանց դիրքը հետազոտվող ԴՆԹ-ում: Ապա այդ հատվածները առանձին բաժանվում են ավելի փոքր կտորների և սեկվենավորվում (նկ. 6.27Բ):

Ինչպես տեսնում ենք, այս պրոցեսն ընթանում է մի քանի փուլերով: Սկզբում ԴՆԹ-ի շղթան ամպլիֆիկացվում է: Ապա ստացված պատճենները կտրտվում են հատվածների՝ ոչ յուրահատուկ ռեստրիկտազներով, և առաջանում են վերածածկվող ծայրերով երկար հատվածներ: Դրանք բաժանվում են առանձին խմբերի՝ մոլեկուլային զանգվածի համաձայն և տեղադրվում, օրինակ, BAC-վեկտորների կազմ: Վեկտորները ներդրվում են համապատասխան բջիջիների մեջ և կլոնավորվում: Առաջանում են որոշակի հատվածներ կրող բջջային կլոններ: Պետք է նշել, որ մեծ կտորների հաջորդականությունը թիրախ ԴՆԹ-ի կազմում որոշվում է մոլեկուլային հիբրիդացման եղանակով, նախապես՝ առաջին կտրտումից հետո: Հաջորդ քայլով այս հատվածները անջատվում են վեկտորներից և նորից կտրտվում ավելի փոքր հատվածների ու սեկվենացվում: Յուրաքանչյուր մեծ հատվածի կտորները միասին վերլուծում են կոնտիգների ձևավորման և դրանց օգտագործմամբ սկաֆոլդների առաջացման նպատակով: Եվ վերջին փուլում առաջացած սկաֆոլդների միավորման եղանակով վերականգնվում է հետազոտվող ԴՆԹ-ի ամբողջ մոլեկուլի կազմը: Կարգավորման և նուկլեոտիդային հերթականության վերականգման աշխատանքը կատարվում է համակարգչային ծրագրերի կիրառմամբ: Մեծ գենոմների վերականգնման գործընթացում կարող են առաջանալ թիրախ մոլեկուլների որոշ հատվածների կորուստներ, և այս խնդիրը հնարավոր է հաղթահարել միայն համակարգչային վերլուծության եղանակով: Այդ պատճառով, հաշվի առնելով բարդ գենոմներում կրկնվող հատվածների բարձր խտությունը, նուկլեոտիդային հերթականության վերականգնման վերլուծական աշխատանքները կատարվում են համակարգչային ծրագրերով (К.В. Фелькердинг и др., 2010): Սխալների և բացթողումների նվազեցման նպատակով ընդունված է կատարել նույն հատվածի՝ տարբեր եղանակով կտրտված կտորների 8-12 ընթերցում: Մարդու գենոմի հետազոտության ընթացքում ամեն հատված ընթերցվել է առնվազն 12 անգամ: Գենոմների նուկլեոտիդային հերթականության վերականգնումը սկզբնական ժամանակաշրջանում կատարվում էր սեկվենացիայի մեթոդներին համապատասխանող 1000 նուկլեոտիդներից կազմված

հատվածերի ընթերցման միջոցով: Ամբողջական շղթայի վերականգնման համար օգտագործվում էր overlap-layout-consensus համակարգչային ընթերցման տեխնոլոգիան, այսինքն՝ վերածածկվող overlap հատվածների ընտրություն և միավորում layout մեթոդով: Հատվածների ճշգրիտ դասավորման և ԴՆԹ-ի շղթայի վերականգնման գործընթացը իրականացվում էր հատուկ մշակված համակարգչային ծրագրերի կիրառմամբ: Ավելի ուշ, սեկվենացման նոր տեխնոլոգիաների առաջացման շնորհիվ, ընթերցման արագությունը բարձրացել էր, բայց ընթերցվող հատվածների երկարությունը նվազել մինչև 150 ն.: Այս դեպքում ԴՆԹ-ի վերականգնումը ավելի հարմար է կատարել զուտ մաթեմատիկական եղանակով՝ կիրառելով դե Բրյույնի սյունակների մաթեմատիկական մեթոդը: Համապատասխանաբար մշակվեցին նաև նոր համակարգչային ծրագրեր: Չնայած այս մեթոդով կատարվող վերլուծությունը պահանջում է մեծ քանակությամբ հաշվարկային գործողությունների կատարում աշխատանքի ընդհանուր տևողությունը նվազում է:

6.11. ԳԵՆՈՄԻ ՔԱՐՏԵԶԱՎՈՐՈՒՄ

Ժառանգական նյութի և ինֆորմացիայի քարտեզավորումը սկսվել է գենետիկական հետազոտությունների վաղ շրջանում և անցել է մի շարք փուլերով: Սկզբնական հետազոտություններում աշխատանքները ուղղված էին ֆիզիկական քարտեզավորման խնդրին: Ուստի հետազոտությունների թիրախ էին քրոմոսոմները կամ դրանց որոշակի հատվածները: Առաջին ֆիզիկական քարտեզը ստեղծվեց քրոմոսոմների հատվածների տարատեսակ ներկման միջոցով: Այս քարտեզները բացահայտեցին ամեն քրոմոսոմի կազմում քրոմատինի կազմակերպման յուրահատուկ պատկերը: Գենոմի երկրորդ ֆիզիկական քարտեզները կառուցվեցին ռեստրիկտազների օգտագործմամբ և բացահայտեցին ռեստրիկցիայի սայտերի յուրահատուկ բաշխումը տարբեր քրոմոսոմներում: Երրորդ մակարդակի քարտեզավորումը կատարվել է գենոմի կլոնների գրադարանների ստեղծման միջոցով: Չորրորդ մակարդակի քարտեզը գենոմի նուկլեոտիդային

հերթականությունն է: Բացի ֆիզիկական քարտեզավորումից՝ կատարվել է նաև գենետիկական քարտեզավորում, որի խնդիրն է գտնել գենոմում կոնկրետ գենի կամ գենետիկական նշադրի տեղը արդեն հայտնի գեների կամ մարկերների հետ համադրման և ժառանգման պատկերների վերլուծման միջոցով: Այսպիսի քրոմոսոմային քարտեզներ ստեղծվել էին մի շարք տեսակների համար՝ կրոսինգովերի հաճախականությունների պատկերով: Գենոմի ընթերցման գործընթացին զուգահեռ կատարվել է նաև դրա գենետիկական քարտեզավորման աշխատանքը: Սկզբնական շրջանում բազմաթիվ ընթերցվող հատվածների համադրման ընթացքում փնտրվում էին յուրահատուկ հերթականություններ, որոնք որպես նշադիրներ ապահովում էին ընթերցված հսկա հատվածների կարգավորումը և առանձին սայտերի ճանաչելիությունը: 90-ական թվականներին՝ աշխատանքի սկզբում, գտնում էին, որ մարդու գենոմը կազմված է առնվազն 100 000 գեներից: Գեների բացահայտման համար սկզբում օգտագործվում էին տրանսկրիպցիայի ինիցիացիայի և տերմինացիայի կոդոնները, իսկ ավելի ուշ՝ նաև պրոմոտորներին բնորոշ հատուկ հերթականությունները: Հետազոտությունների ընթացքում բացահայտվեց, որ գենոմի մեծ մասը կազմում են չկոդավորող հերթականությունները, որոնց զգալի մասը հաճախ կրկնվող են և կամ սատելիտային կրկնվող հերթականություններ են, կամ ԳՇԷ-ներ՝ տրանսպոզոններ և ռետրոտրանսպոզոններ: Բավականին արագ բացահայտվեց նաև, որ բջջի գենոմը առաջացնում է սահմանափակ քանակությամբ հասուն իՌՆԹ-ներ: 90-ական թվականներին դասական գենետիկայի մեթոդներով արդեն կազմվել էին մարդու և որոշ այլ տեսակների քրոմոսոմային քարտեզները: Համադրելով քրոմոսոմային քարտեզները գենոմի ընթերցված հատվածների հետ գիտնականները, օգտագործելով մոլեկուլային հիբրիդացման համար արդեն սինթեզված կԴՆԹ-ները, կարողացան բացահայտել ոչ միայն գեների լոկալիզացիան գենոմում, այլև գեների ինտրոնային չկոդավորող հատվածները և կարգավորիչ տարրերը (նկ. 6.29):

! Ճ

u- - ---- ----

---------------L .iար,6 հաtո1ա6uեր,t, կար,զաt.jոր,ոul

ll

Նկ. 6.29. Կարճ հատվածների համադրման եղանակով սպլայսինգի և գեների էքսպրեսիայի պատճառների բացահայտումը իՌՆԹ-ների օգտագործման միջոցով. A - իՌՆԹ, B - գենոմի հատվածը (G. Ning, X. Cheng, P. Luo, F. Liang, Z. Wang, G.Yu, 2017):

Կատարվող աշխատանքների արդյունքում, արդեն 2009 թվականին, մարդու գենոմում քարտեզավորվել էր մոտ 23 000 գեն: Նշենք, որ ամեն տարի աշխարհի տարբեր երկրների գիտնականները հաղորդում են նոր գեների կամ գենանման հատվածների բացահայտման մասին: Գենային ինժեներիայի մեթոդների օգտագործումը նպաստեց գեների ճանաչման և քարտեզավորման գործընթացի արագացմանը: Օգտագործելով ՊՇՌ-ում ճշգրիտ կազմված պրայմերներ կամ in situ հիբրիդացման զոնդեր հնարավոր է ստանալ լավ նշադիրներ ԴՆԹ-ի մեծ հատվածների համար: Նշադրման պրոցեսի կարգավորման նպատակով կիրառվում է «ԴՆԹ-ի սանրման» մեթոդը՝ 10 000 զ.ն. երկարությամբ հատվածներ պարունակող լուծույթի մեջ ներդրվում է բազմալիզինով մշակված կրող տարր: Կրող տարրի դանդաղ՝ 0,3 մմ/վ արագությամբ հեռացման ժամանակ ԴՆԹ-ները դասավորվում են

կրող տարրի վրա զուգահեռ և հեշտ են նշադրվում: Քրոմոսոմների նշադրման համար կիրառվում է ներկման 24 գույնանի FISH մեթոդը: Գենոմային հետազոտությունների ժամանակ հայտնաբերվել են 100-ից մինչև 500 զ.ն. կազմված և գենոմի որոշակի սայտում գտնվող յուրահատուկ չկրկնվող հերթականություններ՝ sequence tagged site (STS): Համարվում է, որ դրանք չեն պարունակում կրկնվող հերթականություններ: Այդպիսի սայտերը անջատվում են գենային գրադարանի մեծ հատվածներից: Մի քանի այդպիսի նշադրող հերթականությունների օգտագործմամբ հնարավոր է ստեղծել պրայմերներ և որոշել դրանց դասավորությունը գենոմում: ՊՇՌ-ից ստացված հատվածների չափսը համապատասխանում է դրանց հեռավորությանը ԴՆԹ-ի մոլեկուլում: Բացի դրանից գրադարաններում կարող են հայտնաբերվել մեծ հատվածներ, որոնք պարունակում երկու կամ ավելի ԴՆԹ նշադիր: Քարտեզավորման ներկակայացվող մեթոդի աշխատանքային փուլերի սխեման ներկայացվում է նկար 6.30-ում: Գենոմի հետազոտման աշխատանքները շարունակվում են «Մարդու գենոմ» և «Էնկոդե» ծրագրերի ավարտից հետո: Հայտնի է, որ մինչև վերջին ժամանակները տարբեր ռասսաների և ժողովուրդների գենոմների ուսումնասիրությունների արդյունքում բացահայտվել է մարդու գենոմի ընդհանուր պոլիմորֆիզմի աննշան չափը: Այսինքն՝ ենթադրվել է, որ մեկ մարդու գենոմը մյուսի գենոմից տարբերվում է միայն մուտացիաներով և կետային պոլիմորֆիզմով առաջացվող բազմազանությամբ: Բայց ժամանակակից մարդու էվոլյուցիայի պրոցեսների և նախնիների գենոմների հետազոտությունների արդյունքում գիտնականները աֆրիկյան որոշ երկրների բնակիչների գենոմներում հայտնաբերեցին մեծ ԴՆԹ-հատվածներ, որոնք բացակայում են այլ վայրերում բնակվող մարդկանց գենոմում: Նման պատկեր է բացահայտվել նաև Նոր Զելանդիայի և Ավստրալիայի բնիկ ժողովուրդների գենոմների կազմում: Ստացված տվյալների համաձայն՝ Խաղաղ օվկիանոսի ժողովուրդների գենոմում մեծ է նեանդերտալացիների և դենիսովյան մարդու գենոմների մասնակցությունը: Իսկ Աֆրիկայի հարավում և կենտրոնում բնակվող ժողովուրդների գենոմում առկա են հատվածներ, որոնք չեն հանդիպում այլ ժողովուրդների մոտ:

.·~ր·

Շ O

ՃB

5I 5 րա րtոliզր

• • •TAՇՇՇATՇՇATՇՇՇՇA • • •

Uilրր112ա~ան 'lնթ-~ հtրրա~աUոLl'յոLU

Ըն,նո'i~ !2արlU1l:iգաLtորl նան նtնl:iնա

Գ

ԾԷ

ո 0 I

FՇ

ՇH

oO'f5o

Uոո զl!l(Hjոր\

Ul աl'\հրuեր

•

.Cեոոզl!1Ulj1'11\ Ul այ հ..րuեր

------------------Ճ8

C Ծ

·- - - - - -

·- - - - - - · ·- - - - - - · 6 QUl')հաuոր հաl!lljա6uեր

Utlրոր\ 2ակաC, 'lulo լiաu l'\րա uե6 հաl!lljա6o ՀԾո12ր հաl!lljա6uերհ հաljLUl)ա6ո

2 QUl')հաuոր հLUl!l~ա6C,եո

Նկ. 6.30. Գենոմի քարտեզավորման փուլերի հակիրճ սխեմա: Հաջորդական փուլերի արդյունքում առանձին կտրտված և նշադրված հատվածները դասավորվում են կոնտինգների առաջացման միջոցով որոշակի հերթականությամբ և վերականգնվում է ԴՆԹ շղթայի բնական կազմությունը (http://propionix.ru/sekvenirovaniye-i-ptsr):

Ներկայացվող գենոմային պատկերը թույլ է տալիս նորովի գնահատել մարդկության էվոլյուցիոն զարգացման փուլերը և Երկրագնդի վրա մարդու տարածման հոսքերը (http://www.sbras.info/articles/ simply/po-sledam-genomov, http://academcity.org/content/po-sledam-geno mov, http://www.sbras.ru/HBC/hbc.phtml?41+832+1):

6.12. ՍԵԿՎԵՆԱՑՄԱՆ ՆՈՐ ՍԵՐՆԴԻ ՏԵԽՆՈԼՈԳԻԱՆԵՐԻ

ՕԳՏԱԳՈՐԾՄԱՆ ԲՆԱԳԱՎԱՌՆԵՐԸ

NGS և հաջորդ սերնդի սեկվենատորների բարձր արդյունավետությունը և ճշգրտությունը առաջացրեցին հեղափոխություն գիտական և բժշկագիտական հետազոտություններում: Այդ մեթոդների շնորհիվ հնարավորություն ստեղծվեց կատարել նախկինում անհնար բազմաթիվ հետազոտություններ, ձևավորվեցին գիտության նոր բնագավառներ՝ ընդհանուր գենոմիկա, համեմատական գենոմիկա, էվոլյուցիոն գենոմիկա, պրոտեոմիկա, թռիչքային զարգացում ստացավ կենսաինֆորմատիկան: Նոր տեխնոլոգիաները թույլ տվեցին հետազոտություններ կատարել մի շարք բնագավառներում. 1. Գենոմի ամբողջական վերլուծություն կամ գենոմի de novo հետազոտություն բժշկագիտական նպատակներով: Բացի դրանից՝ կատարվեցին նախկինում չհետազոտված վիրուսների, բակտերիաների, արխեյների, սնկայինների և կենդանիների ու բույսերի գենոմների հետազոտություններ: Աշխատանքներն ուղղված են և զուտ գիտական, և բժշկագիտական խնդիրների լուծմանը: 2. Գեների ակտիվության որակական և քանակական վերլուծություն ՌՆԹ-ի սեկվենացման (RNA-Seq) եղանակով: Հնարավորություն է ստեղծվել գնահատել ինչպես կոդավորող, այնպես էլ կարգավորիչ ՌՆԹ-ի էքսպրեսիայի մակարդակները, գնահատել գենոմի աշխատանքը՝ գեների ակտիվության կարգավորման եղանակները տարբեր հյուսվածքների բջիջներում և օնտոգենետիկ զարգացման տարբեր փուլերում: 3. Մետագենոմային սեկվենացում՝ տարբեր նմուշներում միկրոօրգանիզմների բազմազանության վերլուծություն, որը թույլ է տալիս հետազոտել միկրոբային և բակտերիական բազմազանությունը տարբեր միջավայրերում՝ մարդու ստամոքսաաղիքային համակարգում, տաք աղբյուրներում, ծովի հատակում և այլն: 4. Հետազոտել ԴՆԹ - սպիտակուց փոխազդեցությունները՝ (ChIP-Seq): Գեների էքսպրեսիայի մակարդակի վրա տրանսկրիպցիայի գործոնների և ԴՆԹ կապող այլ սպիտակուցների ազդեցության

վերլուծությունը, դրանց ֆունկցիան տարբեր բջիջների, օրգանների և հյուսվածքների ֆենոտիպային և ֆիզիոլոգիական առանձնահատկությունների ձևավորման պրոցեսում: 5. RRBS՝ բիսուլֆիդային սեկվենացումը և դրա մոդիֆիկացիաները: Կիրառվում են գենոմի կամ դրա առանձին հատվածների մեթիլավորման մակարդակի գնահատման համար: Հետազոտությունը թույլ է տալիս բացահայտել գենոմի կարգավորիչ հատվածների մեթիլավորման ազդեցությունը գեների էքսպրեսիայի մակարդակի վրա տրանսկրիպցիայի գործոնների ակտիվության կարգավորման միջոցով: 6. Տարգենտային (էքզոնային, միտոքոնդրիումների գեների, ամպլիկոնների) սեկվենացում: Հատուկ, նպատակային եղանակով ընտրված որոշակի գեների՝ միտոքոնդրիումի սպիտակուցների, կամ նշանակալի ազդեցություն առաջացնող ֆերմենտների ու հորմոնների, կամ ուռուցքների գեների որոշակի էկզոնների սեկվենացում, որը թույլ է տալիս, խուսափելով մեծ ծախսերից, կատարել բազմաքանակ հետազոտություններ: HLA՝ ՀՀԳՀ-ի տիպավորումը ժամանակակից սեկվենատորների կիրառմամբ Տարգետային սեկվենացման մեթոդը կիրառվում է բժշկական հետազոտություններում՝ ՀՀԳՀ-ի գենային լոկուսների թեստավորման համար: ՀՀԳՀ համալիրը մարդու հիստոհամատեղելիության գլխավոր համալիրն է, որի գեներով կոդավորվող ռեցեպտորները ապահովում են նաև իմունային բջիջների՝ օտարը սեփականից տարբերակելու ֆունկցիան: HLA տիպավորումը պարտադիր է օրգանների փոխպատվաստման, հղիության ընթացքի վերահսկման, աուտոիմուն հիվանդությունների ախտորոշման դեպքում: Ի տարբերություն տիպավորման այլ մեթոդների՝ սերոլոգիական հետազոտություններ, սեկվենացում Սենգերի մեթոդով, SSP՝ sequence-specific primers և SSO՝ sequence-specific oligonucleotides տիպավորումը NGS-մեթոդների ապահովում է ՀՀԳՀ-ի գեների ամբողջական հերթականության ըն582

թերցում, այսինքն՝ ամբողջական մանրամասն պատկերի բացահայտում: Omixon ֆիրմայի Holotype HLA հավաքածուն թույլ է տալիս ոչ միայն ամբողջովին սեկվենացնել ՀՀԳՀ համալիրի բոլոր գեները, այլև ճշգրիտ մեկնաբանել ստացված արդյունքները: Հավաքածուն կազմված է նմուշների նախապատրաստման համար անհրաժեշտ բոլոր նյութերից, պարունակում է նաև բոլոր ժամանակակից NGS սեկվենատորներում օգտագործվող HLA Twin ծրագրային ապահովումը (նկ. 6.31):

Նկ. 6.31. HLA Twin ծրագրային ապահովման ֆունկցիաները և աշխատանքային ծրագրերը (https://www.dia-m.ru/news/hla-tipirovanie-ngs-s-naborami-omixon/):

Վերջին սերնդի սեկվենատորների թվին են պատկանում նկար 6.32-ում ներկայացվող տարբերակները. 1. Ամբողջական գենոմը ընթերցող NGS- սեկվենատոր DNBSEQG50 (MGISEQ-200): 2. Ամբողջական գենոմը ընթերցող NGS-սեկվենատոր DNBSEQT7:3: 3. PyroMark Q48 Autoprep սեկվենատոր: 4. Կապիլյարային SeqStudio (Applied Biosystems): 5. Illumina, Inc. ֆիրմայի HiSeq 3000 սեկվենատոր:

6. Mk1C Capex, Oxford Nanopore Technologies: 7. MinION Oxford Nanopore Technologies:

Նկ. 6.32. Ստացիոնար և շարժական տարբեր տեխնոլոգիաներով աշխատող վերջին սերնդի սեկվենատորներ (https://www.medicalexpo.ru/prod/illumina-inc/product-83632-604825.html, https://www.medicalexpo.ru/prod/illumina-inc/product-83632-761743.html, https://www.dia-m.ru/catalog/lab/sekvenatory-belkov-dnk/sekvenatory-dnk-posengeru/, https://www.helicon.ru/catalog/oborudovanie/sekvenirovanie/, https://www.dia-m.ru/catalog/lab/sekvenatory-belkov-dnk/sekvenatory-dnk-3-gopokoleniya, https://www.dia-m.ru/catalog/lab/sekvenatory-belkov-dnk/sekvenatorydnk-3-):

ԳՐԱԿԱՆՈՒԹՅՈՒՆ

1. Զորանյան Վ.Ա., Սահակյան Ա.Ջ., Բալասանյան Դ.Ս., Մելքոնյան Լ.Մ. Բջջային իժեներիան կարտոֆիլի վիրուսազերծ տնկանյութի արտադրության տեխնոլոգիայում. - Եր.: ՀՊԱՀ, 2007. - 18 էջ: 2. Մելքոնյան Լ.Մ. Կենդանիների գենետիկա. - Հ. 1: Ընդհանուր գենետիկա. - Եր.: ՀԱԱՀ, 2016. - 278 էջ: 3. Մելքոնյան Լ.Մ. Կենդանիների գենետիկա. - Հ. 2: Անասնաբուժականգենետիկա. - Եր.: ՀԱԱՀ, 2016. - 389 էջ: 4. Азеведо Л. и др. Эпистатические взаимодействия модулируют эволюцию компонентов митохондриального респираторного комплекса млекопитающих. ВМС Геномика 10: 266. - 2009. 5. Азокар Дж., Клавихо О.П., Юнис Э.Дж. Гены MHC класса II в клиренсе вируса HCV у латиноамериканских пациентов, инфицированных гепатитом С. Хум Иммунол . 2003 г.; 64: 99–102. 6. Аксельсен Н., и др. Руководство по количественному иммуноэлектрофорезу (методы и применение), пер. с англ. - М., 1977. 7. Александр П. Введение определения флуоресценции, Springer, 2008. 8. Антонова О.С., Корнева Н.А., Белов Ю.В., Курочкин В.Е., Эффективные методы выделения нуклеиновых кислот для проведения анализов в молекулярной биологии (обзор), 2010. 9. Антонова О.С., Рудницкая Г.Е., Тупик А.Н., Буляница А.Л., Евстрапов А.А., Курочкин В.Е. Полимеразная цепная реакция, приборная и методическая реализация. Обзор аналитических характеристик. Научное приборостроение, 2011, том 21, № 4, c. 5–21. 10. Анцилевич Л.М., Ягудина Л.А. Практическое применение иммуноферментного анализа в диагностике заболеваний. – Казань: Казанская государственная медицинская академия, 2014. 11. Арбер У., Линн С. (1969). Модификация ДНК и рестрикция // Ежегодный обзор биохимии. 38: 467-500. 12. Аукенов Н.Е., Масабаева М.Р., Хасанова У.У. Выделение и очистка нуклеиновых кислот. Состояние проблемы на современном этапе // Наука и здравоохранение. - №1. - Государственный медицинский университет, 2014. 13. Баркова И.А., Барков А.М., Викторов Д.В. Метод иммуно-ПЦР в диагностике бактериальных и вирусных инфекций. - Волгоградский научноисследовательский противочумный институт, 2019. 14. Баррангу Р., Фремо С., Дево Х., Ричардс М., Бояваль П., Муано С. и др. "CRISPR обеспечивает приобретенную устойчивость прокариот к вирусам". Наука. 315 (2007).

15. Барретт А.Н., Читти Л.С., Разработка неинвазивной диагностики моногенных заболеваний: роль цифровой ПЦР. Методы мол. биол. 215-28. - 2014. 16. Батанова Т. и др. // Фаговый дисплей на основе нитчатых бактериофагов: применение для отбора рекомбинантных антител. Мол. генет. микробиол. вирусол. 2006. 17. Бахлаев И.Е., Ястребова А.В. и др. Оценка онкомаркеров у больных колоректальным раком // Онкохирургия. - 2012. - Т. 4. - №2. - С. 22 18. Белов Д.А., Белов Ю.В., Курочкин В.Е. Новая методика обработки флуоресцентного отклика плавления ДНК. Научное приборостроение, 2018, т. 28, № 1, c. 3-10. 19. Бельмонте Ф.Р. и др. Методы цифровой ПЦР повышают чувствительность обнаружения и точность измерения делеций мтДНК с низким содержанием. 2016. 20. Бикбулатова С.М., Чемерис Д.А., Никоноров Ю.М., Машков О.И., Гарафутдинов Р.Р., Чемерис А.В., Вахитов В.А. Способы детекции результатов полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. - Уфа: Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра, 2012. 21. Бренан К. , Моррисон Т. Высокопроизводительная количественная ПЦР в нанолитрах. Препарат Discov Today Technol, 2005. 22. Бурникель А.А., Бикл Т.А. "Комплексные ферменты рестрикции: молекулярные двигатели, управляемые NTP". Biochimie. 84 (11). 2002. 23. Ванбруховен К., Рингаерт А., ВаттиоП., Де Мот Р., Спрингаэль Д., Разнообразие Acinetobacter в образцах окружающей среды, оцененное с помощью ПЦР-DGGE-дактилоскопии гена 16S рРНК. FEMS Микробиология Экология. - Том 50. - Вып. 1. - 2004 г. - С. 37–50. 24. Вельве-Каскильяс Г., Ле Берр М. и др., Микрофлюидные инструменты для биологических исследований клеток, j.nantod. 5(1), 28-47, 2009. 25. Воробьева Е.В. Физико-химические методы анализа в биохимии. Тексты лекций. - Гомель, Гомельский государственный университет имени Франциска Скорины, 2005. 26. Галл Дж.Г., Пардью М.Л. Молекулярная гибридизация радиоактивной ДНК с ДНК цитологических препаратов // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1969. - Т. 64. - С. 600-604. 27. Данна К., Натанс Д. (декабрь 1971). Специфическое расщепление ДНК вируса обезьян 40 эндонуклеазой рестрикции Hemophilus influenzae // Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 68 (12): 2913. 28. Да Сильвия Х., Минк Крисанна М., Bordetella pertussis и коклюш. Инфекционные заболевания Неттера. - 2012. - С. 11-14.

29. Дедов И.И. Диагностика заболеваний щитовидной железы. - М.: ВидарМ, 2013. 30. Дедов И.И., Мельниченко Г.А., Пронин В. Клиника и диагностика эндокринных нарушений. - М.: Триада, 2006. 31. Дедов И.И., Петеркова В.А. Детская эндокринология: руководство для врачей. - М., 2008. 32. Джексон Т.К., Патани Б.О., Экпа Д.Е. Нанотехнологии в диагностике. 2017. 33. Джон Д.В. , Миллер Л.Л. Регуляция чистого биосинтеза альбумина сыворотки и белков острой фазы плазмы: индукция усиленного чистого синтеза фибриногена, α1-кислоты // Журнал биологической химии. – 1969. 34. Дубаниевич А. Иммуногенный белок теплового шока Mycobacterium tuberculosis при туберкулезе // Биология, медицина ID корпуса. - 2000 . 35. Дхазе П., де Греве А., Декремер Х., Джефф Шелл, Марк Ван Монтегю. Быстрое картирование мутаций вставок и делеций транспозонов в больших Ti-плазмидах Agrobacterium tumefaciens // Исследование нуклеиновых кислот. Т. 7, вып. 7. - 1979. - С. 1837–1849. 36. Зипаев Д.В., Тулина А.А., Кожухова А.Н. Использование метода капиллярного электрофореза в оценке пищевых продуктов и напитков // Вестник ВГУИТ. - 2020. - Т. 82. - № 1. - С. 82-87. 37. Жебентяев А.И., Каткова Е.Н. Иммуноферментный метод анализа // Научные публикации. Вестник фармации. - №2 (60). - 2013. 38. Ильичев А. и др. // Доклады АН СССР. - 1989. - Т. 307. - С. 481-483. 39. Кобаяши И. Поведение систем рестрикции-модификации как эгоистичных мобильных элементов и их влияние на эволюцию генома // Исследование нуклеиновых кислот. 29 (18). 2001. 40. Кай Хи, Касвелл Дж.Л., Прескотт Дж.Ф. Некультурные молекулярные методы диагностики бактериальных заболеваний у животных: перспектива диагностической лаборатории". Ветеринарная патология. 51 (2): 341–50. 41. Калашникова, Л. и др. Племресурсы быков-производителей голштинской породы / Л. Калашникова, А. Тинаев, Т. Ганченкова // Молочное и мясное скотоводство. - 2009. - № 3. - С. 4-6. 42. Каллиониеми О.П., Каллиониеми А., Судар Д., Рутовиц Д., Грей Дж.В., Уолдман Ф. и Пинкель Д. Сравнительная геномная гибридизация для молекулярно-цитогенетического анализа солидных опухолей // Наука 258. 1992. - С. 818–821. 43. Каллиониеми, О.П., Каллиониеми, А., Пайпер, Дж., Изола, Дж., Уолдман, Ф.М., Грей, Дж.В. и Пинкель, Д. (1994) Оптимизация сравнительной

геномной гибридизации для анализа изменений числа копий последовательности ДНК в солидных опухолях // Гены. Хромосомы. Рак 10. - С. 231-243. 44. Карапетян О.Ш., Вечканов Е.М., Сорокина И.А. Учебно-методическое пособие к проведению лабораторных работ и контроля самостоятельной работы студентов по молекулярной биологии Академии биологии и биотехнологии ЮФУ. - Ростов- на-Дону: Изд-во ЮФУ, 2015. - 100 с. 45. Каюмов А.Р., Гимадутдинов О.А. Практикум по молекулярной генетике. Учебно-методическое пособие. - Казань: КФУ, 2016. 46. Квон, М.М. Вацек, Дж. Зейн, К.Л. Хоппел и Д.С. Керр. Новая мутация в гене митохондриального трназера (AGY), связанная с митохондриальной миопатией, энцефалопатией и дефицитом комплекса I. J Med Genet. 43(9): 10.1136/jmg. 2005. 47. Кибанов М. http://genschool.ru/wadata/public/site/1.8_ Cytogenetics_FISH_KibanovMV.pdf 48. Ким, Х.Дж., Маккой, М., Джи, С.Дж., Гонсалес-Сапиенца, Г.Г., Хаммок, Б.Д. (2011). Неконкурентный фаговый антииммунокомплекс, полимеразная цепная реакция в реальном времени для чувствительного обнаружения малых молекул // Аналитическая химия 83, С. 246-253. 49. Ким, Х.Дж., Россотти, М.А., Ан, К.К., Гонсалес-Сапиенца, Г.Г., Джи, С.Дж., Маскер, Р. и Гаммок, Б.Д. (2010). Развитие неконкурентного фагового антииммунокомплекса. Анализ на бромированный дифениловый эфир 47 // Аналитическая биохимия 401, С. 38-46. 50. Киселева Я.Ю., Птицин К.Г., Радько С.П.,. Згода В.Г, Арчаков А.И. Цифровая капельная ПЦР – перспективный технологический подход к количественному профилированию микро-РНК, Москва, 2016. 51. Кишкун А.А. Иммунологические исследования и методы диагностики инфекционных заболеваний в клинической практике. - Медицинское информационное агентство, 2009. 52. Колтовая Н.А. Руководство к практическим занятиям по молекулярной биологии: учебное пособие для студентов. - Дубна, 2010. 53. Кондратова В.Н., Ботезату И.В., Шелепов В.П., Лихтенштейн А.В., НИИ канцерогенеза ФГБУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина Минздрава России. Выявление мутаций в горячих участка х-генома: 2017. 54. Костюнина О.В. Влияние генотипов по ДНК-маркерам на показатели молочной продуктивности коров чёрно-пёстрой породы / О.В. Костюнина, A.M. Бакай, Г.А. Бушова, Т.В. Лепехина, Е.А. Гладырь // Достижения науки и техники АПК. - 2011. - № 10. - С. 33-34.

55. Кройц Дж.Э., Мансон Т., Хьюн Т., Шен Фэн и др. Теоретический дизайн и анализ многообъемных цифровых анализов с широким динамическим диапазоном, подтвержденных экспериментально с помощью микрофлюидной цифровой ПЦР. 2011. 56. Кулмамбетова Г. Современные проблемы биологии. - Астана, ЕНУ, 2012. 57. Курбаков К.А., Минаев М.Ю. Применение метода анализа плавления высокого разрешения (HRM) для видовой идентификации и дифференциации L. SAKEI и L. CURVATUS. ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности им. В.М. Горбатова». - М., 2016. 58. Курынин Р.М. Достижения отечественной молекулярной генетики для клинической онкоурологии // Урология сегодня. - 2009. - № 4. - С. 17. 59. Кутлунина Н.А., Ермошин А.А. Молекулярно-генетические методы в исследовании растений. Учебно-методическое пособие // Экология и природопользование. - Екатеринбург: изд. Уральского университет, 2017. 60. Леммли. Расщепление структурных белков при сборке головки бактериофага. - Т. 4. - Природа 227 (5259): 680-5. 1970. 61. Ли Х. и Гомер Н. (2010). Обзор алгоритмов выравнивания последовательностей для секвенирования следующего поколения. Брифинги по биоинформатике, 11, 473-483. 62. Лисицын Н.А., Чёрный А.А., Никитина И.Г., Карпов В.Л., Берестень С.Ф. Методы иммуноанализа белков. - Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, 2014. – Т. 48. - № 5. - 2014. - С. 718–727. 63. Луговской А.А., Большаков Д.С., Никешина Т.Б. Разработка и валидация методики определения антибиотиков фторхинолонового ряда в куриных яйцах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Ветеринария сегодня. - 2016. 64. Маджумдар Н., Вессель Т., Маркс Дж. Цифровое моделирование ПЦР для максимальной чувствительности, динамического диапазона и точности измерений, 2015. 65. Мазутис Л., Гилберт Дж., Унг В.Л. , Вайц Д.А., Гриффитс Э.Д. , Хейман Дж. Анализ и сортировка отдельных клеток с использованием микрофлюидики на основе капель. Проток 8(5):870-91.10.1038/ Epub, 2013. 66. Марахонов А.В. Лекция 13. Молекулярно-биологические методы. https://mipt.ru/dbmp/upload/6b0/lection13-arphlgocd8m.pdf 67. Мешавска А.Дж., Малдер В.Дж., Файад З.А., Кормод Д.П. Многофункциональные наночастицы золота для диагностики и терапии заболеваний. Мол. фармацевт. 10, 831–847. 2013.

68. Миньженкова М.Е. Метафазная сравнительная геномная гибридизация в диагностике хромосомного дисбаланса. Диссертация, 2014. 69. Миронова Л.В., Афанасьев М.В., Балахонов С.В. Применение технологии пульс-электрофореза в молекулярном типировании возбудителей особо опасных инфекций // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. № 3. - 2015. 70. Муртола М., Венска М., Стремберг Р. Пназимы, которые являются искусственными ферментами рестрикции РНК // Журнал Американского химического общества. 132 (26): 2010 71. Насонова Е.С. Пульс-электрофорез: теория метода, инструментальный арсенал и области применения. Цитология. 2008; 50 (11): 927-35. 72. Никитина И.Г., Сабирова Е.Ю., Солопова О.Н., Суржиков С.А., Гринева Е.Н., Карпов В.Л., Лисицын Н.А., Берестень С.Ф. Новый формат иммуно-ПЦР для сывороточной диагностики рака толстой кишки. - М., 2014. 73. Никитина Д.И., Маретина М.А.1,2, Егорова А.А., Масленников А.Б., Киселев А.В. Использование высокоразрешающего анализа кривых плавления ДНК в диагнос тике наследственных заболеваний // Медицинская генетика. 2017. 15. 74. Овчинников В.Ю. МикроРНК трематод семейства Opisthorchiidae. Диссертация, 2017. 75. Зорина В.В. Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР). Методическое пособие. - М., 2012. https://dna-technology.ru/sites/ default/files/pcr_a5_ 083-4.pdf 76. Певзнер П.А., Бородовский М.Ю., Миронов А.А. (1989). Лингвистика нуклеотидных последовательностей. I: Значимость отклонений от средних статистических характеристик и предсказание частот встречаемости слов. Биомол. Структура Дин., 6 , 1013–1026. 77. Пингуд А., Ельч А. Структура и функция эндонуклеаз рестрикции II типа // Исследование нуклеиновых кислот. - 29 (18) 2001. 78. Пинкель Д. и др. Анализ вариации числа копий ДНК с высоким разрешением с использованием сравнительной геномной гибридизации с микрочипами. - Природа, 1998. 79. Попов А.Н., Зиновьева Н.А., Полежаева В.А., Игнатьев В.М., Брем Г. Скрининг гена BLAD-синдрома у животных черно-пестрого корня // Ветеринарная медицина. - 2000. - № 3. - С. 59–61. 80. Пругло Г.Ф., Фёдорова О.В., Смит Р.А. Хроматографические методы анализа [Электронный ресурс]: учебное пособие. - С-Пб., 2017. - 85 с.

81. Революция в биотехнологии с помощью искусственных рестрикционных ферментов // Новости генной инженерии и биотехнологии (отчет о программируемых искусственных рестрикционных ферментах, управляемых ДНК), 2017. 82. Роджерс С.О., Бендич А.Дж. Экстракция ДНК из миллиграммов свежих, гербарных и мумифицированных тканей растений. Молекулярная биология растений, 5(2): 69-76, 1985. 83. Роме Д., Фокс Х., Херрманн Б. Молекулярные клоны Т-комплекса мыши, полученные из микрорассеченных метафазных хромосом. Cell, 1984, 36: 783. 84. Рязанцев Д.Ю., Воронина Д.В., Завриев С.К. Иммуно-ПЦР: достижения и перспективы // Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова. – М., 2016. 85. Сайки, Р.К. Новый метод обнаружения полиморфных сайтов рестрикции путем расщепления олигонуклеотидных зондов - применение к серповидно-клеточной анемии // Биотехнология, 3: 1008 (1985). 86. Самойленков П.В. Принципы иммуноферментного анализа, основные виды ИФА, применение в диагностике. - Москва, 2009, РГМУ. 87. Свободова И. и др. Эффективность капельной цифровой ПЦР при неинвазивном генотипировании RHD плода - сравнение с рутинным подходом, основанным на ПЦР в реальном времени. 2015. 88. Систла С., Рао Д.Н. S-аденозил-L-метионинзависимые ферменты рестрикции // Критические обзоры по биохимии и молекулярной биологии. 39 (1): 1–19. 2004. 89. Солинас, Браун Л. Дж., МакКин С., Меллор Дж. М., Никол Дж., Телвелл Н., Браун Т., Дуплексные праймеры Скорпиона в анализе SNP и приложениях FRET, Нуклеиновые кислоты Res, 2001 г. 90. Сомма. М. ВОЗ. Европейское региональное бюро. сессия 4. 91. Стручкова И.В., Кальясова Е.А. Теоретические и практические основы проведения электрофореза белков в полиакриламидном геле. Электронное учебно-методическое пособие. - Нижний Новгород, 2012. 92. Суспицын Е. Н., Научно-популярная брошюра «Наследственные опухолевые синдромы». Научно-исследовательский институт онкологии имени Н.Н. Петрова, С. 27. 2013. 93. Сухоедова А.В., Меньшиков В.В., Технология использования антигенов в производстве тест-систем для иммуноферментного анализа. Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, М., 2016. - Т. 3. С. 35-41.

94. Схоутен Дж.П., МакЭлгунн С.Дж., Ваайер Р., Звейненбург Д., Дипвенс Ф., Палс Г. «Относительная количественная оценка 40 последовательностей нуклеиновых кислот путем мультиплексной амплификации зонда, зависимой от лигирования». Res нуклеиновых кислот. 30 (12), 2002. 95. Такахаши Э., Хори Т., О'Конелл П., Лепперт М., Уайт Р. R-диапазон и неизотопная гибридизация in situ: ценовая локализация коллагена II типа человека (COL2A1) // Гум. Генет. - 1990. - В. 86. - С.14-16. 96. Тизелиус А. Дисс. Изучение электрофореза протеинов с помошью метода движущейся границы // сб. Новые научные достижения упсальскиь ученых. - 1930. 97. Удина, И.Г. Полиморфизм гена пролактина (микросателлиты, ПЦРПДРФ) у крупного рогатого скота / И.Г. Удина, С.О. Туркова // Генетика. 2001. - Т. 37. - С. 511-516. 98. Фелькердинг К.В., Дамес С.А., Дурчи Д.Д., 2010. Диагностическая последовательность следующего поколения. J Mol Diagn. 12 (5): 539–51 99. Фишер, С.Г., Лерман, Л. С. Независимое от длины разделение фрагментов рестрикции ДНК при двумерном гель-электрофорезе // Клетка. 16 (1) 1979. 100. Фогельштейн Б., Кинзлер К. В., Цифровая ПЦР / Биологические науки, 96 ( 16 ) 9236 – 9241, Т. 96 | № 16, 1999. 101. Фогельштейн Б., Пападопулос Н., Велкулеску В.Э., Чжоу Ш. Ландшафты генома рака // Наука. - 2013. 102. Хван И. Вспышки вирусов в химических и биологических датчиках // Исследовательский институт фундаментальных наук Сеульского национального университета. - Сеул, Корея, 2014. - 14 (8). - С. 147-779. 103. Хирш Ф. «Лучшие практики» жидкой биопсии при лечении немелкоклеточного рака легкого. - 2013. 104. Хорват П., Баррангу Р. CRISPR/Cas, иммунная система бактерий и архей // Наука. 2010. 167-170. 105. Хоффманн Й., Троттер М., фон Штеттен Ф., Зенгерле Р. Твердофазная ПЦР в массиве пиковелл для иммобилизации и размещения 100000 продуктов ПЦР на предметном стекле микроскопа. Лаборатория на чипе 12 (17):3049-54, Фрайбург, Баден-Вюртемберг, Германия, 2012. 106. Цымбаленко Н.В. Молекулярная биология. Курс лекций для студентов IV курса факультета биологии РГПУ им. А.И. Герцена. file:///C:/Users/09032020/Downloads/kurs-biotehnologiya-dlya-studentovbiologicheskih-spetsialnostey-universitetov%20(1).pdf

107. Чаван Д., Чен Х., Крам М., Ву Б., Сафари М., Смит М., Векилов П., Конрад Дж. К., Куренци К., Уилсон Р. Нейтральные наночастицы ДНКавидина как сверхчувствительные репортеры в иммуно-ПЦР. - Аналитик, 2020, 145 (14): 4942-4949. 108. Черношей Д. А., Канашкова Т. А. Методы иммуноанализа, основанные на применении меченых компонентов. Учебно-методическое пособие. - Минск, 2007. 109. Шаффер Л.Г. Сравнительная геномная гибридизация на основе микрочипов (массив CGH) // Журнал молекулярной диагностики, 2006. 110. Шмитген Т.Д., Ливак К.Я. Анализ данных ПЦР в реальном времени сравнительным методом C(T). Нацпротоколы 3(6): 1101-1108, 2008. 111. Эндонуклеазы рестрикции производства New England Biolabs 06.09.2017. 112. Энгвалл Е., Пелманн Р., ван Вимен Б., Шюрс А., Иммуноанализ с использованием антиген-ферментных конъюгатов, Медицина, Химия, Опубликовано в FEBS Letters 24 июня 1971 г. 113. Юльметьева Ю. Ю., Шакиров Ш., Миннахметов А., Фатхутдинов Н. Связь полиморфных вариантов генов молочных белков и гормонов с признаками молочной продуктивности крупного рогатого скота // Молочное и мясное скотоводство. - 2013. - № 7. - С. 23-26. 114. Alexander, P. The Changing Face of Manual Handling in the Community’ British Journal of Community Nursing.13 (7) pp: 316-322. 2009. 115. Ali R. H. et al. Quantitative synteny scoring improves homology inference and partitioning of gene families, BMC Bioinformatics 14(15), 2013. 116. Alric L, Fort M, Izopet J, Vinel JP, Bureau C, Sandre K, Charlet JP, Beraud M, Abbal M, Duffaut M. Изучение факторов, связанных с хозяином и вирусом, связанных со спонтанной элиминацией вируса гепатита С. Тканевые антигены. - 2000. - 56 : 154–158. 117. Arevalo FJ, Gonzalez-Techera A., Массачусетс, et al. Сверхчувствительный электрохимический иммуносенсор с использованием анализируемых пептидомиме-тиков, выбранных из библиотек пептидов фагового. дисплея. 2012 , 32, 231–237. 118. Ayriss J., Valero R., Bradbury A. Methods mol. Biol. 2009. V. 525. P. 241–260. 119. Azzazy H., Highsmith W. // Clin. Biochem. 2002. V. 35. P. 425–445. 120. Barrett S., Ryan E., Crowe J. Association of the HLA-DRB*01 allele with spontaneous viral clearance in an Irish cohort infected with hepatitis C virus via contaminated anti-D immunoglobulin// J.Hepatol. - 1999. - Vol. 30(6). - P. 979:83.

121. Bartlett S., Stirling D. A short history of the polymerase chain reaction, Methods in molecular biology, 2003, volume 226, pages 3-6. 122. Beck J., Bierau S., Balzer S., Andag R., Kanzow P., Schmitz J. et al. Digital droplet PCR for rapid quantification of donor DNA in the circulation of transplant recipients as a potential universal biomarker of graft injury. Clin. Chem. 59: 1732-41. 2013 123. Bhatt В., Burns J., Flannery D., McGee О 'D. Direct visualization of single copy genes on banded metaphase chromosomes by nonisotopic in situ hybridization // Nucleic Acids Res. 1988. V. 16. P. 3951-3961. 124. Blow, N., Nat. Methods 4, 869–875. 2007. 125. Boom R. , Sol C.J., Salimans M.M. еt al.. Rapid and simple method for purification of nucleic acids - 1990. - http://www.molmeth.org/. 126. Cao L, Cui X., Hu J., Li Z., Choi J. Ru, Yang Q., Lin M., Li Y. H., Xu F., Advances in digital polymerase chain reaction (dPCR) and its emerging biomedical applications, Biosensors and Bioelectronics, journal homepage: 2016. 127. Chen P, Zhang J, Zhou F MiR-499 rs3746444 polymorphism is associated with cancer development among Asians and related to breast cancer susceptibility.Mol Biol Rep. Dec;39(12). 2012. 128. Chen W, Hayward C, Wright AF, Hicks AA, Vitart V, Knott S, et al. Изменение количества копий среди населения Европы. PLoS ONE 6(8): e23087. 2011. 129. Chen Z. Application of digital PCR in detecting human diseases associated gene mutation. Cell Physiol Biochem. 2017; 43(4):1718-1730. 130. Chiu R.W., Poon L.L., Lau T.K., Leung T.N., Wong E.M., Lo Y.M. Effects of blood-processing protocols on fetal and total DNA quantification in maternal plasma. Clin. Chem. 2001; 47: 1607-13. 131. Christian A., McNiel E., Robinson J., Drabek R. Et al., A versatile image analysis approach for simultaneous chromosome identification and localization of FISH probes // Cytogenet Cell Genet 1998 V. 82 P.172. 132. Chudoba I., Senger G., Plesch A., Claussen U. New developments in clinical cytogenetics. // E.C.AS. News Letter. 1999b. N 3. P. 3-6. 133. Claussen U., Lemke J., Michel S., Chudoba I, M?hlig P., Westermann M., Claussen J., Rubtsov N., Grummt U-W., and Liehr T. New concept of chromosome condensation - de-condensation in cell cycle // In preparation. 1994. 134. Commins J. et al. / Biological Procedures Online, 2009. 135. Cotter et al., 1991, (Langer-Giedion syndrome) Cotter FE., Lillington D., Hampton G., Riddle P., Nasipuri S., Gibbons B., Young B.D. // Genes Chromosom Cancer, 1991, v.3, pp. 8-15

136. Davies K. II Nature (London), 1992, p. 95. 137. Debski P.R., Garstecki P., Designing and interpretation of digital assays: Concentration of target in the sample and in the source of sample, Institute of Physical Chemistry, Polish Academy of Sciences, Kasprzaka 44/52, Warsaw 01224, Poland b Curiosity Diagnostics Sp. z o.o. Kasprzaka 44/52, Warsaw 01-224, Poland. 2015. 138. De Mello, A.J., 2006. Nature 442, 394–402. 139. Dong X., Milholland B., & Brief Communications Arising Is there evidence for a limit to human lifespan? arising from J. Vijg Nature 538, 257–259. 2016. 140. Doyle and Doyle, СТАВ-метод выделения ДНК из растений , 198Du Manoir, S. Detection of complete and partial chromosome gains and losses by comparative genomic in situ hybridization / S. Du Manoir, M.R. Speicher, S. Joos et al. // Hum. Genet. – 1993. – Vol. 90. – P. 590-610. 141. Dybus, A. Association of genetic variants of bovine prolactin with milk production traits of Black-and-White and Jersey cattle // A. Dybus, W. Grzesiak, H. Kamieniecki, I. Szatkowska, Z. Sobek, P. Blaszczyk, E. Czerniawska-Piatkowska, S. Zych, M. Muszynska // Arch. Tierz. - 2005. - V. 48, №2.-P. 149-156. 142. Etkins r. et Wallac o., фиа вр 1984. 143. Evans M.I., Wright D.A., Pergament E., Cuckle H.S., Nicolaides K.H. Digital PCR for noninvasive detection of aneuploidy: power analysis equations for feasibility. Fetal. Diagn. Ther. 2012; 31: 244-7. 144. Fanning L.J., Levis J., Kenny-Walsh E., Wynne F., Whelton M., Shanahan F. Viral clearance in hepatitis C (1b) infection: relationship with human leukocyte antigen class II in homogenous population. // Hepatology. – 2000. – Vol. 31(6). – P.1334-7. 145. Fiedler et al., 1991 , Fiedler W., Claussen U., Ludecke H.J., Senger G., Horsthemke B., Geurts Van Kessel A., Goertzen W., Fahsold R. // Genomics, 1991, v. 10, pp. 786-791 146. Fodde, R. & Losekoot, M. Mutation detection by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Hum. Mutat. 3, 83-94, 1994. 147. Freeman J. L. et al., Copy number variation: New insights in genome diversity, m www.genome.org on October 23, 2007 148. Gan S.D., Patel K.R. Enzyme immunoassay and enzymelinked immunosorbent assay // J. Invest Dermatol. - 2013 sep. - Vol. 133 (9). - P. 12. 149. Garrido-Cardenas J.A ., Garcia-Maroto F., Alvarez-Bermejo J.A., ManzanoAgugliaro F., DNA Sequencing Sensors: Sensors (Basel). 17(3):588. 2017. 150. Gerber P. A., Antai A. S, Neumann N. J. et al. Neurofibromatosis II Europ. J. Med. Res., 2009. Vol. 14. P. 102-105.

151. German J., Sanz M. M., Ciocci S. et al. Syndrome-causing mutations of the BLM gene in persons in the Blooms Syndrome Registry II Hum. Mutat, 2007. Vol. 28. P. 743-753. 152. Golan D., Medvedev P. Using state machines to model the Ion Torrent sequencing process and to improve read error rates. Bioinformatics, 2013, vol. 29, no. 13, pp. 344–351. 153. Golijow C.D., Mouron S.A. et al. Differences in K-ras codon 12 mutation frequency between «high riskե and «low-riskե HPV-infected samples // Gynecol. Oncology. - 1999. - 75. - pp. 108-112. 154. Griffiths, A. D. Strategies for selection of antibodies by phage display / A. D. Griffiths, Duncan A. R. ,// Curr. Opin.Biotechnol. – 1998. – Vol. 9, № 1. – pp. 102–108. 155. Grudinina N. A., Golubkov V. I., Tikhomirova 0. S. et al. Prevalence of widespread BRCA1 gene mutations in patients with familial breast cancer from St. Petersburg II Russ J. Genet, 2005. Vol. 41. P. 318-322. 156. Han S.X., Jia X., Ma J.l., Zhu Q. 2009. 157. Hayden R.T., Gu Z., Ingersoll J., Abdul-Ali D., Shi L., Pounds S., Caliendo A.M. Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus. J. Clin. Microbiol. 2013; 51: 540-6. 158. He J., Evers D.L., O’Leary T.J., Mason J.T. Иммунолипосома-ПЦР: универсальная сверхчувствительная система количественного обнаружения антигена, Журнал нанобиотехнологий объем 10, Номер статьи: 26 ( 2012). 159. Heller A., Starke H., Trivonov V., Rubtsov N. Multicolor banding (MCB) of human chromosomes based on region specific YAC clones and/or microdissection libraries // Medgen. 2000. V.12. N.1. P. 9Holland M., Abramson R.D., Watson R., Gelfand D.H. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'®3' exonuclease activity of Thermus aquaticus. 160. Holland M., Abramson R.D., Watson R., Gelfand D.H. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'®3' exonuclease activity of Thermus aquaticus, Proc Natl Acad Sci, США, 15 августа 1991, 88 (16): 7276–7280. 161. Hoffmann, J., Hin, S., Stetten, Fv, Zengerle, R., Roth, G., 2012. RSC Adv. 2, 3885–3889. 162. Huggett J., Nolan T. and Bustin S. A., Guidelines for the Design and Publication of a Reliable Real-time PCR Assay, book-chapter 2013. 163. Human cytogenetics: Nature Reviews Genetic, 769-778 (2002). 164. Idury R.M., Waterman M. S., A New Algorithm for DNA Sequence Assembly, JOURNAL of computational biology, Vol. 2, N 2, 1995.

165. Johnson P.H., Miller M.J., Grossman L.I. (1980) Electrophoresis of DNA in agarose gels. II. Effects of loading mass and electroendosmosis on electrophoretic mobilities. Anal. Biochem., 102(1), 159-162. 166. Kang A., Barbas C., Janda K., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. Vol. 88. 167. Kay B., Winter G., McCafferty J. Phage display of peptides and proteins: a laboratory, XXII. V. 344: 1996. 168. Kim et al., 2009, Фосфорилирование С-концевого домена Rpb1 дрожжей в серинах 2, 5 и 7. J Biol Chem 284(39):26421-6. 169. Kim, H. J., McCoy, M., Gee, S. J., Gonzalez-Sapienza, G. G., Hammock, B. D. Anal. Chem. 2011, 83, 246. 170. Kim, H. J., Rossotti, M. A., Ahn, K. C., Gonzalez-Sapienza, G. G., Gee, S. J., Musker, R., Hammock, B. D. Anal. Biochem. 2010, 401, 38-46. 171. Kirchhoff, M. Automatic correction of the interfering effect of unsuppressed interspersed repetitive sequences in comparative genomic hybridization analysis / M. Kirchhoff, T. Gerdes, J. Maahr et al. // Cytometry. 1997. - Vol. 28. - P. 130-134. 172. Kosyakova et al. Generation of multicolor banding probes for chromosomes of different species, Molecular Cytogenetics 2013. 173. Kupsch J., Tidman N., Kang N., et al. // Clin. Cancer Res. 1999. V. 5. pp. 925-931. 174. Kutyavin I. V., Afonina I. A., Mills A., Gorn V., B. и др, 3'-зонды ДНК, связывающие малую бороздку, повышают специфичность последовательности при температурах удлинения ПЦР. Нуклеиновые Кислоты Res.2000; 28 (2): 655-61. 175. Lakowicz J. R., Principles of Fluorescence Spectroscopy. - Springer Science+Business Media, 2006. 176. Lestou, V.S. Screening of Human Placentas for Chromosomal Mosaicism Using Comparative Genomic Hybridization / V.S. Lestou, B.L. Lomax, I.J. Barrett, et al. // Teratology. - 1999. - Vol. 59. - P. 325–330. 177. Levy S. E., Boone B. E. Next-Generation Sequencing Strategies //Cold Spring Harbor perspectives in medicine. - 2019. - Т. 9. - N. 7. - С. a025791. 178. Li D, Zhang J, Li J. Primer design for quantitative realtime PCR for the emerging Coronavirus SARS-CoV-2. Theranostics. 2020;10(16):7150-7162. 179. Lichtman, J. W.; Conchello, J.-A. Fluorescence microscopy // Nature Methods 2 (2005) (12) С. 910-919. 180. Livak K.J., Schmitten T.D., Analysis of relativeexpression data using real time quatitative PCR and method.//Methods. 2001, v.25.p.402-408.

181. Ludecke H.J., Johnson C., Wagner M.J., Wells D.E., Turleau C., Tommerup N., Latos-Bielenska A., Sandig K.R., Meinecke P., Zabel B. et al. II Am. J. Hum. Genet., 1991, v. 49, pp. 1197. 182. Macville M., Schroeck E., Padilla-Nash h., et al. Comprehensive and definitive molecular cytogenetic characterization of HeLa cells by spectral karyotiping // Cancer Res. 1999. V. 59. P. 141-150. 183. Manrao E. A. et al. Reading DNA at single-nucleotide resolution with a mutant MspA nanopore and phi29 DNA polymerase // Nature biotechnology. – 2012. - Т. 30. - N. 4. - С. 349. 184. Marks J., Hoogenboom H., Bonnert T., et al. // J. Mol. Biol. 1991. V. 222. P. 581–597. 185. Marx V., PCR: paths to sensitivity, Careful strategizing helps make PCR sensitive enough for the most challenging experiments. Nature America, Inc. All rights reserved, 2014, https://www.nature.com/articles/nmeth.2849.pdf 186. Mead D., Kemper B. // Biotechnology. 1988. V. 10. P. 85–102. 187. Mierzejewska K., Siwek W., Czapinska H., Kaus-Drobek M., Radlinska M., Skowronek K., et al. Структурная основа специфичности метилирования R.DpnI. Исследование нуклеиновых кислот. 2014. 42 (13): 8745–54. 188. Miller, J. R., Koren, S., & Sutton, G. (2010). Assembly algorithms for next-generation sequencing data. Genomics, 95(6), 315–327. 189. Minnenkova O., Ilyichev A.., Kishchenko G. 1993 // Gene. 1993. V. 128. pp. 85–88. 190. MLPA-technique-http-wwwmlpacom-After-hybridisation-totheirtarget_fig1_51199251 ngs_vysokoproizvoditelnoe_sekvenirovanie.pdf 191. Model P., Russel M. The bacteriophages. V. 2. N.Y.: Plenum, 1988. 192. Muyzer G., de Waal EC, Uitterlinden AG. (1993) Профилирование сложных микробных популяций методом денатурирующего градиентного гельэлектрофореза с анализом амплифицированных с помощью полимеразной цепной реакции генов, кодирующих 16S рРНК. Микробиол окружающей среды. 59:695-700. 193. Nam J.M., ParkS.J., MirkinC.A. (2002) Bio-barcodes based on oligonucleotide-modified nanoparticles, J. Am. Chem. Soc., 124, 3820–3821. 194. Nam J.-M., Thaxton C. S., MirkinC.A., (2003). Био-штрих-коды на основе наночастиц для сверхчувствительного обнаружения белков. Наука. 301 (5641): 1884-6. 195. Niemeyer C.M., Adler M., Pignataro B. et al. Selfassembly of DNAstreptavidin nanostructures and their use as reagents in immuno-PCR. Nucleic Acids Res. 1999, 27:4553-4561.

196. Niemeyer C.M., Adler M., Wacker R. Immuno_PCR: high sensitivity detection of proteins by nucleic acid amplification. Trends Biotechnol. 23, 208– 216. 2005. 197. Ning G., Cheng X., Luo P., Liang F., Wang Z., Yu G. (2017) Hybrid sequencing and map finding (HySeMaFi):optional strategies for extensively deciphering gene splicing and expression in organisms without reference genome. Scientific Reports, 7(1). 198. Nixon, G., Garson, J.A., Grant, P., Nastouli, E., Foy, C.A., Huggett, J.F., Anal. Chem. 86, 4387–4394. 2014. 199. Ochman, H, A.S.Gerber, D.L.Hartl. Genetic applications of an inverse polymerase chain reaction. Genetics 120:631-623. 1988. 200. Ottesen, E.A., Hong, J.W., Quake, S.R., Leadbetter, J.R., Science 314, 1464–1467. 2006. 201. Pannier, L. Association analysis of single nucleotide polymorphisms in DGATl, TG and FABP4 genes and intramuscular fat in crossbred Bos taurus cattle / L. Pannier, A.M. Mullen, R.M. Hamill, P.C. Stapleton, T. Sweeney // Meat. Sci. V. 85, N 3. - P. 515-518. 2010. 202. Park M.H., Song E.Y., Ahn C., Oh K.H., Yang J., Kang S.J., Lee H.S. Two subtypes of hepatitits B virus-associated glomerulonephritis are associated with different HLA-DR2 alleles in Koreans // Tissue Antigens. – Vol. 62(6). – P. 505-11. 2003. 203. Park YR, Kim EM, Lee YJ, Yeo SG, Park CK Мультиплексная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в реальном времени для дифференциального обнаружения генов H5, N1 и N8 высокопатогенных вирусов птичьего гриппа. Veterinarni Medicina, 62: 211-220. 2017. 204. Parmley S., Smith G. // Gene. V. 73. P. 305–318. 1988. 205. Raymond S., Weintraub L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis (англ.) // Science : журнал. Washington, D.C., USA: American Association for the Advancement of Science, Vol. 130, no. 3377. P. 711. 1959. 206. Ramakrishnan, R., Qin, J., Jones, R.C., Weaver, L.S., Integrated fluidic circuits (IFCs) for digital PCR. In: Jenkins, G., Mansfield, D.C. (Eds.), Microfluidic Diagnostics: Methods and Protocols. Humana Press, Totowa, NJ, 423–431. 2013. 207. Redon R. et al., Global variation in copy number in the human genome, nature05329. Vol 444, 2006. 208. Roberts B., Markland W., Siranosian K., et al. // Gene. 1992. V. 121. P. 915.

209. Ronaghi M. Et al., Секвенирование ДНК в реальном времени с использованием обнаружения высвобождения пирофосфата Анальная биохимия. 1996. 242 (1): 84-9. 210. Rotman J., van Gils W., Butler D., Spaink H. P., and Meijer A. H., Rapid screening of innate immune gene expression in zebrafish using reverse transcription - multiplex ligation-dependent probe amplification. BMC Research Notes 2011. http://www.biomedcentral.com/1756-0500/4/196 211. Rubtsov N., Karamysheva T., Babochkina T., Zhdanova N., Trifonov V., Starke H., Heller A., Junker K., Liehr T., Claussen U. A new simple version of chromosome microdissection tested by probe generation for 24-multi-color FISH, Multi-color banding (MCB), ZOO-FISH and in clinical diagnostics // Medgen 2000, V.12. P.6 212. Ruijter J. M., Ramakers C., Hoogaars W. M. H., Karlen Y., Bakker O., van den Hoff M. J. B. and Moorman A. F. M ., Amplification efficiency: linking baseline and bias in the analysis of quantitative PCR data J. M., Published online 22 February 2009 Nucleic Acids Research, 2009, Vol. 37, No. 6. 213. Sackmann, E.K., Fulton, A.L., Beebe, D.J., The present and future role of microfluidics in biomedical research.Nature 507, 181–189. 2014. 214. Salis A.D. "Применение в клинической микробиологии". ПЦР в реальном времени: современные технологии и приложения. Caister Academic Press. 2009. 215. Scalenghe F, Turco E, Edstrom JE, Pirrotta V, Melli M.: Микродиссекция и клонирование ДНК из специфической области политенных хромосом Drosophila melanogaster. Хромосома. 82(2):205-16. 1981. 216. Schwartz D.C., Koval M. Conformational Dynamics of Individual DNA Molecules During Gel Electrophoresis. Nature, 338(6215), 520-522. 1989. 217. Sebat J., Lakshmi B., Troge J. et al. Large-scale copy number polymorphism in the human genome. Science. 2004. 305: 525-528. 218. Senger, G., H. Ludecke, B. Horsthemke, and U. Claussen, Microdissection of banded human chromosomes. Hum. Genet. 84:507-511. 1990. 219. Shen, F., Sun, B., Kreutz, J.E., Davydova, E.K., Du, W., Reddy, P.L., Joseph, L.J., Ismagilov, R.F., J. Am. Chem. Soc. 133, 17705–17712. 2011. 220. Siwek W., Czapinska H., Bochtler M., Bujnicki JM, Skowronek K. Кристаллическая структура и механизм действия N6-метиладенинзависимой эндонуклеазы рестрикции IIM типа R.DpnI. Исследование нуклеиновых кислот. 40 (15). 2012. 221. Sequencing BMC Genomics (2016).

222. Son, J.H., Cho, B., Hong, S., Lee, S.H., Hoxha, O., Haack, A.J., Lee, L.P., Light.: Sci. Appl. 4, e280. 2015. 223. Solinas-Toldo S. Matrix-based comparative genomic hybridization: biochips toscreen for genomic imbalances / S. Solinas-Toldo, S. Lampel, S. Stilgenbauer, et al. // GenesChromosomes Cancer. – 1997. – Vol. 20. – P. 399–4. 224. Southern E. M., Anand R., Brown W. R. A., Fletcher D. S.. A model for the separation of large DNA molecules by crossed field gel electrophoresis. Nucl. Acids Res. 15: 5925-5943. 1987. 225. Southern E. M., Elder J. K. Theories of gel electrophoresisof high molecular weight DNA. In: Pulsed field gel electrophoresis: a practical approach. New York: IRL Press at Oxford University Press Inc. 1-19. 1995. 226. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. Journal of Molecular Biology 68(3): 503-517. 1975. 227. Staden R. A strategy of DNA sequencing employing computer programs // Nucleic acids research. Т. 6. – N. 7. – pp. 2601-2610. 1979. 228. Stears RL, Martinsky T, Schena M. Trends in microarray analysis. Nat Med 9, 140-145. 2003. 229. Takahashi E, Hori T, Murata M: Population cytogenetics of rare fragile sites in Japan. Hum Genet 78:121-126. 1988. 230. Taly V., Pekin D., Benhaim L., Kotsopoulos S.K., Le Corre D., Li X. et al. Multiplex picodroplet digital PCR to detect KRAS mutations in circulating DNA from the plasma of colorectal cancer patients. Clin. Chem. 59: 1722-31. 2013. 231. Tatsuda, K. Relationship of the bovine growth hormone gene to carcass traits in Japanese black cattle / K. Tatsuda, A. Oka, E. Iwamoto, Y. Kuroda, H. Takeshita, H. Kataoka, S. Kouno // J. Anim. Breed Genet. - 2008. - V. 125, N 1. P. 45-49. 232. Thio C.L., Carrington M., Marti D., O’Brien S.J., Vlahov D., Nelson K.E., Astemborski J., Thomas D.L. Class II HLA alleles and hepatitis B virus persistence in African Americans. // J. Infect. Dis. – Vol. 179(4). – P. 1004-6. – 1999. 233. Tian, Q., Yu, B., Mu, Y., Xu, Y., Ma, C., Zhang, T., Jin, W., Jin, Q., RSC Adv. 5, 81889–81896. 2015a. 234. Tian, Q.C., Song, Q., Xu, Y.N., Zhu, Q.Y., Yu, B.W., Jin, W., Jin, Q.H., Mu, Y., Anal. Methods 7, 2006–2011. 2015b. 235. Tichopad A., Dilger M., Schwarz G. and. Pfaf M. W., Standardized determination of real-time PCR ef®ciency from a single reaction set-up. Institute of Physiology and 1 Institute of Agronomy and Plant Breeding, FML-Weihenstephan, Germany, 2003.

236. Tichopոd Aleš, Quantitative real-time RT-PCR based transcriptomics: Technische Universit. Mnchen, Dissertation. 103 Z. 2002. 237. van Dijk E. L. et al. The third revolution in sequencing technology //Trends in Genetics. – 2018. – Т. 34. – N. 9. – С. 666-681. 238. Vejbaesya S, Songsivilai S, Tanwandee T, Rachaibun S, Chantangpol R, Dharakul T. Ассоциация HLA с вирусной инфекцией гепатита C. Хум Иммунол. 2000 г.; 61 : 348–353. 239. VOGELSTEIN B., KINZLER K.W. , Genetics Digital PCR. The Howard Hughes Medical Institute and the Johns Hopkins Oncology Center, Baltimore, MD 21231, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 96, pp. 9236–9241, 1999. 240. Volkov AN, Khabieva SM, Smirnova EYu, Larionov AV. The genetic diagnostics of mutations UGT1A1 in practice of modern medicine. Russian Clinical Laboratory Diagnostics. 63(3):186-192. (In Russ.). 2018. 241. Wartell, RM, Benight, AS. Термическая денатурация молекул ДНК: сравнение теории с экспериментом. Отчеты по физике. 126 (2): 67–107. Bibcode. 1985. 242. Wawrzynowicz-Syczewska M., Underhill J.A., Clare M.A., BoronKaczmarska A., McFarlane I.G., Donaldson R.T. HLA class II genotypes associated with chronic hepatitis C virus infection and response to alfainterferon treatment in Poland. // Liver. – 2000. – Vol.20(3). – P. 234-9. 243. Weigel, K. Genetics of Longevity and Productive Life / K. Weigel // WCDS Advances in Dairy Technology. - 2006. - V. 18. - P. 29-40. 244. Whale A.S., Huggett J.F., Cowen S., Speirs V., Shaw J., Ellison S. et al. Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation. Nucleic. Acids. Res. 2012; 40: e82 245. Witters, D., Knez, K., Ceyssens, F., Puers, R., Lammertyn, J., 2013. Lab Chip 13, 2047–2054. 246. Yalow RS, Berson SA. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. J Clin Invest. 39:1157-75. 1960. 247. Yang F, Moss L, Phillips G. The molecular structure of green fluorescent protein // Nature Biotechnology 14 (1996) (10) С. 1246-1251. 248. Zhang, Y., Zhu, Y., Yao, B., Fang, Q., Lab Chip 11, 1545–1549. 2011. 249. Zang D., Ge L., Yan M., Song X., Yu J. Electro_chemical immunoassay on a 3D microfluidic paper_based device. Chem. Commun. 48, 4683–4685. 2012. 250. Zang D., Ge L., Yan M., Song X., Yu J. Electro_chemical immunoassay on a 3D microfluidic paper_based device. Chem. Commun. 48, 2012. 251. Zhao Z.W., Roy R., Gebhardt J.C., Suter D.M., Chapman A.R., Xie X.S. Spatial organization of RNA polymerase II inside a mammalian cell nucleus

revealed by reflected light_sheet super resolution microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111, 681–686. 2014. 252. Zhou, Y., Чжао, LQ, Marks, JD. Выбор и характеристика клеточного связывания и интернализации фаговых антител. Arch. Биохим. Биофиз. 2012, 526, 107–113. 253. Zlotina et al. Microdissection of lampbrush chromosomes as an approach for generation of locus-specific FISH-probes and samples for high-throughput, 2016. 254. Zou P., Zhao L., Xu H., et al. Hsa-mir-499 rs3746444 polymorphism and cancer risk: a meta-analysis.J Biomed Res. 2012.

255. http://www.hapmap.org HapMap - ծրագիր 256. https://forpcr.ru/projects/design/PCR/ Ալելյուրահատուկ ՊՇՌ 257. file:///C:/Users/09032020/Desktop/Investigating_candidate_genes_identifi ed_by_genome.pdf TagMan MGB 258. [email protected] ԴՆԹ-ի հալեցում 259. http://bglab.bg/catalog/2elektroforeza/gelelectroforeza/8transilluminators/ Տրանսիլյումինատոր 260. http://docplayer.ru/46774071-Metody-raboty-s-dnk-pcr-restrikciya.html ՊՇՌ-ի տեսակները 261. http://docplayer.ru/46774071-Metody-raboty-s-dnk-pcr-restrikciya.html ՊՇՌ վեկտորի կլոնավորման համար 262. http://es.niv.ru/doc/encyclopedia/chemistry/articles/126/affinnaya hromatografiya.htm Աֆինային քրոմատոգրաֆիա 263. http://humbio.ru/humbio/01122001/kartirovan/00015fce.htm Պուլս էլեկտրաֆորեզ 264. http://med.by/methods/pdf/118-1109.pdf Միկրոդելեցիաներ 265. http://molbiol.ru/protocol/12_07_02.html FRET-զոնդեր 266. http://mewo.ru/tumb/23/266/ Երկմեր էլեկտրաֆորեզ 267. http://mylektsii.ru/3-2422.html Մազանոթային էլեկտրոֆորեզ 268. http://propionix.ru/sekvenirovaniye-i-ptsr Секвенация Illumina/Solexa 269. https://studylib.ru/doc/2342706/molekulyarnaya-biologiya-marahonovandrej-vladimirovich-lekci Երկմեր էլեկտրաֆորեզ 270. http://www.chemnet.ru/rus/teaching/oil/spezprakt-chr.html Ադսորբցիոն քրոմատոգրաֆիա

271. http://www.almabion.ru/alma-cleanup-nabor- Էլեկտրաֆորեզի արդյունքների դետեկցիա 272. http://www.bialexa.ru/technical-support/methods/western-blot/ Էլեկտրաֆորեզի արդյունքների դետեկցիա 273. http://www.catplc.co.uk Ֆագային գրադարաններ 274. http://www.chem.msu.su/rus/teaching/analyt/chrom/part3.pdf Մազանոթային էլեկտրաֆորեզ 275. http://www.clinlabs.com/publications/metody Кинетические кривые 276. http://www.docme.ru/doc/565332/experiments_id_0 Սաուզերն բլոտ 277. http://www.iairas.ru/synopsises/petrov_disser.pdf Кинетические кривые 278. https://www.files.pimunn.ru/niibiomed/speckurs/bionj/Lukyanov_2011_NN _lection3.pdf Երկար ֆրագմենտների ՊՇՌ (LongrangePCR) 279. http://www.ibmc.msk.ru/content/Education/w-o_pass/MMoB/4.pdf Երկչափ էլեկտրաֆորեզ 280. https://journals.asm.org/doi/full/10.1128/ecosalplus.esp-0004-2017 ԴՆԹի հետազոտության պատահական ամպլիֆիկացիայի եղանակով կատարված ՊՇՌ 281. http://www.morphosys.com Ֆագային գրադարաններ 282. http://www.myshared.ru/slide/467021/ ՊՇՌ 283. http://www.niipfm.nizhgma.ru/_resources/directory/130/common/Lukyanov _2011_NN_lection3.pdf ՊՇՌ-ի տեսակները 284. http://www.ramld.ru/userfiles/file/perm/popova.pdf Ալելյուրահատուկ ՊՇՌ 285. http://www.sileks.com/ru/shortlink/Kits_Isol_DNA_Gel Էլեկտրաֆորեզի արդյունքների դետեկցիա 286. http://www.spectral-imaging.com/attachments/236_ Spectral karyotyping SKY) 287. http://www.spektronika.ru/product/fluorescentnyy-detektor ՊՇՌ դետեկցիա 288. http://www.veld.kz/index.html?id=2243 ԴՆԹ-ի անջատում մագնիսային գնդերով 289. http://www.xumuk.ru/biologhim/010.html Քրոմատոգրաֆիա 290. https://File:Chromatin_immunoprecipitation_sequencing ChIP հետազոտություն 291. https://A_scheme_of_fluorescence_detection.jpg Սպկտրոֆլյուրոմետրի կազմության

292. https://agrodiagnostica.ru/services/laboratory-installation/ ՊՇՌ-ի լաբորոտորիա 293. https://biomolecula.ru/articles/454-sekvenirovanie-vysokoproizvoditelnoepirosekvenirovanie-dnk Էմուլսիոն պիրոսեկվենացում 294. https://biomolecula.ru/articles/nanoporovoe-sekvenirovanie Նանոսեկվենատոր 295. https://dna-technology.ru/sites/default/files/gene-4_15.04.2020.pdf ՊՇՌ դետեկցիա 296. https://dna-technology.ru/sites/default/files/pcr_a5_083-4.pdf ՊՇՌ տեխնոլոգիաներ 297. https://elibrary.ru/item.asp?id=25443422 ԽԵԿ-երի լեյկոզ 298. https://en.ppt-online.org/348534 (ELIspot) մեթոդ 299. https://en.ppt-online.org/721073 Մրցակցային ԻՖԱ 300. https://fr.slideserve.com/kenyon-hines/chapter-3-amino-acids-peptidesproteins 301. https://genschool.ru/wa-data/public/site/ 1.8_Cytogenetics_ FISH_ KibanovMV.pdf 302. https://gigabaza.ru/doc/28886.html Էլեկտրաֆորեզ 303. https://geneticeducation.co.in/colony-pcr-principle-process-protocoladvantages-and-limitations/ Մոլեկուլային գաղութներիՊՇՌ 304. http://hdklab.edu_manual/dgge1.html%25 (Helms, 1990) 305. https://hmong.ru/ru/%D0%A1%D1%82%D0%BE%D0%BA%D1%81%D0%BE %D0%B2_%D1%81%D0%B4%D0%B2%D0%B8%D0%B3 Ֆլուորեսցենցիայի ֆիզիկական բնույթը 306. https://id.wikipedia.org/wiki/Berkas:Gel_electrophoresis_2.jpg Էլեկտրաֆորեզի դետեկցիա 307. https://infopedia.su/16x7e3b.html Խողովակային էլեկտրաֆորեզ 308. https://infopedia.su/17x125fa.html ԻՖԱ 309. https://infopedia.su/17xaaab.html Էլեկտրաֆորեզ 310. https://infopedia.su/22x948b.html Սեկվենացում 311. https://jugendhoritschon.com/2022/06/13/facs-%EC%9B%90%EB%A6%AC/ Digital 312. https://kpfu.ru/portal/docs /F1203376391/6..Metody Հալեցման կոր 313. https://kpfu.ru/portal/docs/F1203376391/6.Metody.issledovaniya.NK.II.pdf Հալեցման կոր 314. https://lektsii.org/16-70668.html Էլեկտրաֆորեզի դետեկցիա 315. https://medach.pro/post/2158 NNGS

316. https://m-hub.jp/wp-content/uploads/2019/09/img238-1_01.png Նիշ SYBR GreenI 317. https://molpit.org/files/874_PatrushevL06.pdf ՊՇՌ-ի տեսակները 318. https://nplus1.ru/material/2021/12/14/ifa-tests-avivir Սենդվիչ մեթոդը 319. https://ppt-online.org/151176 Մուլտիպլեկսային ՊՇՌ 320. https://ppt-online.org/304231 Սեկվենացում 321. https://ppt-online.org/498534 Բնական ԻԳ 322. https://ppt-online.org/534298 Վեստերն բլոտ 323. https://present5.com/genom-cheloveka-chast-2-xromosomnyj-urovenorganizacii/ ՖԻՇ 324. https://present5.com/seminar-medicinskaya-genetika-farmaciya-kurs-3ciop-medicina/ Սեկվենացում 325. https://present5.com/vtorichnye-immunodeficity-vich-spid-lekciya-9vtorichnye-immunodeficity/ Երկրորդային իմունոդիֆիցիտ 326. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15703290/ Բիոպեննինգ 327. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22373922/ Digital pcr 328. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25828047/ Digital pcr 329. https://rockland-inc.com/elisa.aspx?ref=driverlayer.com Մրցակցային ԻՖՎ 330. https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%A4%D0%B0%D0%B9%D0%BB:Biobarc ode_assay.png Բար կոդ 331. https://senthilarivan.wordpress.com/2015/10/13/blotting-techniques/ Սաուզերն բլոտ 332. https://slideplayer.biz.tr/slide/13512691/ Սեկվենացում 333. https://slideplayer.com/slide/13216852/ Սեկվենացում 334. https://slide-share.ru/stroenie-i-svojstva-rnk-132102 ՌՆԹ 335. https://studfile.net/preview/2656053/ Պուլս էլեկտրաֆորեզ 336. https://studfiles.net/preview/1778291/ ՊՇՌ դետեկցիա 337. https://textarchive.ru/c-1090512-p2.html RXFISH 338. https://thepresentation.ru/biologiya/tehnologiya-rekombinantnyh-dnklektsiya-1/download TaqMan Պրոտոկոլ 339. https://twitter.com/hanniepower/status/1095659913303474176 SMRT 340. https://works.doklad.ru/view/kqYLIlNbfDc/all.html SYBR GreenI 341. https://www.abcam.com/protocols/sandwich-elisa-protocol-1 Ֆլուորեսցենցիա 342. https://www.dia-m.ru/blog/fluorestsentnaya-mikroskopiya/ Ֆլուորեսցենցիա

343. https://www.dia-m.ru/lab/pcr-cifrovoj-kapelnyj/1864001-sistema- Digital pcr 344. https://www.dia-m.ru/news/hla-tipirovanie-ngs-s-naborami-omixon ՀՀԳՀ հետազոտություն 345. https://www.elitechgroup.com/benelux/product/elitechgroup-real-timepcr-proprietary-technologies/ TagMan MGB 346. https://www.google.com/search?q ՊՇՌ սարքեր 347. https://www.ld.ru/multiplex/ilist-4286.html Luminex xMAP 348. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4128248/ 349. https://www.photonics.com/Articles/Personalized_Medicine_No_Longer_A head_of_Its/a44349 Single Molecule Real Time¦ SMRT 350. https://www.pinterest.ru/pin/286752701254535826/ Բիոչիպ 351. https://www.pngwing.com/ru/free-png-yjlab ԴՆԹ-ի աբսորբում սիլիկիումի վրա 352. https://web.archive.org/web/20081011120726/http://wixade.com/science/2 61/nobel-prize-in-chemistry-2008.html Սիմոմուրաին, Չալֆին և Թսիենին շնորհվեց Նոբելյան մրցանակ 20082 353. https://www.qiagen.com/gb/products/discovery-and-translational HRM Rotor-Gene Q 5plex 354. https://www.researchgate.net/figure/Avidin-biotin-complexmethod_fig3_51620447 ԻՖՎ 355. https://www.researchgate.net/publication/266247148_Investigating_candid ate_genes TaqMan պրոտոկոլ 356. https://www.slideshare.net/DrAkshayJoshi/aj-seminar-crd 24 գունային ՖԻՇ 357. https://www.s-vfu.ru/universitet/rukovodstvo-istruktura/instituty/bgf/nilmb_bgf Chilex դոնդողի միջոցով ԴՆԹ-ի անջատում 358. https://yandex.ru/images/search?from=tabbar&text=%D0%B2%D0% Вестерн блот 359. https://yandex.ru/images/search?img3A%2F% Ուղղահայաց էլեկտրաֆորեզ 360. www.biotangusa.com Ներկանյութերի շարժը դոնդողի վրա 361. www.creative-biostructure.com Մեծ մոլեկուլների էլեկտրոֆորեզ 362. www.litceysel.ru/amd/1 Մուլտիպլեոսային ՊՇՌ 363. www.skygen.com/catalog/biohimicheskie_reaktivy/new_england_biolabs /markery_ Պուլս էլեկտրաֆորեզ

364. www.syntol.ru/catalog/zondy-dlya-ptsr-v-realnom-vremeni/ ՌԹ ՊՇՌ-ի զոնդեր 365. https://www.medicalexpo.ru/prod/illumina-inc/product-83632604825.html NNGS 366. https://www.medicalexpo.ru/prod/illumina-inc/product-83632761743.html NNGS 367. https://www.dia-m.ru/catalog/lab/sekvenatory-belkov-dnk/sekvenatorydnk-po-sengeru/ NNGS https://www.helicon.ru/catalog/oborudovanie/sekvenirovanie/ Սարքավորումներ 368. https://www.dia-m.ru/catalog/lab/sekvenatory-belkov-dnk/sekvenatorydnk-3-go-pokoleniya Սարքավորումներ 369. https://www.dia-m.ru/catalog/lab/sekvenatory-belkov-dnk/sekvenatorydnk-3- Սարքավորումներ 370. https://studylib.ru/doc/4765023/experiments_id_0# Սաուզերն բլոտ 371. [email protected] Սպիտակուցների էլեկտրաֆորեզ

Բովանդակություն Ներածություն Մոլեկուլային գենետիկայի խնդիրները և մեթոդները

Գլուխ 1. 1.1. 1.2. 1.2.1.

1.2.2. 1.2.3. 1.2.4. 1.2.5. 1.3. 1.3.1. 1.3.1.1. 1.3.1.2. 1.3.1.3. 1.3.1.4. 1.3.1.5. 1.3.1.6. 1.3.1.7. 1.3.2. 1.3.3. 1.4. 1.5. 1.5.1. 1.6. Գլուխ 2. 2.1. 2.2. 2.2.1. 2.2.2. 2.3. 2.4. 2.4.1. 2.4.2.

ՆՈՒԿԼԵԻՆԱԹԹՈՒՆԵՐԻ ԱՆՋԱՏՄԱՆ ՄԵԹՈԴՆԵՐԸ

ՆԹ-ների անջատման մեթոդների բնութագիրը Հեղուկֆազային մեթոդներ ՆԹ-ների անջատումը բջիջներից և հյուսվածքներից և բաժանումը թորամասերի դասական մեթոդներով ԴՆԹ-ի անջատման Պ. Կրիգի մեթոդը ԴՆԹ-ի աղային էքստրակցիա կենդանական բջիջներից ԴՆԹ-ի անջատումը բակտերիալ բջիջներից ԴՆԹ-ի անջատումը բուսական հյուսվածքներից ԴՆԹ-ի անջատման պինդֆազային մեթոդները Քրոմատոգրաֆիայի մեթոդ Ընտրողական ադսորբցիայի եղանակ ՆԹ-ների անջատումը ապակու վրա Արյան նմուշից ԴՆԹ-ի անջատումը մոնոդիսպերսիոն մասնիկների օգտագործման եղանակով Դոնդողային ֆիլտրացիայի եղանակ Իոնոփոխանակող քրոմատոգրաֆիայի եղանակ Chilex տիպի քրոմատոգրաֆիա Աֆինային քրոմատոգրաֆիա Մագնիսային սեպարացիայի մեթոդ Խելոք էքստրակցիայի մեթոդ ՆԹ-ների ավտոմատիկ անջատման սարքեր Ցենտրիֆուգման մեթոդ Բարձր արագության գոտային ցենտրիֆուգում ՆԹ-ների անջատում FTA շերտիկների եղանակով

ՆԹ-ՆԵՐԻ ՀԵՏԱԶՈՏՄԱՆ ԵՂԱՆԱԿ՝ ԷԼԵԿՏՐԱՖՈՐԵԶ

Էլեկտրաֆորեզի ընդհանուր բնութագիրը Էլեկտրաֆորեզի տեսական հիմունքները, կատարման կարգը և օգտագործվող սարքավորումները Էլեկտրաֆորեզի տեսական հիմունքները Էլեկտրաֆորեզի պրոցեսի բնութագիրը, օգտագործվող սարքավորումները և փորձի նախապատրաստման կարգը Էլեկտրաֆորեզի ընթացքի վրա ազդող գործոնները Էլեկտրաֆորեզի դետեկցիայի և վերահսկման գործոնները ԴՆԹ-ի նշադիրներ Էլեկտրաֆորեզի ընթացքի վերահսկման միջոցները

2.5. 2.5.1. 2.5.1.1. 2.5.1.2. 2.5.2. 2.5.3. 2.5.3.1. 2.5.3.2. 2.5.3.3. 2.5.3.4. 2.5.3.5. 2.6. 2.7. 2.7.1. 2.7.2. 2.8. 2.9. 2.9.1. 2.10. 2.10.1. 2.10.2. 2.10.3. 2.11. 2.11.1. 2.12. 2.13.

2.14. 2.14.1.

Հորիզոնական էլեկտրաֆորեզ Հորիզոնական էլեկտրաֆորեզ ագարոզային դոնդողի վրա Էլեկտրաֆորեզի ընթացքում օգտագործվող բուֆերները և այլ լուծույթները Ագարոզային հորիզոնական էլեկտրաֆորեզի կատարման կարգը Վերլուծական էլեկտրաֆորեզի արդյունքների դետեկցիա Պատրաստուկային էլեկտրաֆորեզ ԴՆԹ-ի անջատումը ագարոզային դոնդողից PEG/TAE կիրառմամբ էլեկտրաէլյուացիայի եղանակով ԴՆԹ-ի անջատման մեթոդը ագարոզային դոնդողից ապակե ֆիլտրերի օգտագործմամբ ԴՆԹ-ի անջատումը ագարոզային դոնդողից սպին ֆիլտրի օգտագործմամբ ԴՆԹ-ի անջատումը դոնդողից մագնիսային մասնիկների կիրառմամբ Ագարոզային դոնդողից ԴՆԹ-ի անջատման այլ մեթոդներ ՊԱԱԴ դոնդողի օգտագործմամբ կատարվող էլեկտրաֆորեզի առանձնահատկությունները Ուղղահայաց դոնդողային էլեկտրաֆորեզ Ուղղահայաց դոնդողային խողովակային էլեկտրաֆորեզ Շերտային ուղղահայաց դոնդողային էլեկտրաֆորեզ Դիսկ-էլեկտրաֆորեզ Պուլս-էլեկտրաֆորեզ (pulsed-fieldgelelectrophoresis, PFGE) ԴՆԹ-ի նմուշների պատրաստոմ պուլս-էլեկտրաֆորեզի համար Մազանոթային կամ կապիլարային էլեկտրաֆորեզ Գոտային մազանոթային էլեկտրաֆորեզի համալիրի կազմությունը Մազանոթային էլեկտրաֆորեզի դետեկցիայի եղանակները Մազանոթային էլեկտրաֆորեզի հիմնական տեսակները Երկչափ էլեկտրաֆորեզ Երկչափ էլեկտրաֆորեզի տարատեսակները Դիսկ-էլեկտրաֆորեզ և հաջորդող SDS պարունակող ՊԱԱԴ էլեկտրաֆորեզ Մակրոմոլեկուլների բաժանումը թորամասերի երկու ֆիզիկաքիմիական հատկանիշներով երկմեր էլեկտրաֆորեզի եղանակով Երկչափ էլեկտրաֆորեզի օգտագործման բնագավառները Իմունաէլեկտրաֆորեզի տարբերակները ՝ ԻԷՖ և կրոս կամ խաչաձև ԻԷՖ

2.15

2.16 2.16.1. 2.17. Գլուխ 3.

Բնափոխող գրադիենտային դոնդողային էլեկտրաֆորեզ՝ ԲԳԴԷ (Denaturation Gradient Gel Electrophoresis, DGGE) և դրա տեսակները Ռեստրիկտազ ֆերմենտները և դրանց օգտագործման բնագավառները Ռեստրիկտազների դասակարգումը Էլեկտրաֆորեզի օգտագործման բնագավառները

3.6.15. 3.6.16.

ՊՇՌ-Ն ԵՎ ԴՐԱ ԿԻՐԱՌՄԱՆ ԲՆԱԳԱՎԱՌՆԵՐԸ

(Polymerase Chain Reaction, PCR) Ռեակցիայի ընդհանուր բնութագիրը ԴՆԹ-ի կրկնապատկման մեխանիզմը ՊՇՌ մեթոդի կատարման սկզբունքները Ամպլիֆիկացիայի կատարման համար անհրաժեշտ նյութերը և սարքերը ՊՇՌ -ի կատարման կարգը ՊՇՌ ռեակցիայի դինամիկան ՊՇՌ-ի էֆեկտիվության վրա ազդող գործոնները ՊՇՌ-ի թերությունները և դրանց հաղթահարման եղանակները ՊՇՌ-ի տեսակները Կոնվենցիոնալ կամ սովորական ՊՇՌ «Տաք ստարտով» ՊՇՌ (Hot-start PCR) Ներդրված ՊՇՌ (Nested PCRR) «Ինվերտացնող կամ հակառակ» ՊՇՌ (Inverse PCR) ՊՇՌ հետադարձ տրանսկրիպցիայի օգտագործմամբ (Reverse Transcription PCR, RT-PCR) Ասիմետրիկ ՊՇՌ (Asymmetric PCR) Սանդղակային ՊՇՌ (Touchdown PCR) Երկար ֆրագմենտների ՊՇՌ (Long range PCR) Մոլեկուլային գաղութների ՊՇՌ (PCR-Colony) Պատահական ամպլիֆիկացիայով ՊՇՌ (Random Amplification of Polymorphic DNA, RAPD) Խումբ յուրահատուկ ՊՇՌ (group-specific PCR) Ալելյուրահատուկ ՊՇՌ (Allele-specific PCR) Նպատակային ՊՇՌ՝ մուտագենեզ վերածածկվող պրայմերների կիրառմամբ (Overlap extension PCR) Մուլտիպլեքսային կամ բազմապրայմերային ՊՇՌ (in silico PCR) ՊՇՌ վեկտորի կլոնավորման համար ՊՇՌ- ELISA (Immunocapture PCR–ՊՇՌ իմունային կլանումով)

3.7. 3.7.1.

ՊՇՌ-ի արդյունքների դետեկցիայի մեթոդները և եղանակները Դետեկցիա էլեկտրաֆորեզի մեթոդով

3.1. 3.2. 3.3. 3.3.1. 3.3.2. 3.3.3. 3.4. 3.5. 3.6. 3.6.1. 3.6.2. 3.6.3. 3.6.4. 3.6.5. 3.6.6. 3.6.7. 3.6.8. 3.6.9. 3.6.10. 3.6.11. 3.6.12. 3.6.13. 3.6.14.

3.7.2. 3.7.3. 3.7.4. 3.8. 3.8.1. 3.8.2. 3.8.2.1. 3.8.2.2. 3.8.2.3. 3.8.3. 3.8.3.1. 3.8.3.2. 3.8.3.3. 3.8.3.4. 3.8.3.5.

3.8.3.6. 3.8.3.7. 3.8.3.8. 3.8.3.9. 3.8.3.10. 3.8.3.11. 3.8.3.12. 3.8.3.13. 3.8.4. 3.8.4.1. 3.8.4.2.

ՊՇՌ-ի դետեկցիայի քանակամրցակցային մեթոդ Հիբրիդացում ամպլիֆիկացիայից հետո Դասական ՊՇՌ-ի թերությունները ՊՇՌ ռեալ ժամանակում՝ ՌԺՊՇՌ (Real-Time PCR) ՊՇՌ ռեակցիայի դինամիկան Ֆլուորեսցենտ ներկանյութերը և դրանց օգտագործման եղանակները Ֆլուորոքրոմների բնութագիրը և տեսակները Ֆլուորեսցենտ ներկանյութով կատարվող դետեկցիայի առավելությունները Ֆլուորեսցենտ նիշեր և զոնդեր «Ռեալ ժամանակում ՊՇՌ»-ի կատարման կարգը Դետեկցիա նիշ բնույթի SYBR Green I-ի օգտագործման եղանակով RealTime ՊՇՌ-ի կատարման կարգը SYBR Green-ի օգտագործմամբ Օլիգոնուկլեոտիդային զոնդերի նշադրման համար օգտագործվող ֆլուորոքրոմները և արգելակիչները «ՊՇՌ ռեալ ժամանակում» ֆլուորեսցենտ հիբրիդացնող զոնդերի կիրառման եղանակով Հիբրիդացում ամպլիֆիկացիայի պրոցեսում (Fluorescent Amplification based Specific Hybridization, FLASH) ֆլուորեսցենտ ներկանյութերի կիրառմամբ կամ ՊՇՌ վերջնակետի որոշման եղանակով (Real-Time End-point PCR) Real-Time PCR Taq Man արձանագրության եղանակով Դետեկցիա TagMan MGB տիպի զոնդերի միջոցով Կոմպլեմենտար ծայրային հատվածներ պարունակող զոնդերի կիրառման մեթոդը՝ Molecular Beacons Կարիճ տիպի զոնդեր Էներգիայի ռեզոնանսային փոխանցման եղանակով աշխատող LightCycler մեթոդ ՊՇՌ-ի օգտագործմամբ փոքր կորիզային փկՌՆԹ-ների՝ miRNA-ների կրկնապատկման և դետեկցիայի մեթոդ Real Time ՊՇՌ-դետեկցիա կատալիտիկ ԴՆԹ-ի օգտագործման եղանակով Real Time ՊՇՌ-ի կատարման կարգը TaqMan զոնդերի օգտագործմամբ Քանակական դետեկցիա Real Time ՊՇՌ-ի եղանակով Ռեակցիայի որակի գնահատում Ստացված արդյունքների մշակում

3.9. 3.9.1. 3.9.2. 3.9.3. 3.9.4. 3.10. 3.11. 3.11.1 3.11.2 3.11.3. 3.12.. 3.13. 3.14. 3.14.1. 3.14.2. 3.14.3. 3.14.4. 3.14.5. 3.15. 3.16. 3.17. 3.17.1. 3.17.2. 3.18 3.19. 3.19.1. 3.19.2.

Մուլտիպլեքսային ՊՇՌ (multiplex PCR, multiplex polimerase chain reaction) Ֆլուորեսցենցիայի մակարդակը գրանցող սարքերը և դրանց կիրառությունը մուլտիպլեքսային ՊՇՌ-ի համար Ալելյուրահատուկ ռեալ ժամանակում ՊՇՌ՝ Allele-specific realtime PCR Լիգազպայմանավորված մուլտիպլեքսային ՊՇՌ (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification, MLPA) RT-MLPA՝ լիգազպայմանավորված մուլտիպլեքսային ՊՇՌ հետադարձ տրանսկրիպցիայի մեթոդով ԴՆԹ-ի հալեցման կորերի վերլուծության HRM մեթոդ (Highresolutionmelting - գերբարձր զգայունությամբ հալեցում) Թվային ՊՇՌ՝ Digital PCR (dPCR) Դիսպերգավորման կաթիլային մեթոդ` թկՊՇՌ (Droplet Digital

PCR, ddPCR)

Դիսպերգավորման միկրոխցիկային մեթոդ՝ Micowell Դիսպերգավորման միկրոծորանային մեթոդ Տպագրում յուրահատուկ նմուշների օգտագործմամբ ՊՇՌ-ի արդյունքների քանակական գնահատման մեթոդները ԹՊՇՌ-ի կիրառման բնագավառները Հարուցիչների բացահայտումը թՊՇՌ-ի մեթոդով Գեների պատճենների (CNV) քանակի որոշումը թՊՇՌ-ի մեթոդով Գեների էքսպրեսիայի հետազոտում թՊՇՌ-ի մեթոդով Հազվադեպ հանդիպող մուտացիաների բացահայտումը թՊՇՌի մեթոդով Քրոմոսոմային անոմալիաների բացահայտումը թՊՇՌ-ի մեթոդով ԹՊՇՌ-ի մեթոդի ամփոփում և հետագա զարգացման ուղիների քննարկում Ժամանակակից ամպլիֆիկատորները ՊՇՌ-ի պրոցեսի վերահսկում ՊՇՌ-ի կատարման սխալները Կոնտամինացիան և դրա հաղթահարման եղանակները ՊՇՌ լաբորատորիաների կազմը և տարածական կազմակերպումը ՊՇՌ-ի կիրառման բնագավառները ՊՇՌ-ի օգտագործումը բժշկաբանական հետազոտություններում և պրակտիկայում ՊՇՌ-ի օգտագործումը անասնաբուժությունում

3.19.2.1. 3.19.2.2. 3.19.2.3. 3.19.2.4. 3.19.2.5. 3.19.3. 3.19.3.1. 3.19.3.2. 3.19.3.3. 3.19.4. 3.20. 3.21. Գլուխ 4. 4.1. 4.1.1. 4.1.2. 4.2. 4.3. 4.3.1. 4.3.2. 4.3.3. 4.3.3.1. 4.3.3.2. 4.3.3.3. 4.3.4. 4.3.4.1. 4.3.5. 4.3.5.1. 4.3.5.2. 4.3.5.3. 4.3.5.4.

Գյուղատնտեսական ապրանքների և սննդամթերքի էպիդեմիական անվտանգությունը Էպիզոոտիկական նկարագրի կազմում և վարակիչ հիվանդությունների ախտորոշում Ժառանգական հիվանդությունների ախտորոշում կենդանիների զարգացման վաղ փուլերում Հիվանդությունների նկատմամբ կայունության և հակվածության գենետիկական նշադիրների բացահայտումը Գենետիկական թեստավորում, կենսաբանական անձնագրեր ՊՇՌ-ն բուսաբուծությունում Գենետիկորեն փոփոխված սննդամթերքը: ԳՄՕ-ների բացահայտումը սննդամթերքում ԳՄ մթերքների օգտագործման ռիսկերը Շրջապատող միջավայրը և ԳՄՕ-ի ազդեցության ռիսկերը ՊՇՌ-ն դատաբժշկագիտական փորձագիտությունում Գիտական հետազոտություններ Մոլեկուլային ախտորոշման մեթոդի զարգացման ժամանակակից ուղղությունները

ՆՈՒԿԼԵԻՆԱԹԹՈՒՆԵՐԻ ԵՎ ՍՊԻՏԱԿՈՒՑՆԵՐԻ

ՄՈԼԵԿՈՒԼԱՅԻՆ ՀԻԲՐԻԴԱՑՄԱՆ ՄԵԹՈԴՆԵՐԸ

Հիբրիդացում Սաուզերն բլոտ եղանակով ԴՆԹ-ի հոմոլոգիկ հաջորդականությունների բացահայտում Սաուզերն բլոտինգի մեթոդով Դոտ հիբրիդացման մեթոդ Հիբրիդացում Նոզերն բլոտ եղանակով Հիբրիդացում Վեստերն բլոտ եղանակով Վեստերն բլոտի օգտագործումը ՁԻԱՎ-ի բացահայտման համար Իմունոբլոտինգ՝ իմունաֆերմենտային վերլուծություն, ԻՖՎ (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) Ոչ մրցակցային ԻՖՎ-ի եղանակները Ուղղակի ELISA ԻՖ-վերլուծություն Անուղղակի ELISA ԻՖ-վերլուծություն ELISA ԻՖՎ վերլուծության սենդվիչ եղանակի կատարման կարգը Մրցակցային ԻՖՎ վերլուծություն Մրցակցային ուղղակի ԻՖՎ-ի կատարման կարգը ԻՎ վերլուծությունների այլ եղանակները Էլիսպոտ (ELIspot) իմունաֆերմենտային բծերի մեթոդ՝ ԻԲ Իմունահյուսվածքային կամ իմունաբջջային քիմիական մեթոդ՝ ԻՀՔՄ ԻՖ վերլուծության հոմոգենային մեթոդները Լյումինիսցենտ իմունային վերլուծություն՝ ԼԻՎ

4.3.6. 4.3.6.1. 4.3.6.2. 4.3.6.3. 4.3.7. 4.3.7.1. 4.3.7.2. 4.3.7.3. 4.3.7.4. 4.4. 4.4.1. 4.4.2. 4.4.2.1. 4.4.3. 4.4.4. 4.4.5. 4.4.6. 4.4.7. 4.4.7.1. 4.4.7.2. 4.4.7.3. 4.4.7.4. 4.4.7.5. 4.4.8. Գլուխ 5. 5.1. 5.1.1. 5.1.2. 5.1.3. 5.1.4. 5.1.5. 5.1.6. 5.1.7.

ԻՖՎ-ի արդյունքների դետեկցիա ԻՖՎ-ի որակական դետեկցիայի նշադիրները Կիսաքանակական դետեկցիայի հիմունքները ԻՖՎ-ի ավտոմատացումը և զարգացման հեռանկարները ԻՖՎ-ի կիրառման բնագավառները Բժշկագիտություն և անասնաբուժություն Գյուղատնտեսություն Արդյունաբերական կենսատեխնոլոգիա ԻՖՎ-ի թերությունները և առավելությունները Սպիտակուցների իմունաբանական վերլուծության նոր տեխնոլոգիաներ Մոլեկուլային գաղութների հիբրիդացման մեթոդ՝ թվային ԻՖՎ Իմունային ՊՇՌ՝ ԻՊՇՌ Իմունասենսորներ՝ ԻՍ Պլազմիդների օգտագործումը ԻՊՇՌ հետազոտություններում ԻմունոՊՇՌ-ի մեթոդ՝ biobarcode assay ուռուցքնեերի շիճուկային սպիտակուցների ախտորոշման համար Էլեկտրաքիմիական վերլուծություն Մուլտիպլեքսային ԻՖՎ՝ multiplex assay Մոլեկուլային-կենսաբանական մեթոդ. ֆագային իմունահամալիրային վերլուծություն (PHAIA) Թելիկային բակտերիոֆագերից ձևավորվող վեկտորների տեսակները Ֆագային դիսպլեյի հիմնական փուլերը Թելիկային ֆագերի դիսպլեյ մեթոդի խնդիրները և նվաճումները Ֆագային ռեկոմբինանտ ՀՄ-ների օգտագործման եղանակները և բնագավառները Թելիկային բակտերիոֆագերի դիսպլեյի մեթոդի առավելությունները և օգտագործման բնագավառները Քրոմատինի համաիմունոպրեցիպիտացիա (ChIP) ՀԻԲՐԻԴԱՑՈՒՄ in situ (FISH) FISH մեթոդի բնութագիրը Ֆլուորոֆոր նյութերը և դրանց օգտագործման եղանակները FISH հետազոտություններում օգտագործվող զոնդերը Զոնդերի ստացում միկրոդիսսեկցիայի մեթոդով FISH հետազոտության նախապատրաստման աշխատանքները FISH մեթոդի կատարման փուլերը FISH մեթոդի արդյունքների դետեկցիա Ֆլուորեսցենտ մանրադիտակի կազմությունը և կիրառման բնագավառները

5.2. 5.2.1. 5.2.2. 5.2.3. 5.2.4. 5.2.5. 5.3. 5.3.1. 5.3.2. 5.4. 5.4.1. 5.4.2. 5.4.3. 5.4.4. 5.4.5. 5.4.6. 5.5. 5.6. Գլուխ 6. 6.1. 6.2. 6.2.1. 6.3. 6.4. 6.5. 6.6.

6.7. 6.7.1. 6.8. 6.9.

Ֆլուորեսցենտ IN SITU FISH հիբրիդացման մոլեկուլացիտոգենետիկական մեթոդ Հետազոտության համար անհրաժեշտ սարքերի, ամանեղենի և նյութերի ցանկ Աշխատանքի կատարման տեխնոլոգիան FISH ֆլուորեսցենտ հետազոտության համար ցիտոգենետիկական պատրաստուկների պատրաստում FISH ռեակցիայի գործընթացը FISH ցիտոգենետիկական վերլուծությունը և ստացված արդյունքների մեկնաբանությունը FISH մեթոդի Ժամանակակից տարատեսակները Բազմագույն FISH՝ M-FISH Կեղծ գունային բազմագունություն 24-գույնանի FISH (multicolor FISH) մեթոդ RxFISH մեթոդ Բազմագույն FISH օղակակապ (MuliColor Banding - MCB) Սպեկտրալ կարիոտիպավորում (Spectral Karyotyping SKY) Համեմատական գենոմային հիբրիդացում՝ ՀԳՀ (Comparative Genomic Hybridization, CGH) Միկրոմատրիցային համեմատական գենոմային հիբրիդացում (array Comparative Genomic Hybridization, aCGH) Սինտենիա FISH մեթոդի բարելավման և զարգացման ուղիները FISH մեթոդի առավելությունները և կիրառման բնագավառները

ՍԵԿՎԵՆԱՑՈՒՄ

Մակսամ-Հիլբերտի քիմիական քայքայման մեթոդ Սենգերի դիդեզօքսինուկլեոտիդային մեթոդ Ավտոմատացված ԴՆԹ-սեկվենացում՝ Automated DNA Sequencing Բարձրարտադրողական սեկվենացում (New Generation Sequencing, NGS) Հիբրիդացում պինդ մակերեսի վրա՝ ԴՆԹ-ի շղթաների կոմպլեմենտարության սկզբունքը Սեկվենացում լիգավորման եղանակով Սեկվենացում մոլեկուլային կլաստերների վրա ֆլուորեսցենտ նշված նուկլեոտիդային նախորդների կիրառմամբ. Illumina/Solexa մեթոդ Պիրոսեկվենացում Պիրոսեկվենացում էմուլսիոն ՊՇՌ-ի օգտագործման եղանակով Կիսահաղորդչային սեկվենացում (Semiconductor Sequencing) Սեկվենացման երրորդ սերնդի համակարգեր (NNGS)

6.9.1. 6.9.2.

Մեկ մոլեկուլի սեկվենացման մեթոդ Մեկական ԴՆԹ մոլեկուլների սեկվենացում ռեալ թայմ մեթոդով՝ (Single molecule real time sequencing, SMRT) 6.10. Գենոմի նուկլեոտիդային հերթականության ընթերցման մեթոդները 6.10.1. Գենոմների ամբողջական հերթականության կառուցման գործընթացի փուլերը 6.11. Գենոմի քարտեզավորում 6.12. Սեկվենացման նոր սերնդի տեխնոլոգիաների օգտագործման բնագավառները Գրականություն Բովանդակություն

Լյուդմիլա Մհերի Մելքոնյան, Իռենա Ռոբերտի Մովսիսյան, Մարինե Վազգենի Վարդանյան

ՆՈՒԿԼԵԻՆԱԹԹՈՒՆԵՐԻ ՀԵՏԱԶՈՏՄԱՆ ՄԵԹՈԴՆԵՐԸ

ԵՎ ՏԵԽՆՈԼՈԳԻԱՆԵՐԸ

Ուսումնական ձեռնարկ Երևան 2024

Людмила Мгеровна Мелконян, Ирена Робертовна Мовсисян, Марине Вазгеновна Варданян

МЕТОДЫ И ТЕХНОЛОГИИ ИССЛЕДОВАНИЯ

НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Учебное пособие Ереван 2024

I58N 978-9939-77-186-1

յLյՊ